• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    一種可快速感受機(jī)械力的傳感器細(xì)胞的理論設(shè)計(jì)方案

    2015-10-19 12:33:58張英昊
    科技視界 2015年29期
    關(guān)鍵詞:傳感器細(xì)胞

    張英昊

    【摘 要】本文利用了兩類可對(duì)細(xì)胞所受機(jī)械力進(jìn)行響應(yīng)并介導(dǎo)鈣離子從細(xì)胞外流入胞質(zhì)的鈣離子通道,從理論上設(shè)計(jì)一種可響應(yīng)所受機(jī)械力并迅速將機(jī)械力轉(zhuǎn)換成適當(dāng)頻率和強(qiáng)度的熒光信號(hào)的傳感器細(xì)胞?;诖朔N理論基礎(chǔ),研究了胞質(zhì)鈣離子異常升高誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的兩條信號(hào)通路??梢郧玫突蚯贸}凋亡途徑中的相關(guān)分子,抑制機(jī)械力刺激產(chǎn)生的鈣離子內(nèi)流誘發(fā)的凋亡作用,從而可以使傳感器細(xì)胞穩(wěn)定傳代。

    【關(guān)鍵詞】機(jī)械力;傳感器;細(xì)胞;融合蛋白

    生物發(fā)酵工程中最常用的工程細(xì)胞是各種細(xì)菌,放線菌,真菌,酵母等微生物。但是生產(chǎn)一些具有較多轉(zhuǎn)錄后修飾的代謝物質(zhì),如干擾素,各種細(xì)胞因子,糖蛋白,激素等,則不能使用微生物,因?yàn)槲⑸锶狈ο嚓P(guān)的修飾功能,生產(chǎn)出的物質(zhì)往往沒(méi)有活性。因此必須使用動(dòng)物細(xì)胞。而動(dòng)物細(xì)胞由于對(duì)環(huán)境比較敏感,比較難在大型生物反應(yīng)器中培養(yǎng)。而難以在反應(yīng)器中培養(yǎng)的一個(gè)原因是缺乏能直接反映細(xì)胞生理狀態(tài)的參數(shù)的檢測(cè)。眾所周知,生物反應(yīng)器的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)參數(shù)是溫度,ph,融氧,以及攪拌器轉(zhuǎn)速。但是以這些有限的物理、化學(xué)參數(shù)來(lái)對(duì)應(yīng)于細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜而眾多的生理狀態(tài),顯然是無(wú)法精確反應(yīng)實(shí)際情況的,尤其是對(duì)環(huán)境比較敏感的動(dòng)物細(xì)胞,往往是當(dāng)細(xì)胞中眾多的實(shí)際生理狀態(tài)已經(jīng)發(fā)生了劇烈變化,使細(xì)胞生長(zhǎng)不佳甚至大量死亡后,上述的物理,化學(xué)參數(shù)才會(huì)有變化。因此,發(fā)酵中僅靠參數(shù)本身往往不能精確判斷發(fā)酵狀態(tài),而是要依賴于操作者的經(jīng)驗(yàn)。

    為了能夠解決這個(gè)問(wèn)題,筆者考慮設(shè)計(jì)一種起傳感器作用的細(xì)胞,它與用于合成代謝物質(zhì)的細(xì)胞一同在生物反應(yīng)器中培養(yǎng),享受相同的環(huán)境。但是這種傳感器細(xì)胞是經(jīng)過(guò)改造的,它們能夠?qū)⒂捎谕饨绛h(huán)境變化而導(dǎo)致自身內(nèi)部發(fā)生改變的生理信號(hào),直接轉(zhuǎn)化成可被檢測(cè)裝置感受的特定的物理或化學(xué)信號(hào),為生物反應(yīng)器上相應(yīng)的控制軟件提供精確信息,從而對(duì)影響細(xì)胞生理狀態(tài)的微環(huán)境進(jìn)行精確檢測(cè),并利用即時(shí)的反饋調(diào)節(jié)對(duì)生物反應(yīng)器參數(shù)進(jìn)行精確控制。

    而本論文研究的是機(jī)械力對(duì)動(dòng)物細(xì)胞的影響。由于動(dòng)物細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞壁,對(duì)機(jī)械力是非常敏感的。然而動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)及代謝物的合成都依賴氧氣,在生物反應(yīng)器中為了實(shí)現(xiàn)供氧,必須依賴于培養(yǎng)基的不斷流動(dòng),翻滾,攪拌,這往往會(huì)產(chǎn)生變化劇烈的剪切力,損害細(xì)胞。因此,供氧和對(duì)剪切力的控制是一對(duì)矛盾體,必須平衡考慮。如果能培養(yǎng)出一種能感受所受機(jī)械力以及機(jī)械力對(duì)自身生理狀態(tài)的影響,并迅速將其轉(zhuǎn)變成特定頻率的光信號(hào)的傳感器細(xì)胞,必然對(duì)供氧和受力的控制這一過(guò)程提供很大幫助。

    綜上所述,本論文根據(jù)已有的研究?jī)?nèi)容,從理論上設(shè)計(jì)一種滿足如上要求的,可感受機(jī)械力的傳感器細(xì)胞,并提出每一步驟中筆者能想到的可能的處理方法。

    1 鈣離子通道感受機(jī)械力的機(jī)制研究

    哺乳動(dòng)物體內(nèi)在生理?xiàng)l件下有很多種感受機(jī)械力的途徑,典型如細(xì)胞粘附與胞外基質(zhì),其粘附產(chǎn)生的力調(diào)控細(xì)胞的分化與凋亡;血管內(nèi)皮細(xì)胞與胞外基質(zhì)粘附,當(dāng)血液流速過(guò)快或血管腔過(guò)窄時(shí)(即高血壓狀態(tài)),內(nèi)皮細(xì)胞可感受力的狀態(tài),從而促使合成舒張血管的NO前列腺素等物質(zhì)[1]。經(jīng)過(guò)大量研究,人們公認(rèn)這些能感受機(jī)械力的細(xì)胞表面有能夠介導(dǎo)胞外鈣離子內(nèi)流的trp家族離子通道,這些鈣離子通道介導(dǎo)了機(jī)械刺激時(shí)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子的升高。但是,需要進(jìn)一步研究trp家族感受機(jī)械力的具體機(jī)制。

    研究表明,用含有RGD的磁珠處理細(xì)胞,再加磁場(chǎng),使磁力作用于整合素上,發(fā)現(xiàn)力作用于整合素上時(shí)細(xì)胞膜顯示出了很大的剛性,即抵抗形變,同時(shí)細(xì)胞核的形狀發(fā)生了改變;相對(duì)的,用磁珠偶聯(lián)抗原肽,再加磁場(chǎng),使力作用于MHC時(shí),細(xì)胞膜顯示出了柔性,而且細(xì)胞核的形狀未發(fā)生改變。他們認(rèn)為機(jī)械力通過(guò)整合素,傳給了在胞內(nèi)與整合素相連的細(xì)胞骨架,再由細(xì)胞骨架傳遞給細(xì)胞核,從而引起細(xì)胞核形狀變化以及調(diào)控基因的表達(dá)。而MHC由于沒(méi)有與細(xì)胞骨架相連,故受力時(shí)細(xì)胞膜顯示出了柔性。同時(shí),機(jī)械力刺激胞外基質(zhì)ECM,產(chǎn)生與直接力刺激整合素相同的效果。這些研究闡明了機(jī)械力傳導(dǎo)的一種基本模式,即:

    機(jī)械力刺激——ECM——整合素——細(xì)胞骨架——調(diào)控生理狀態(tài)

    另外一些研究顯示,用機(jī)械力刺激間充質(zhì)干細(xì)胞(刺激方式為使用光鑷為偶聯(lián)在整合素上的小珠施加力),會(huì)引起細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子的明顯升高。胞質(zhì)升高的鈣離子有兩個(gè)來(lái)源,一個(gè)是從胞外流入的,一個(gè)是從胞內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)流出而進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的(在胞外無(wú)鈣的環(huán)境中,向細(xì)胞處理內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的鈣離子通道抑制劑,發(fā)現(xiàn)對(duì)機(jī)械力刺激不會(huì)引起胞質(zhì)鈣離子上升)。該研究組發(fā)現(xiàn)位于細(xì)胞膜上的介導(dǎo)胞外鈣離子流入胞質(zhì)的是trp家族離子通道trpm7。他們研究了細(xì)胞骨架扮演的作用:在無(wú)IP3時(shí),在胞外無(wú)鈣環(huán)境中,用細(xì)胞骨架解聚劑處理,發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無(wú)法釋放鈣離子到胞質(zhì);而抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣通道,在胞外有鈣環(huán)境中,解聚細(xì)胞骨架,發(fā)現(xiàn)胞外鈣離子也無(wú)法流入。這些研究說(shuō)明了trpm7和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的IP3receptor鈣通道對(duì)機(jī)械力的響應(yīng)機(jī)制正式通過(guò)整合素和細(xì)胞骨架作用的。事實(shí)上,另有文獻(xiàn)表明IP3r是直接與細(xì)胞骨架相連的。他們研究了trpm7和IP3r響應(yīng)機(jī)械刺激所需的時(shí)間:在機(jī)械刺激細(xì)胞上的整合素后,胞外鈣離子流入胞內(nèi)的平均時(shí)間是機(jī)械刺激后20秒,而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放鈣離子的平均時(shí)間是機(jī)械刺激后100秒。對(duì)于這一反應(yīng)時(shí)間的差異,該研究小組認(rèn)為是機(jī)械力沿著細(xì)胞骨架向細(xì)胞深處的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)傳遞時(shí),細(xì)胞骨架要通過(guò)一些方式重構(gòu)來(lái)積累足夠強(qiáng)度的力學(xué)信號(hào),這導(dǎo)致了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣離子延遲釋放。

    綜上,細(xì)胞對(duì)機(jī)械力的感受可分為ECM整合素、細(xì)胞骨架依賴性的胞質(zhì)鈣離子上升和非依賴型的胞質(zhì)鈣離子上升。ECM依賴性的機(jī)械力傳導(dǎo)機(jī)制可制作傳感器細(xì)胞用于對(duì)錨定依賴性細(xì)胞的培養(yǎng),如作為血管內(nèi)皮細(xì)胞生產(chǎn)前列腺素這一生產(chǎn)體系的傳感器細(xì)胞,大致的策略就是適當(dāng)調(diào)整整合素和胞外基質(zhì)和trpm7離子通道的表達(dá)量,實(shí)現(xiàn)鈣離子濃度對(duì)機(jī)械力刺激的最佳響應(yīng)。不過(guò)由于胞內(nèi)鈣離子的上升分別來(lái)自胞外和內(nèi)質(zhì)網(wǎng),而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放鈣離子,響應(yīng)速度較慢且與細(xì)胞膜流入鈣離子的響應(yīng)時(shí)間差距較大(一個(gè)100秒一個(gè)20秒),所以從鈣離子信號(hào)即時(shí)性和整齊性的角度考慮,可以敲除或下調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的IP3r鈣離子通道。而ECM非依賴性的Yvc1p鈣離子通道,可用于可懸浮培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞的生產(chǎn)體系,比如培養(yǎng)巨噬細(xì)胞生產(chǎn)干擾素以及白介素等細(xì)胞因子。

    2 由胞質(zhì)鈣離子變化的生理信號(hào)向可檢測(cè)的光學(xué)信號(hào)的轉(zhuǎn)化

    生物體中可檢測(cè)的光學(xué)信號(hào)最容易想到的就是熒光蛋白。比較容易想到的一類生理狀態(tài)轉(zhuǎn)化為光學(xué)信號(hào)的方式是通過(guò)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程調(diào)控?zé)晒獾鞍椎谋磉_(dá)量的變化,從而改變亮度。這些調(diào)控轉(zhuǎn)錄的途徑研究成果非常多,比如camp-creb途徑、CaM CaN NFAT途徑、Nf-kapa b途徑等等。但是改變熒光蛋白的表達(dá)量必須走轉(zhuǎn)錄翻譯過(guò)程,而這個(gè)過(guò)程無(wú)疑是很耗費(fèi)時(shí)間的,通常情況下,在多種信號(hào)通路中,適當(dāng)?shù)男盘?hào)刺激引起的某種分子的表達(dá)量的變化,至少也要五到六個(gè)小時(shí)才會(huì)有明顯差異。因此基因表達(dá)量調(diào)控的方式雖然適合開(kāi)發(fā)藥物,但是與細(xì)胞傳感器即時(shí)性的要求是不符合的。故鈣離子向光信號(hào)轉(zhuǎn)化,只能依賴化學(xué)反應(yīng)。

    鈣離子成像,最常用的是一種叫fura-am的染料,該染料是脂溶性的,能透過(guò)細(xì)胞膜,然后被酯酶分解形成不透膜的fura留于胞內(nèi),與鈣離子定量結(jié)合,發(fā)射熒光。但是這種染料必須人為加入細(xì)胞,而無(wú)法讓細(xì)胞自己產(chǎn)生。而在實(shí)際的生產(chǎn)系統(tǒng)中是不可能嚴(yán)格區(qū)分生產(chǎn)細(xì)胞和傳感細(xì)胞的,若統(tǒng)一加入染料,由生產(chǎn)細(xì)胞產(chǎn)生的胞內(nèi)鈣熒光,可以想象,會(huì)是一種強(qiáng)烈的背景干擾。因此,最好還是只對(duì)傳感細(xì)胞進(jìn)行改造。

    根據(jù)前人的研究結(jié)果,可以使用一種融合的熒光蛋白。該熒光蛋白利用了熒光共振轉(zhuǎn)移(FRET)原理。事先已大量表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中,在為結(jié)合與結(jié)合鈣離子時(shí)會(huì)擁有不同的構(gòu)象,在未結(jié)合鈣離子時(shí)發(fā)青光,結(jié)合時(shí)發(fā)紅光。根據(jù)這兩種頻率光的強(qiáng)度的比值,可以精確探測(cè)出胞內(nèi)鈣離子的濃度。而且這種探測(cè)是幾乎即時(shí)的,因?yàn)椴簧婕稗D(zhuǎn)錄翻譯,僅僅是由于鈣離子出現(xiàn)導(dǎo)致的構(gòu)象變化。

    3 排除胞質(zhì)鈣離子濃度上升介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響

    細(xì)胞凋亡是一種相對(duì)比較溫和的過(guò)程,不發(fā)生炎癥反應(yīng)[2]。細(xì)胞凋亡上游的影響因素很多,涉及多種不同的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。但它們有共同的下游途徑,即激活bax/bak蛋白二聚化,定位于線粒體膜,使線粒體膜通透性喪失,內(nèi)容物流出;然后凋亡又分為caspase 依賴和非依賴途徑,其中依賴途徑研究較清楚,即線粒體釋放的細(xì)胞色素c和apaf-1,與胞質(zhì)中caspase9,形成復(fù)合體,并激活caspase3,誘導(dǎo)凋亡。而非凋亡途徑則由線粒體釋放的凋亡誘導(dǎo)因子(aif)引發(fā),具體機(jī)制尚不清楚。凋亡的最終途徑是染色體斷裂成小碎片,與細(xì)胞器聚集在一起后,被表達(dá)有磷脂酰絲氨酸作吞噬信號(hào)的質(zhì)膜包裹成小球,被臨近細(xì)胞識(shí)別吞噬。由于細(xì)胞凋亡總伴隨著凋亡小體形成,因此可以用TUNNEL實(shí)驗(yàn),來(lái)定量化反應(yīng)細(xì)胞凋亡程度,這也是下面的文獻(xiàn)中的凋亡程度的評(píng)價(jià)方法。

    而根據(jù)已有的研究[3],胞質(zhì)鈣離子的異常升高,是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要因素。而我們的傳感器細(xì)胞感受機(jī)械力的原理就是胞質(zhì)鈣離子升高,因此必須對(duì)細(xì)胞感受鈣離子的凋亡通路進(jìn)行研究,并削弱這一通路。在正常細(xì)胞中,由腫瘤壞死因子結(jié)合死亡受體,激活caspas8,從而切割bid為t-bid(truncated bid),t-bid與線粒體上的bak/bax結(jié)合,在線粒體上形成孔道,促使線粒體內(nèi)容物釋放誘發(fā)凋亡。而在胞質(zhì)鈣離子升高時(shí),鈣離子會(huì)激活鈣蛋白酶calpain,calpain可在bid的gly70和arg71之間切割形成t-bid(這里使用了gst-pull down方法,分離切割后的片段,在進(jìn)行末端測(cè)序得到切割位點(diǎn)),進(jìn)而促使細(xì)胞凋亡。

    而另一條鈣離子介導(dǎo)的凋亡通路也被發(fā)現(xiàn),即正常時(shí)磷酸化的Bad蛋白與14-3-3蛋白結(jié)合維持細(xì)胞存活狀態(tài),這種bad的磷酸化是由多種上游信號(hào)通路介導(dǎo)的其中的兩個(gè)例子是mapk家族的mekk和蛋白激酶B(即akt)[4];鈣離子激活鈣調(diào)蛋白磷酸酶(CaN),使其去磷酸化,與14-3-3蛋白解離;解離后Bad與Bcl2-bak復(fù)合體作用,置換出游離的bak;游離的bak二聚化,暴露bak的N末端(該末端可作為抗原表位,能夠以熒光抗體的方法衡量bak的促凋亡活化程度),然后插入線粒體膜,形成孔道釋放內(nèi)容物,誘發(fā)凋亡。用calpain的抑制劑處理細(xì)胞,在測(cè)量二聚化的bax的量,發(fā)現(xiàn)bax的表達(dá)量不受影響,這進(jìn)一步證實(shí)了鈣離子引發(fā)的bid被切割誘發(fā)凋亡和bad被磷酸化誘導(dǎo)的凋亡分屬兩條不同的途徑。然而,后來(lái)又有研究表明,在缺失bak/bax,只有t-bid的存在不會(huì)使線粒體通透性喪失,而只有bak/bax沒(méi)有t-bid時(shí)bax能轉(zhuǎn)位與線粒體但沒(méi)有通透線粒體的作用,推測(cè)與bax同源的bak也有相同的效果。因此t-bid是bax/bak促凋亡的激活劑[4]。4 結(jié)論

    根據(jù)上述文獻(xiàn)的結(jié)果進(jìn)行歸納總結(jié),可得出鈣離子介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的通路如圖1:

    因此,如果要制作傳感器細(xì)胞,可以考慮敲除bid 敲除bax/bak calpain CaN,或者可以用低效率的啟動(dòng)子下調(diào)這些基因的表達(dá)。

    如上便是可感受機(jī)械力的傳感器細(xì)胞的簡(jiǎn)要設(shè)計(jì)方案。

    相信隨著生物產(chǎn)業(yè)的發(fā)展以及對(duì)生物發(fā)酵產(chǎn)品的品質(zhì)要求不斷提高,適應(yīng)于動(dòng)物細(xì)胞發(fā)酵條件的精確控制的傳感器細(xì)胞會(huì)大有用武之地。在必要的時(shí)候,可以考慮引入一些特定的支架分子,它們能夠?qū)⒓?xì)胞感受缺氧和營(yíng)養(yǎng)缺乏的上游信號(hào),不通過(guò)經(jīng)典的調(diào)控轉(zhuǎn)錄翻譯途徑,而是將其引向一種人為設(shè)計(jì)的或者與經(jīng)典途徑不相干的,可快速反應(yīng)的新途徑,即對(duì)細(xì)胞進(jìn)行信號(hào)通路的嫁接和改造。當(dāng)然,研發(fā)能夠快速感應(yīng)生理信號(hào)并將其轉(zhuǎn)變?yōu)樘囟蓹z測(cè)的物理化學(xué)信號(hào)的生物傳感分子(比如本文中使用的熒光探針)也是必不可少的。

    【參考文獻(xiàn)】

    [1]范一菲,孔德虎,等.血管內(nèi)皮依賴性超極化因子的研究進(jìn)展[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué),2006(10).

    [2]翟中和,王喜忠,丁明孝.細(xì)胞生物學(xué)[M].高等教育出版社,2011.

    [3]Colleen Tagliarino,John J,Pink.Caicium is a key signal molecule in β-lapachone-mediated cell deat[J].

    [4]白莉,曹傳平,張映輝,毛高平.促凋亡蛋Bid誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡機(jī)制[J].中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào),2004.

    [責(zé)任編輯:侯天宇]

    猜你喜歡
    傳感器細(xì)胞
    康奈爾大學(xué)制造出可拉伸傳感器
    DANDY CELLS潮細(xì)胞
    睿士(2021年5期)2021-05-20 19:13:08
    走近細(xì)胞——組成細(xì)胞的分子
    潮細(xì)胞
    睿士(2020年5期)2020-05-21 09:56:35
    細(xì)胞知道你缺氧了
    簡(jiǎn)述傳感器在物聯(lián)網(wǎng)中的應(yīng)用
    電子制作(2019年22期)2020-01-14 03:16:52
    Dandy Cells潮細(xì)胞 Finding a home
    睿士(2019年9期)2019-09-10 21:54:27
    “傳感器新聞”會(huì)帶來(lái)什么
    跟蹤導(dǎo)練(三)2
    光電傳感器在自動(dòng)檢測(cè)和分揀中的應(yīng)用
    電子制作(2018年9期)2018-08-04 03:30:58
    人妻夜夜爽99麻豆av| 少妇高潮的动态图| .国产精品久久| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 精品久久久久久电影网| 成人国产av品久久久| 韩国高清视频一区二区三区| 日韩成人伦理影院| 91国产中文字幕| 观看av在线不卡| 成人影院久久| 天堂俺去俺来也www色官网| 一级毛片aaaaaa免费看小| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 最新的欧美精品一区二区| 日韩中字成人| 久久 成人 亚洲| 婷婷色av中文字幕| 岛国毛片在线播放| 精品国产一区二区久久| 国产成人91sexporn| 中国国产av一级| 精品人妻熟女av久视频| 日韩在线高清观看一区二区三区| 国产黄色免费在线视频| 国产成人av激情在线播放 | 国产免费福利视频在线观看| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 精品久久久精品久久久| 久久狼人影院| 亚洲av国产av综合av卡| 国产精品女同一区二区软件| 亚洲精品国产av成人精品| 99久久人妻综合| 国产在线免费精品| 日韩制服骚丝袜av| 国产亚洲精品久久久com| 久久久久久久久久久丰满| 大香蕉久久网| 国产伦精品一区二区三区视频9| 久久青草综合色| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 国产精品不卡视频一区二区| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 免费av中文字幕在线| 在线 av 中文字幕| 免费看不卡的av| 一级,二级,三级黄色视频| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 国产综合精华液| 99久久综合免费| 美女cb高潮喷水在线观看| 在线免费观看不下载黄p国产| 晚上一个人看的免费电影| 亚洲久久久国产精品| av在线观看视频网站免费| 国产亚洲最大av| 在现免费观看毛片| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 日韩精品免费视频一区二区三区 | 欧美日韩在线观看h| 丰满迷人的少妇在线观看| a级毛色黄片| 欧美激情 高清一区二区三区| 视频在线观看一区二区三区| 青青草视频在线视频观看| 国产69精品久久久久777片| 国产精品不卡视频一区二区| 波野结衣二区三区在线| 国产一区二区在线观看日韩| 观看美女的网站| 亚洲成人手机| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 欧美日韩综合久久久久久| 精品久久久久久电影网| 久久久久网色| 热99久久久久精品小说推荐| 欧美bdsm另类| 一本大道久久a久久精品| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 国产精品久久久久久久电影| 欧美国产精品一级二级三级| 妹子高潮喷水视频| 欧美最新免费一区二区三区| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 美女cb高潮喷水在线观看| 国产日韩欧美在线精品| freevideosex欧美| 久久97久久精品| 99久久人妻综合| 九九在线视频观看精品| 国产伦精品一区二区三区视频9| 久久久久久久精品精品| 午夜福利视频精品| 免费黄色在线免费观看| 久久精品久久久久久久性| 久久精品国产亚洲av天美| 精品一区二区三卡| .国产精品久久| 免费观看a级毛片全部| 天堂8中文在线网| 99久国产av精品国产电影| 一级黄片播放器| www.色视频.com| 一边亲一边摸免费视频| 精品久久久精品久久久| 男人爽女人下面视频在线观看| 性色av一级| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 午夜福利网站1000一区二区三区| 精品久久久久久久久亚洲| 国产熟女午夜一区二区三区 | 久热久热在线精品观看| 伊人久久国产一区二区| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 大香蕉久久成人网| 五月伊人婷婷丁香| 日韩成人av中文字幕在线观看| 国产精品国产三级国产专区5o| 纯流量卡能插随身wifi吗| 国产精品国产av在线观看| 22中文网久久字幕| 国产亚洲欧美精品永久| 国产老妇伦熟女老妇高清| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 久久久久久久久久成人| 美女大奶头黄色视频| 亚洲怡红院男人天堂| 一级片'在线观看视频| 欧美性感艳星| 啦啦啦啦在线视频资源| 精品一品国产午夜福利视频| 色94色欧美一区二区| 视频区图区小说| 精品卡一卡二卡四卡免费| 18禁动态无遮挡网站| av有码第一页| 日本色播在线视频| 91国产中文字幕| av福利片在线| 欧美精品国产亚洲| 校园人妻丝袜中文字幕| 在线 av 中文字幕| 国产爽快片一区二区三区| 亚洲人成网站在线观看播放| 欧美日韩综合久久久久久| 男人操女人黄网站| 97在线视频观看| 插阴视频在线观看视频| 妹子高潮喷水视频| 夜夜爽夜夜爽视频| av有码第一页| 中文欧美无线码| 欧美精品国产亚洲| 99久久综合免费| 亚洲国产精品国产精品| 久久久亚洲精品成人影院| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 99热这里只有精品一区| a级毛片在线看网站| 日本av手机在线免费观看| 亚洲av在线观看美女高潮| 三级国产精品欧美在线观看| 校园人妻丝袜中文字幕| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 亚洲国产精品专区欧美| 国产 精品1| 亚洲久久久国产精品| 久久久久久伊人网av| 人妻人人澡人人爽人人| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 97超视频在线观看视频| 国产精品久久久久久久久免| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 热re99久久国产66热| 国产免费又黄又爽又色| 3wmmmm亚洲av在线观看| 水蜜桃什么品种好| 精品国产露脸久久av麻豆| 国产精品三级大全| 乱人伦中国视频| 国产精品 国内视频| 久久久久久久精品精品| 日本91视频免费播放| a级毛片在线看网站| 日日爽夜夜爽网站| 久久毛片免费看一区二区三区| 又大又黄又爽视频免费| 99热全是精品| 久久国产精品大桥未久av| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 亚洲av在线观看美女高潮| a级毛片在线看网站| 中文字幕av电影在线播放| 一级爰片在线观看| 黄片无遮挡物在线观看| 丝袜脚勾引网站| 欧美激情极品国产一区二区三区 | a级毛片黄视频| 亚洲精品美女久久av网站| 国产精品人妻久久久影院| 久久久精品区二区三区| 久久99一区二区三区| 视频中文字幕在线观看| 成年女人在线观看亚洲视频| 国产国语露脸激情在线看| 午夜激情av网站| 亚洲中文av在线| 高清av免费在线| 纯流量卡能插随身wifi吗| 欧美精品一区二区大全| 美女内射精品一级片tv| 蜜桃在线观看..| 亚洲伊人久久精品综合| 国产乱来视频区| 老司机影院毛片| 亚洲精品国产色婷婷电影| 18禁观看日本| 亚洲美女黄色视频免费看| 高清欧美精品videossex| 国产成人一区二区在线| 国产男女内射视频| 国产日韩欧美亚洲二区| 99热国产这里只有精品6| 欧美日韩av久久| videosex国产| 激情五月婷婷亚洲| 精品一区二区三卡| av免费在线看不卡| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 黄色怎么调成土黄色| 亚洲欧美色中文字幕在线| 男的添女的下面高潮视频| 一级a做视频免费观看| 国产综合精华液| 九色亚洲精品在线播放| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 国产淫语在线视频| 亚洲av欧美aⅴ国产| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 大香蕉97超碰在线| 亚洲国产精品国产精品| 欧美日韩综合久久久久久| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 国产乱人偷精品视频| 免费高清在线观看日韩| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 久久韩国三级中文字幕| 99热这里只有精品一区| 国产成人精品在线电影| 人人妻人人澡人人看| 美女福利国产在线| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 看十八女毛片水多多多| 我的女老师完整版在线观看| 热99国产精品久久久久久7| 十八禁网站网址无遮挡| av一本久久久久| 久久久a久久爽久久v久久| 日本午夜av视频| 51国产日韩欧美| 99视频精品全部免费 在线| 亚洲情色 制服丝袜| 亚洲av成人精品一区久久| 精品国产乱码久久久久久小说| 国产精品99久久99久久久不卡 | 国产 精品1| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 观看美女的网站| 日韩一区二区视频免费看| 久久久久久伊人网av| 欧美成人精品欧美一级黄| 男女边摸边吃奶| 一本久久精品| 日本黄色日本黄色录像| 久久综合国产亚洲精品| 亚洲三级黄色毛片| 亚洲av福利一区| 亚洲少妇的诱惑av| 日本wwww免费看| 欧美亚洲日本最大视频资源| 成人手机av| 亚洲欧美一区二区三区国产| 母亲3免费完整高清在线观看 | 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 久热久热在线精品观看| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕 | 中文字幕亚洲精品专区| 欧美日韩视频精品一区| 国产日韩欧美视频二区| 22中文网久久字幕| 人妻少妇偷人精品九色| 人成视频在线观看免费观看| 99久久精品国产国产毛片| 成人免费观看视频高清| av国产精品久久久久影院| 97超碰精品成人国产| xxx大片免费视频| 久久久久久久久久久丰满| 观看av在线不卡| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 高清黄色对白视频在线免费看| 大片免费播放器 马上看| 99国产精品免费福利视频| 精品一区在线观看国产| 国产又色又爽无遮挡免| 国产精品免费大片| 日韩一区二区视频免费看| 国产一区亚洲一区在线观看| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 日韩中文字幕视频在线看片| 国产高清三级在线| 桃花免费在线播放| 91成人精品电影| 国产极品粉嫩免费观看在线 | av网站免费在线观看视频| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 精品久久久久久电影网| 伊人久久国产一区二区| 99热网站在线观看| 国产永久视频网站| 亚洲精品国产av成人精品| 国产免费现黄频在线看| 日日爽夜夜爽网站| 成人免费观看视频高清| 丝袜美足系列| 欧美日韩综合久久久久久| 午夜福利视频精品| 成人亚洲精品一区在线观看| 亚洲高清免费不卡视频| 色网站视频免费| 99久久综合免费| 欧美日本中文国产一区发布| 日韩成人av中文字幕在线观看| 国产精品不卡视频一区二区| 国产精品女同一区二区软件| 91精品三级在线观看| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 国产成人午夜福利电影在线观看| 久久影院123| 成人午夜精彩视频在线观看| 日韩强制内射视频| 亚洲国产精品999| 国国产精品蜜臀av免费| 成人午夜精彩视频在线观看| 精品一区在线观看国产| 中国美白少妇内射xxxbb| 日韩强制内射视频| 麻豆成人av视频| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 赤兔流量卡办理| 免费av中文字幕在线| 日韩一区二区视频免费看| 2018国产大陆天天弄谢| 国产日韩欧美在线精品| 有码 亚洲区| 男人添女人高潮全过程视频| 亚洲内射少妇av| 青春草视频在线免费观看| 欧美精品国产亚洲| 久久久精品免费免费高清| √禁漫天堂资源中文www| 男人添女人高潮全过程视频| 欧美国产精品一级二级三级| 国产午夜精品一二区理论片| 18禁在线播放成人免费| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 午夜福利视频精品| 插逼视频在线观看| 色婷婷久久久亚洲欧美| 日韩一本色道免费dvd| 日韩 亚洲 欧美在线| av网站免费在线观看视频| 黄色视频在线播放观看不卡| 高清午夜精品一区二区三区| 日本爱情动作片www.在线观看| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 亚洲三级黄色毛片| 少妇丰满av| 午夜福利影视在线免费观看| 久久毛片免费看一区二区三区| 亚洲熟女精品中文字幕| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 国产又色又爽无遮挡免| 99热国产这里只有精品6| 高清欧美精品videossex| 欧美日本中文国产一区发布| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 久久人人爽人人片av| 黑丝袜美女国产一区| 国产亚洲最大av| 乱码一卡2卡4卡精品| 91aial.com中文字幕在线观看| 大香蕉97超碰在线| 国产在线视频一区二区| 少妇的逼好多水| 亚洲国产成人一精品久久久| 久久久亚洲精品成人影院| 嫩草影院入口| 亚洲久久久国产精品| 97在线视频观看| 蜜桃在线观看..| 青青草视频在线视频观看| 日本黄色日本黄色录像| 久久午夜福利片| 99精国产麻豆久久婷婷| 一本一本综合久久| 亚洲av国产av综合av卡| 欧美 日韩 精品 国产| 精品国产乱码久久久久久小说| 亚洲图色成人| 爱豆传媒免费全集在线观看| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 国产一区亚洲一区在线观看| 久久久精品免费免费高清| 搡老乐熟女国产| 国产精品99久久久久久久久| 毛片一级片免费看久久久久| 亚洲欧美精品自产自拍| 最近的中文字幕免费完整| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 999精品在线视频| av福利片在线| av在线老鸭窝| 免费av中文字幕在线| 尾随美女入室| 卡戴珊不雅视频在线播放| 老司机影院毛片| 成人无遮挡网站| 黄色一级大片看看| 国产精品欧美亚洲77777| av黄色大香蕉| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 少妇人妻精品综合一区二区| 色网站视频免费| 免费大片18禁| 两个人免费观看高清视频| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 久热久热在线精品观看| 亚洲精品视频女| 美女视频免费永久观看网站| 久久久午夜欧美精品| 国产精品一区www在线观看| 国产av精品麻豆| 国产成人a∨麻豆精品| 欧美日本中文国产一区发布| 久久ye,这里只有精品| 青春草视频在线免费观看| 久久久久久久久大av| 久久久久久久大尺度免费视频| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 黄色视频在线播放观看不卡| 永久网站在线| 能在线免费看毛片的网站| 亚洲中文av在线| 校园人妻丝袜中文字幕| 97超碰精品成人国产| 男女国产视频网站| 精品一品国产午夜福利视频| 日韩三级伦理在线观看| 新久久久久国产一级毛片| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 飞空精品影院首页| 国产精品成人在线| 亚洲精品第二区| 一级,二级,三级黄色视频| 国产 精品1| 永久免费av网站大全| av不卡在线播放| 伊人亚洲综合成人网| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 亚洲国产av新网站| 亚洲精品久久成人aⅴ小说 | 少妇的逼水好多| av国产精品久久久久影院| 国产有黄有色有爽视频| 在线免费观看不下载黄p国产| 婷婷色综合大香蕉| 午夜影院在线不卡| 久久久久人妻精品一区果冻| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 精品一区在线观看国产| av在线播放精品| 日韩欧美一区视频在线观看| 七月丁香在线播放| 97在线人人人人妻| 精品一区二区免费观看| 中文字幕制服av| 69精品国产乱码久久久| 特大巨黑吊av在线直播| 亚洲精品亚洲一区二区| av在线观看视频网站免费| a级毛片免费高清观看在线播放| 在线观看一区二区三区激情| 永久免费av网站大全| 亚洲av免费高清在线观看| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 精品国产国语对白av| 性高湖久久久久久久久免费观看| 国精品久久久久久国模美| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 精品少妇久久久久久888优播| 99re6热这里在线精品视频| 视频中文字幕在线观看| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 校园人妻丝袜中文字幕| 久久久久国产网址| 卡戴珊不雅视频在线播放| 国产精品一区二区在线观看99| 男人爽女人下面视频在线观看| 欧美日韩在线观看h| 丝袜喷水一区| 欧美性感艳星| 中文字幕人妻丝袜制服| 在线观看www视频免费| www.色视频.com| 青春草视频在线免费观看| 久久久久久久精品精品| 亚洲av日韩在线播放| 丝袜在线中文字幕| 国产男人的电影天堂91| 欧美激情国产日韩精品一区| 日本欧美国产在线视频| 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | 天天影视国产精品| 日本av手机在线免费观看| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 国产69精品久久久久777片| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 亚洲无线观看免费| 国产亚洲精品久久久com| 国产精品一国产av| 在线观看人妻少妇| 综合色丁香网| 高清黄色对白视频在线免费看| 丝袜在线中文字幕| 国产男女内射视频| 色94色欧美一区二区| 少妇 在线观看| 亚洲国产精品专区欧美| 中国美白少妇内射xxxbb| 一本久久精品| 欧美日韩视频精品一区| 男人添女人高潮全过程视频| 中文字幕av电影在线播放| 母亲3免费完整高清在线观看 | 性色avwww在线观看| 亚洲精品,欧美精品| tube8黄色片| 精品少妇久久久久久888优播| 在线看a的网站| 亚洲精品国产av蜜桃| 欧美国产精品一级二级三级| 亚洲成人av在线免费| 久久99热6这里只有精品| 亚洲精品乱久久久久久| 亚洲精品美女久久av网站| 欧美日韩av久久| 亚洲国产av影院在线观看| 亚洲欧美成人精品一区二区| 最后的刺客免费高清国语| 街头女战士在线观看网站| av在线老鸭窝| 亚洲色图综合在线观看| 日韩av不卡免费在线播放| 日日啪夜夜爽| 成人漫画全彩无遮挡| 永久网站在线| 99热这里只有精品一区| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 人人妻人人澡人人看| 久久毛片免费看一区二区三区| 亚洲综合精品二区| 免费观看a级毛片全部| 久久这里有精品视频免费| 亚洲高清免费不卡视频| av播播在线观看一区| 亚洲三级黄色毛片| 亚洲成人手机| 久久99蜜桃精品久久| 男人添女人高潮全过程视频| 丝袜美足系列| 欧美精品一区二区免费开放| 免费人成在线观看视频色| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 午夜影院在线不卡| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| freevideosex欧美| 国产日韩欧美在线精品| 久久韩国三级中文字幕| 一区二区三区精品91| 中文字幕久久专区| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 蜜臀久久99精品久久宅男| 精品久久久噜噜| 亚洲成人手机| 国产一区二区三区av在线| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 一区二区三区免费毛片| 成人手机av| 久热这里只有精品99| 午夜91福利影院| 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | 中文天堂在线官网| 十八禁高潮呻吟视频| 国产黄片视频在线免费观看| 久久久亚洲精品成人影院| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 在线观看免费高清a一片|