RP-HPLC法同時(shí)測定狹基線紋香茶菜中4個(gè)碳苷黃酮

唐海明，　陳建南，2，　黎 愛，　羅宇欣，　賴小平，2，　黃 松，2*

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)新藥開發(fā)研究中心，廣東　廣州　510006；2.東莞廣州中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥數(shù)理工程研究院，廣東　東莞　523808）

RP-HPLC法同時(shí)測定狹基線紋香茶菜中4個(gè)碳苷黃酮

唐海明1，陳建南1，2，黎 愛1，羅宇欣1，賴小平1，2，黃 松1，2*

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)新藥開發(fā)研究中心，廣東廣州510006；2.東莞廣州中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥數(shù)理工程研究院，廣東東莞523808）

目的 建立同時(shí)定量測定狹基線紋香茶菜中viceninⅡ、isoschaftoside、schaftoside、vitexin的RH-HPLC。方法

RH-HPLC；狹基線紋香茶菜；viceninⅡ；isoschaftoside；schaftoside；vitexin

狹基線紋香茶菜為唇形科香茶菜植物，是廣東地區(qū)中藥溪黃草的主流產(chǎn)品之一，具有清熱利濕及退黃功效，用于濕熱黃疸、濕熱瀉痢、急性黃疸型肝炎、急性膽囊炎而有黃疸者［1］。

狹基線紋香茶菜主要含有揮發(fā)油、萜類、酚酸、黃酮類和香豆素等成分。藥理研究表明，狹基線紋香茶菜水提物具有抗炎、保肝作用［2］。前期實(shí)驗(yàn)成功從狹基線紋香茶菜水提物中分離得到viceninⅡ、isoschaftoside、schaftoside、vitexin等黃酮碳苷類成分。研究表明，黃酮碳苷具有保肝、護(hù)肝的功效［3］，其中viceninⅡ具有抗炎、抗氧化、抗CC14和半乳糖肝損傷作用［4］及抗前列腺癌作用［5］，isoschaftoside［6］和vitexin［7］具有保肝、護(hù)肝的功效。

目前，有關(guān)狹基線紋香茶菜質(zhì)量控制方面研究有咖啡酸、迷迭香酸、二萜類、三萜類和揮發(fā)油成分定量測定的報(bào)道［8-11］，而筆者在研究狹基線紋香茶菜水溶性成分時(shí)發(fā)現(xiàn)，狹基線紋香茶菜水提物中含有較多黃酮碳苷類成分，黃酮碳苷類成分有較強(qiáng)的生物活性，尚未有HPLC法同時(shí)測定狹基線紋香茶菜中多種黃酮碳苷的報(bào)道，加之國內(nèi)外對狹基線紋香茶菜水溶性成分報(bào)道同樣少，這些研究不能全面系統(tǒng)地評價(jià)狹基線紋香茶菜的質(zhì)量，使得其質(zhì)量監(jiān)控標(biāo)準(zhǔn)缺乏。本研究建立了HPLC法同時(shí)定量測定狹基線紋香茶菜中viceninⅡ、isoschaftoside、schaftoside、vitexin的方法。

1　儀器與試藥

日本島津高效液相色譜儀（SIL-20A自動進(jìn)樣器，LC-20AT紫外檢測器，DGU-20A5柱溫箱）；萬分之一電子天平（Sartorius BP110 s，德國賽多利斯公司）；粉碎機(jī)械FZ-230型（溫嶺市牧嶼百樂機(jī)床廠）；超聲清洗器（ULTRASONIC，360 kW，250 kHz）。

流動相所用甲醇為色譜純，水為雙蒸水，其他試劑均為分析純。

對照品viceninⅡ、isoschaftoside、schaftoside、vitexin均自制，經(jīng)ESI-MS，1H-NMR和13C-NMR確認(rèn)，純度＞98%，各化合物結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1　4個(gè)碳苷黃酮的結(jié)構(gòu)Fig.1　Structures of four C-gIycosyI fIavones

狹基線紋香茶菜，采自不同產(chǎn)地，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)新藥開發(fā)研究中心陳建南研究員鑒定為唇形科香茶菜屬植物狹基線紋香茶菜Isodon lophanthoides var.gerardianus（Benth.）H.Hara，以上憑證標(biāo)本存于廣州中醫(yī)藥大學(xué)新藥開發(fā)研究中心。

2　方法與結(jié)果

2.1混合對照品溶液 精密稱取上述各對照品適量，以甲醇制成含viceninⅡ、isoschaftoside、schaftoside、vitexin質(zhì)量濃度分別為380、660、430、480μg/mL的混合溶液，即得。

2.2供試品溶液 藥材經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，過40目篩。取樣品粉末約0.5 g，精密稱定，置于50 mL具塞錐形瓶中，加70%乙醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取30 min，取出待冷卻后再次稱定質(zhì)量，用70%乙醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，取續(xù)濾液過0.45μm濾膜，即得。

2.3色譜條件及系統(tǒng)適用性考察 采用日本島津LC-20AT，C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相為甲醇-0.1%磷酸水溶液梯度洗脫（0～5 min，16%～25%甲醇；5～20 min，25%～30甲醇；20～40 min，30%甲醇；40～65 min，30%～45%甲醇），體積流量0.8 mL/min，柱溫為25℃，檢測波長334 nm，進(jìn)樣量15μL。各峰與相鄰峰的分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)均在10 000以上。樣品與對照品的色譜圖見圖2。

圖2　對照品（A）與1號樣品（B）的HPLC圖Fig.2　HPLC chromatogram s of reference substances（A）and sam p Ie No.1（B）

2.4線性關(guān)系考察 取“2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液，分別取1、3、5、7、9、11μL，注入液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣測定3次，記錄色譜峰。以進(jìn)樣量Ⅹ（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積平均值Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行回歸計(jì)算，4個(gè)碳苷黃酮對照品線性關(guān)系良好，回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)見表1。

2.5精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品（樣品1，廣東饒平基地）溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積。結(jié)果viceninⅡ、isoschaftoside、schaftoside、vitexin峰面積的RSD（n=6）分別為0.9%、0.6%、0.9%、0.6%，表明儀器精密度良好。

表1　4個(gè)碳苷黃酮的線性關(guān)系（n=6）Tab.1 Linear reIationship of four C-gIycosy I fIavones（n=6）

2.6重復(fù)性試驗(yàn) 分別稱取同一批樣品（樣品1，廣東饒平基地）6份，按“2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份試品溶液，進(jìn)樣15μL，記錄viceninⅡ、isoschaftoside、schaftoside、vitexin的峰面積值，代入“2.4”項(xiàng)下回歸方程，計(jì)算。結(jié)果樣品中viceninⅡ、isoschaftoside、schaftoside、vitexin的平均含有量分別為8.09、11.86、4.82、2.27 mg/g，RSD依次為1.3%、2.0%、0.9%和0.9%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品（樣品1，廣東饒平基地）溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣15μL，記錄色譜圖，計(jì)算viceninⅡ、isoschaftoside、schaftoside、vitexin色譜峰的峰面積值，計(jì)算其RSD分別為1.0%、1.2%、1.1%、1.7%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8加樣回收率試驗(yàn) 取“2.6”項(xiàng)中已測知含有量的狹基線紋香茶菜粉未6份，每份約0.5 g，精密稱定，分別置具塞錐形瓶中，精密加入每1mL含viceninⅡ1 080μg、isoschaftoside 1 735μg、schaftoside 1 186μg、vitexin 1 349μg的混合對照品溶液1.0 mL，氮?dú)獯蹈?，按?.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣15μL，計(jì)算viceninⅡ、isoschaftoside、schaftoside、vitexin的量，并根據(jù)加入量計(jì)算回收率，結(jié)果見表2，表明方法準(zhǔn)確度良好。

表2　加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.2 Resu Its of recovery tests（n=6）

2.9樣品測定 取狹基線紋香茶菜樣品，分別按“2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，精密取供試品溶液15μL進(jìn)樣分析，以外標(biāo)法計(jì)算各成分，結(jié)果見表3。

表3　16批狹基線紋香茶菜藥材中4個(gè)碳苷黃酮的測定結(jié)果（mg/g，n=3）Tab.3 Contents of four C-gIycosy I fIavones in Isodon Lophanthoides from different origins（mg/g，n=3）

3　討論

分別對viceninⅡ、isoschaftoside、schaftoside和vitexin溶液進(jìn)行了紫外全波長掃描，其最大吸收波長均在334 nm左右，在該波長下測定樣品，各成分峰形較好，基線穩(wěn)定，干擾少，故選擇334 nm作為檢測波長。

本實(shí)驗(yàn)對4種常用的流動相系統(tǒng)（乙腈-水、乙腈-磷酸水、甲醇-水、甲醇-磷酸水）的應(yīng)用進(jìn)行了考察，結(jié)果表明上述系統(tǒng)在等度洗脫情況下，所測的viceninⅡ、isoschaftoside、schaftoside和vitexin 4個(gè)成分達(dá)不到很好的分離效果，用乙腈作有機(jī)相時(shí)，同分異構(gòu)體isoschaftoside和schaftoside根本不能分離開，最終用甲醇-0.1%磷酸系統(tǒng)，被測4個(gè)黃酮碳苷類成分分離度良好，峰形窄而對稱，不受其他峰的干擾。

本實(shí)驗(yàn)所測viceninⅡ、isoschaftoside、schaftoside和vitexin為極性較大的黃酮碳苷類成分，試樣對提取溶劑10%、30%、50%、70%、80%、95%乙醇等進(jìn)行了選擇，結(jié)果用70%乙醇作提取溶劑，提取率高，其他成分干擾小。有關(guān)各組分提取工藝的優(yōu)化有待進(jìn)一步研究。有關(guān)各成分含有量、采收時(shí)間之間的關(guān)系以及溪黃草各品種之間成分含有量的差異，將在后期實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)建立的方法簡便、快速、準(zhǔn)確，可用于狹基線紋香茶菜viceninⅡ、isoschaftoside、schaftoside和vitexin含量的測定，對于狹基線紋香茶菜（溪黃草）的質(zhì)量控制、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立均具有重要意義。

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Simu Itaneous determ ination of four C-gIycosyI fIavones from Isodon Lophanthoides by RP-HPLC

TANG Hai-ming1， CHEN Jian-nan1，2， LIAi1， LUO Yu-xin1， LAIXiao-ping1，2， HUANG Song1，2*
（1.New Drug Research&Development Center，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006，China；2.Dongguan Institution for Mathematics and Theoretics Engineering Research，Guangzhou University of Chinese Medicine，Dongguan 523808，China）

AIM To estab1ish an RP-HPLCmethod for simu1taneous1y determining the contents of viceninⅡ，isoschaftoside，schaftoside and vitexin from Isodon Lophanthoides.METHODS The ana1ysis of ethano1ic extrctof I.Lophanthoides was performed on Phenomenex 1una C18（250mm×4.6mm，5μm）co1umn and amobi1e phase consisting ofmethano1and 0.1%phosphoric acid in a gradient e1ution mode，f1ow ve1ocity was 0.8 mL/min and the detection wave1ength was setat344 nm，with the co1umn temperature of25℃.RESULTS The 1inear ranges of viceninⅡ，isoschaftoside，schaftoside，vitexin were 0.38-4.18μg，0.66-7.26μg，0.43-4.73μg，and 0.48-5.28μg，respective1y.Their average recoveries（n=6）were 97.7%（RSD=1.6%），98.8%（RSD= 2.1%），96.9%（RSD=1.8%），and 100.1%（RSD=1.9%），respective1y.CONCLUSION The method is themost suitab1e for quantitative determination of C-g1ycosy1 f1avones from I.Lophanthoides，especia11y in the se-1ection of wave1ength，mobi1e phase，and extract so1ution.

RP-HPLC；Isodon Lophanthoides；viceninⅡ；isoschaftoside；schaftoside；vitexin

R284.1

A

1001-1528（2015）01-0138-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.01.028

2014-03-11

國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAI29B00）

唐海明（1988—），男，碩士生，主要從事中藥新藥篩選與研究。Te1：15088068915，E-mai1：thm1835@qq.com

黃 松（1973—），男，研究員，主要從事中藥新藥開發(fā)。Te1：13668987309，E-mai：huangnn421@163.com

狹基線紋香茶菜70%乙醇提取液分析采用Phenomenex 1una C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm），流動相為甲醇-0.1%磷酸水溶液梯度洗脫，體積流量0.8 mL/min，檢測波長344 nm；柱溫為室溫（25℃）。結(jié)果 ViceninⅡ、isoschaftoside、schaftoside、vitexin線性范圍分別為0.38～4.18μg、0.66～7.26μg、0.43～4.73μg、0.48～5.28μg；平均回收率（n=6）分別為97.7%、98.8%、96.9%、100.1%，RSD分別為1.6%、2.1%、1.8%、1.9%。結(jié)論 本法的檢測波長，流動相和提取溶劑的選擇在狹基線紋香茶菜中黃酮碳苷類成分的定量分析上是最適合的。