萵苣苷B對腦缺血大鼠小腦和延髓NT-3蛋白表達的影響

孫 娟，　詹合琴，　邵煥霞，　張海芳，　邵立偉

（1.新鄉(xiāng)醫(yī)學院護理學院，河南　新鄉(xiāng)　453003；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學院藥學院，河南　新鄉(xiāng)　453003）

萵苣苷B對腦缺血大鼠小腦和延髓NT-3蛋白表達的影響

孫 娟1，詹合琴2*，邵煥霞2，張海芳2，邵立偉2

（1.新鄉(xiāng)醫(yī)學院護理學院，河南新鄉(xiāng)453003；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學院藥學院，河南新鄉(xiāng)453003）

目的 探討萵苣苷B（1actuside B）對腦缺血大鼠小腦和延髓NT-3蛋白表達的影響。方法 采取阻塞大鼠大腦中動脈方法復制腦缺血再灌注損傷模型，并觀察萵苣苷B對腦缺血大鼠小腦和延髓組織NT-3陽性細胞數(shù)和NT-3蛋白表達的影響。結(jié)果 萵苣苷B（25mg/kg）能明顯降低大鼠的神經(jīng)行為學評分，能增加小腦和延髓NT-3神經(jīng)元數(shù)目和其蛋白的表達。結(jié)論 萵苣苷B在一定程度上對小腦和延髓組織內(nèi)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子NT-3具有上調(diào)作用，并能夠促進其蛋白的表達。

萵苣苷B；腦缺血；小腦；延髓；NT-3蛋白

隨著人口老齡化的出現(xiàn)和社會經(jīng)濟的發(fā)展，缺血性腦卒中已成為一種嚴重影響健康的疾?。?］，具有較高的致殘率和致死率［2］等危害性。由于腦缺血引起的再灌注損傷是一個復雜的病理生理過程［3］，因此對其的治療和預防一直是醫(yī)學界研究的焦點。目前對腦缺血治療來說，雖然主要采取藥物治療，但早期進行的溶栓治療時間窗太窄，在臨床上很難掌控［4］，相關(guān)研究表明，藥物治療主要傾向于對受損神經(jīng)細胞的保護［5］，促進受損神經(jīng)元的再生與修復，減輕再灌注損傷［6］。神經(jīng)營養(yǎng)因子與中樞神經(jīng)系統(tǒng)關(guān)系密切，具有促進神經(jīng)元生長發(fā)育、突觸可塑性、神經(jīng)傳遞及軸突生長作用。神經(jīng)營養(yǎng)因子3（neurotrophin-3，NT-3）是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的主要成員之一，在一定程度上能促進神經(jīng)干細胞的分化、神經(jīng)細胞的生長［7］和靶細胞的存活、生長發(fā)育。有國內(nèi)外學者研究資料表明，NT-3與缺血性腦損傷關(guān)系密切［8-9］。

萵苣苷B（Lactuside B），是從河南高翅果菊的地下部分中提取分離出來的一種單體化合物［10］，研究小組前期研究發(fā)現(xiàn)該單體化合物能增加Bc1-2/Bax mRNA比值［11］和縮小腦梗死體積，上調(diào)海馬和紋狀體NT-3 mRNA的表達，具有一定的抗腦缺血作用［12］。從而提示萵苣苷B可作為一種抗腦缺血的潛在藥物，值得進一步深入研究。本研究旨在從小腦、延髓的角度出發(fā)，探討萵苣苷B對小腦、延髓NT-3蛋白表達的影響，進一步探討萵苣苷B抗缺血性腦組織損傷作用的機制，為臨床實踐提供實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器 萵苣苷B為白色粉末狀，純度＞98%，批號xy1-002，由新鄉(xiāng)醫(yī)學院藥學院藥化教研室閆福林教授提供；尼莫地平注射液，山東方明藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，規(guī)格為20 mL∶4 mg，批號1103036；水合氯醛粉劑，天津市瑞金特化學品有限公司生產(chǎn)；PV-6001二步法檢測試劑盒和NT-3抗體購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。型號為TT22-HQP-101C的持續(xù)恒溫冰凍切片機；同濟醫(yī)學院清屏影像公司生產(chǎn)的HMIAS-2000高清晰度彩色醫(yī)學圖文分析系統(tǒng)。

1.2方法

1.2.1制備大鼠大腦中動脈缺血再灌注損傷模型 參照Longa線栓方法制備大鼠大腦中動脈缺血再灌注損傷模型［13］，將事先制備好的直徑為0.2 mm，型號為1.5號日本魚線的阻塞線從頸外動脈經(jīng)頸內(nèi)動脈（intema1 carotid artery，ICA）插入到大腦中動脈入口，阻塞線插入長度為2.0 cm，假手術(shù)組阻塞線插入頸內(nèi)動脈長度大約為0.5 cm，其余操作均與各組相同。所有實驗動物均阻塞2 h后，把阻塞線球端拉回頸外動脈內(nèi)進行再灌注，并放實驗動物回籠中密切觀察。

1.2.2實驗動物分組與給藥 實驗動物購自河南省實驗動物中心，采用健康清潔Ⅱ級雄性SD大鼠，體質(zhì)量范圍在280～320 g，動物合格證號為SYXK（豫）2005-0012。實驗過程對動物的處理符合中華人民共和國2006年科學技術(shù)部頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》。動物隨機被分為6組，分別為假手術(shù)組、模型組、陽性藥物對照組、劑量為12.5 mg/kg的萵苣苷B低劑量組、劑量為25 mg/kg的萵苣苷B中劑量組和劑量為50 mg/kg的高劑量組，每組6只。所有動物均于缺血2h再灌后開始給藥，1日2次給藥，給藥劑量均按5mL/kg腹腔注射給藥。假手術(shù)組和模型組分別給予等體積的蒸餾水，陽性對照組給予劑量為1 mg/kg尼莫地平注射液，萵苣苷B低、中、高組分別給予相應劑量的實驗藥物。每組動物均于再灌注24h后處死。

1.2.3免疫組化二步法染色 處死動物后，分別完整地取出大鼠延髓和小腦組織，同時分別將兩部位組織冠狀切成三部分，取中間一部分做連續(xù)冠狀冰凍切片，片厚度為5μm，每間隔5張取1張，每組每例取6張切片放置于-20℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。本實驗采用免疫組化二步法檢測NT-3免疫陽性反應物的表達。實驗切片室溫放置30min后，放入4℃丙酮固定10min；用3%H2O2孵育5min，滴加NT-3工作液（1∶200），4℃過夜；然后組織切片滴加生物素羊抗兔IgG和鏈霉親和素復合物（1∶200），37℃孵育30min；急用型DAB顯色劑顯色3min，切片脫水后用中性樹膠封片。每張切片隨機取上、中、下3個視野進行攝像并進行觀察。

1.2.4檢測項目

1.2.4.1神經(jīng)功能缺損評分 動物于處死前再進行一次神經(jīng)缺失癥狀評分，來驗證所選實驗藥物的抗腦缺血效果。實驗動物在手術(shù)清醒后依據(jù)Zea-1onga評分法［13］，進行神經(jīng)缺損癥狀評分。具體評分參考以下標準：無神經(jīng)損傷癥狀和體征為0分；提尾后左側(cè)肢體出現(xiàn)內(nèi)收、屈曲為1分；爬行時身體向左側(cè)劃圈即追尾現(xiàn)象為2分；站立時身體向左側(cè)傾斜為3分；意識喪失，無法自主行走為4分。選取評分在1～3分之間的動物進行實驗給藥。模型組中0分和4分的動物被剔除，不納入實驗中。

1.2.4.2NT-3蛋白表達檢測 在光學顯微鏡下，分別選擇大鼠小腦和延髓組織的陽性神經(jīng)元來進行觀察，NT-3陽性顆粒，顏色呈棕黃色或棕褐色，位置定位于細胞漿。每張切片隨機選取上、中、下、左、右5個視野，選取同濟醫(yī)學院清屏影像公司生產(chǎn)的HMIAS-2000高清晰度彩色醫(yī)學圖文分析系統(tǒng)攝像，分析染色陽性細胞數(shù)目和相對光密度值［14］。蛋白染色的強度用光密度值來表示，光密度值越大代表其蛋白含有量越高。計數(shù)NT-3的陽性細胞數(shù)。

2　結(jié)果

2.1大鼠大腦中動脈缺血再灌注模型制備成功的判定

手術(shù)實驗動物麻醉清醒后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組動物無神經(jīng)功能缺損癥狀，活動正常，其余3組模型組、陽性對照組和萵苣苷-B各劑量組大鼠均出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)缺損表現(xiàn)，比如爬行時向左側(cè)劃圈、提尾后左側(cè)前肢屈曲內(nèi)收、站立時向左側(cè)傾倒和意識喪失等，神經(jīng)行為學評分在1～4分之間，從而說明本實驗大腦中動脈缺血再灌注模型制備成功。

2.2萵苣苷B對大鼠腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)缺失癥狀評分的影響 大鼠腦缺血缺血再灌注24h后，模型組動物的神經(jīng)缺失癥狀評分均明顯增高，與假手術(shù)組比較有顯著性差異（P＜0.01），萵苣苷B低、中、高劑量組均可降低大鼠的神經(jīng)行為學評分，與模型組比較有顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01），其中劑量組作用較強，與陽性藥物對照組比較有顯著性差異（P＜0.05），見表1。

表1　萵苣苷B對缺血性腦損傷大鼠神經(jīng)缺損癥狀評分的影響（±s，n=6）

表1　萵苣苷B對缺血性腦損傷大鼠神經(jīng)缺損癥狀評分的影響（±s，n=6）

注：與假手術(shù)組比較，△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與陽性對照藥比較，#P＜0.05

組別劑量/（mg·kg-1）時間麻醉清醒后用藥24h假手術(shù)組-0.00±0.000.00±0.00模型組-3.25±0.46△3.38±0.52△陽性對照組12.88±0.352.25±0.46**萵苣苷B低劑量組12.53.00±0.531.88±0.35**萵苣苷B中劑量組253.13±0.351.38±0.52**#萵苣苷B高劑量組503.25±0.462.25±0.71*

2.3萵苣苷B對大鼠缺血性腦損傷小腦組織NT-3神經(jīng)元數(shù)目和其蛋白表達的影響 結(jié)果顯示與假手術(shù)組相比，模型組NT-3蛋白表達下降（P＜0.01）；萵苣苷-B低、中、高劑量組均能增加小腦NT-3神經(jīng)元數(shù)目和其蛋白的表達，與模型組比較有顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01），其中萵苣苷-B中劑量組作用較好，優(yōu)于陽性對照藥（P＜0.01）。見表2，圖1。

表2　萵苣苷B對缺血性腦損傷大鼠小腦NT-3數(shù)目和蛋白表達的影響（±s）

表2　萵苣苷B對缺血性腦損傷大鼠小腦NT-3數(shù)目和蛋白表達的影響（±s）

注：與假手術(shù)組相比，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與陽性對照組比較，ΔΔP＜0.01

組別劑量/（mg·kg-1）NT-3神經(jīng)元數(shù)目/個蛋白表達假手術(shù)組-15.46±6.000.11±0.050模型組-14.20±4.280.07±0.02**陽性對照組132.63±6.18##0.09±0.05##萵苣苷B低劑量組12.535.92±2.31##0.08±0.04#萵苣苷B中劑量組2544.83±4.63##ΔΔ0.10±0.04##ΔΔ萵苣苷B高劑量組5031.60±5.19##0.09±0.04##

2.4萵苣苷B對大鼠缺血性腦損傷延髓組織NT-3神經(jīng)元數(shù)目和其蛋白表達的影響 實驗顯示：（1）NT-3神經(jīng)元數(shù)目表達上：萵苣苷B低、中劑量組均能增加延髓NT-3陽性細胞數(shù)，與模型組比較有顯著性差異（P＜0.01），且優(yōu)于陽性對照藥（P＜0.01），其中LM組優(yōu)于低劑量組，兩者相比有顯著性差異（P＜0.01）。（2）NT-3蛋白表達：與假手術(shù)組相比，模型組NT-3蛋白表達下降（P＜0.01）；萵苣苷B低、中、高劑量組均能增加小腦NT-3蛋白的表達，與模型組比較有顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01），其中萵苣苷B中劑量組作用較好優(yōu)于陽性對照藥（P＜0.01）。見表3，圖2。

圖1　小腦組織NT-3免疫組化染色圖片（×400）

表3　萵苣苷B對缺血性腦損傷大鼠延髓NT-3數(shù)目和蛋白表達的影響（±s）

表3　萵苣苷B對缺血性腦損傷大鼠延髓NT-3數(shù)目和蛋白表達的影響（±s）

注：模型組NT-3蛋白表達下降，與假手術(shù)組相比有顯著性差異，aP＜0.01；各用藥組與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；萵苣苷B各劑量組與陽性對照組比較，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；萵苣苷B低劑量組與中劑量組相比，*P＜0.05，**P＜0.01

個蛋白表達假手術(shù)組組別劑量/（mg·kg-1）NT-3神經(jīng)元數(shù)目/ 50 33.20±5.43 0.07±0.04 -17.69±6.17 0.12±0.05模型組-15.60±4.50 0.08±0.04陽性對照組1 33.88±6.25*0.11±0.06##萵苣苷B低劑量組12.5 39.92±3.18*#0.09±0.04#ΔΔ萵苣苷B中劑量組25 46.67±4.78*#Δ0.13±0.04##Δ**萵苣苷B高劑量組

圖2　延髓組織NT-3免疫組化染色圖片（×400）

3　討論

腦缺血再灌注損傷是持續(xù)復雜的病理過程，一方面與腦缺血后產(chǎn)生的血管生成因子、內(nèi)源性神經(jīng)保護因子有關(guān)［15］，另一方面可能與神經(jīng)元損傷、自由基損傷、鈣離子內(nèi)流、代謝障礙等相關(guān)機制產(chǎn)生“級聯(lián)反應”的瀑布現(xiàn)象有關(guān)。NT-3是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的主要成員之一，它具有能夠維持運動神經(jīng)元、感覺神經(jīng)元和交感神經(jīng)元的功能及促進其存活的作用［16］。有相關(guān)資料研究表明，NT-3與腦缺血再灌注損傷關(guān)系密切，它對缺血后神經(jīng)功能康復有促進作用［17］。但NT-3與其他神經(jīng)生長因子有所不同，腦缺血后表達減少［18］，我們的研究與其基本一致。腦缺血再灌注后引起的損傷主要發(fā)生的部位在大腦皮質(zhì)［19］和海馬［20］，因此目前國內(nèi)、外關(guān)于神經(jīng)營養(yǎng)因子對腦缺血再灌注引起的神經(jīng)細胞損傷的作用機制主要集中在海馬［21］和大腦皮質(zhì)［22］兩個部位的研究上，關(guān)于小腦和延髓部位的報道比較少。課題組前期研究初步得知萵苣苷B具有一定的抗腦缺血作用，因此在前期基礎上，繼續(xù)探討萵苣苷B是否能對腦缺血大鼠小腦和延髓NT-3數(shù)目和蛋白表達產(chǎn)生的影響。

小腦是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的運動結(jié)構(gòu)之一，它不僅能夠參與軀體平衡和肌肉張力（肌緊張）的調(diào)節(jié)，而且還能夠參與隨意運動的協(xié)調(diào)。人體的生命中樞的延髓，位于小腦正前方，其作用主要是控制呼吸、心跳、消化等基本生命活動。腦缺血時，小腦皮層和大腦、紋狀體、海馬等腦組織一樣，對缺血敏感，容易導致遲發(fā)性神經(jīng)元死亡［23］的發(fā)生。有研究表明，在腦組織中，位于遠隔部位的延髓，雖然在缺血損傷時處于正常區(qū)，但由于延髓內(nèi)有呼吸、心血管、吞咽和胃腸等內(nèi)臟活動的重要中樞，能夠促進延髓內(nèi)臟帶產(chǎn)生多種神經(jīng)遞質(zhì)，從而在形態(tài)和功能上來一方面保護前腦未受損的神經(jīng)元，另一方面使受到損害的神經(jīng)元得到很大的改善［24］。提示當發(fā)生短暫性腦缺血時，小腦和延髓組織同樣啟動了自身的保護機制來參與受損腦細胞功能的恢復。

本實驗研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用藥24 h后，萵苣苷B低、中、高劑量組均能改善大鼠腦缺血再灌注損傷所出現(xiàn)的神經(jīng)缺失癥狀，增加小腦和延髓NT-3陽性神經(jīng)元數(shù)目和蛋白的表達，且萵苣苷B中劑量組的作用效果優(yōu)于陽性對照藥尼莫地平，與前期研究發(fā)現(xiàn)的萵苣苷B各劑量組能增加大鼠大腦皮質(zhì)NT-3基因的比較一致。提示萵苣苷B除了可增加大腦皮質(zhì)NT-3的表達外，也能通過增加小腦和延髓NT-3神經(jīng)元數(shù)目和蛋白的表達來改善腦缺血的神經(jīng)元損傷。但是本實驗結(jié)果顯示萵苣苷B高劑量組反而不如中劑量組，提示藥物劑量設置可能偏高，下次實驗時可降低一個劑量實施。通過本研究證實了萵苣苷B在一定程度上對小腦和延髓組織內(nèi)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子NT-3具有上調(diào)作用，并能夠促進其蛋白的表達，進一步闡明了萵苣苷B保護腦缺血的分子機制，這對萵苣苷B的臨床開發(fā)和應用奠定了堅實的理論基礎。

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R966

B

1001-1528（2015）01-0192-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.01.041

2013-10-10

國家自然科學基金資助項目（81172953）；河南省教育廳自然科學研究項目（2009A310009）；河南省教育廳科學技術(shù)研究重點項目（14A310024）

孫 娟（1982—），女，醫(yī)學碩士，講師，主要從事心腦血管藥理研究。

詹合琴（1967—），女，醫(yī)學碩士，副教授，碩士生導師，主要從事心腦血管藥理研究。Te1：13781966576，E-mai1：xiaofei1@126.com