馬齒莧抗糖尿病活性成分的研究

金 妍，　徐華影，　陳 琛

（天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，天津　300211）

［成分分析］

馬齒莧抗糖尿病活性成分的研究

金 妍，徐華影，陳 琛

（天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，天津300211）

目的 研究馬齒莧抗糖尿病的活性成分。方法 馬齒莧全草用75%乙醇提取，利用硅膠、凝膠等柱色譜及制備液相色譜進(jìn)行分離，并根據(jù)有機(jī)波譜技術(shù)鑒定了化合物結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步通過測定各個(gè)化合物對(duì)胰島素抵抗的HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響以及黃酮苷類化合物對(duì)Akt磷酸化水平的影響來評(píng)價(jià)其抗糖尿病活性。結(jié)果 從馬齒莧中分離鑒定了9個(gè)化合物，分別為芹菜素-4′-O-α-L-鼠李糖苷（1），橙皮苷（2），山柰酚（3），木栓酮（4），6，7-二羥基香豆素（5），反式-對(duì)香豆酸（6），金蓮花堿（7），咖啡酸（8），二十八烷酸（9），此外化合物1～4能夠顯著提高胰島素抵抗HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗，其中化合物1的效果最為顯著并能降低該細(xì)胞Akt的磷酸化水平。結(jié)論 化合物1為首次從該植物中分離得到并且具有較強(qiáng)的抗糖尿病活性。

馬齒莧；黃酮苷；芹菜素-4′-O-α-L-鼠李糖苷；抗糖尿病活性

馬齒莧Protulaca oleracea L.又名馬齒草、長壽菜等，為馬齒莧科一年生肉質(zhì)草本植物，廣泛分布于全世界溫帶和熱帶地區(qū)，是我國衛(wèi)生部劃定的78種藥食同源的野生植物之一。性味酸寒，具有清熱解毒，涼血止血之功?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明馬齒莧具有降血脂、降血糖和抗動(dòng)脈粥樣硬化等功能［1-2］。文獻(xiàn)報(bào)道其化學(xué)成分主要有生物堿、萜類、有機(jī)酸、黃酮、揮發(fā)油、香豆素和多糖等［2］。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用大孔吸附樹脂、硅膠柱色譜、凝膠柱色譜的方法從馬齒莧乙醇浸膏中分離鑒定了9個(gè)化合物，包括黃酮苷類化合物，香豆素類化合物，有機(jī)酸類化合物及三萜類化合物，其中化合物1為首次從該植物中分離得到，此外，本實(shí)驗(yàn)對(duì)分離得到的黃酮苷類化合物進(jìn)行了抗糖尿病活性的篩選，結(jié)果顯示化合物1具有較強(qiáng)的抗糖尿病活性。

1　儀器與材料

Bruker AV 400核磁共振儀（TMS內(nèi)標(biāo)）；JASCO半制備高效液相色譜儀（PU-2089，RI-2031，UV-2075，JASCO日本分光株式會(huì)社）；UV-3310型紫外-可見分光光度計(jì)（日本日立集團(tuán)）；YMCPack ODS-A SH-343-5色譜柱（20 mm×250 mm，5μm）；A sahipak GS-20G H200142，H200143色譜柱（20 mm×500 mm，5μm）；柱色譜和薄層色譜用硅膠（青島海洋化工廠）；37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（力康生物醫(yī)療技術(shù)控股有限公司）；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；全自動(dòng)酶標(biāo)板分析儀（美國伯樂公司）；倒置顯微鏡（奧林巴斯有限公司）；所用試劑均為分析純；氘代試劑（西格瑪奧德里奇上海貿(mào)易有限公司）；含酚紅或不含酚紅DMEM培養(yǎng)液（北京四環(huán)科技公司）；胎牛血清（FBS），PBS（HyC1one）；葡萄糖試劑盒（上海榮盛生物藥業(yè)有限公司）；25%（含EDTA）胰蛋白酶（以色列生物工業(yè)公司）；胰島素（法國Li1y公司）HepG2細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫，Akt、p-Akt及Actin抗體（美國CST公司）。

馬齒莧Protulaca oleracea L.采自四川（2012年4月），由蘭州大學(xué)生命科學(xué)院及甘肅省食品藥品檢驗(yàn)所共同鑒定為Protulaca oleracea L.，標(biāo)本（D20120423）存放于天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院藥劑科中藥房。

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1提取分離 取自然干燥的馬齒莧全草10.0 kg，粉碎后用75%的乙醇加熱回流提取3次，每次6 h，提取液減壓濃縮，得浸膏900 g，將浸膏以水混懸，依次用水飽和的石油醚（60～90℃）、乙酸乙酯和正丁醇萃取，得石油醚提取物242 g，乙酸乙酯提取物125 g，正丁醇提取物138 g。3 kg馬齒莧石油醚提取物及1.5 kg乙酸乙酯提取物分別以硅膠柱層析（100～200目）分離，用石油醚-乙酸乙酯-甲醇系統(tǒng)梯度洗脫，洗脫梯度為石油醚-乙酸乙酯（8∶1，6∶1，4∶1，3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3），100%乙酸乙酯，乙酸乙酯-甲醇（95∶5，90∶10，80∶20）和100%甲醇依次梯度洗脫，通過TLC合并類似組分，石油醚提取物分離得到26個(gè)組分（PA～PZ），乙酸乙酯提取物分離得到15個(gè)組分（EA～EO）。

組分PG經(jīng)過凝膠滲透柱層析Toyopea1HW-40分離，二氯甲烷-甲醇（2∶1）洗脫，得到Fr. PG1～Fr.PG4，F(xiàn)r.PG2（879.0 mg）再經(jīng)制備高效液相色譜分離純化，分別得到化合物3（26.5 mg），化合物5（21.6 mg）；組分PK經(jīng)過凝膠滲透柱層析Toyopea1 HW-40分離，二氯甲烷-甲醇（2∶1）洗脫，得到Fr.PK1～Fr.PK5，F(xiàn)r.PK3（934.7 mg）再經(jīng)制備高效液相色譜及制備薄層色譜法分離純化，分別得到化合物2（24.5 mg）和化合物6（11.0 mg）。組分EF經(jīng)過凝膠滲透柱層析Toyopea1HW-40分離，二氯甲烷-甲醇（1∶1）洗脫，得到Fr.EF1～Fr.EF4，F(xiàn)r.EF2（1 256.3 mg）再反復(fù)經(jīng)制備高效液相色譜法分離純化，分別得到化合物1（22.1 mg），化合物7（16.9 mg）。組分EH經(jīng)過凝膠滲透柱層析Toyopea1HW-40分離，二氯甲烷-甲醇（1∶1）洗脫，得到Fr.EH1～Fr.EH4，F(xiàn)r.3（842.9 mg）再反復(fù)經(jīng)制備高效液相色譜法及重結(jié)晶法分離純化，分別得到化合物4（34.2 mg），化合物9（15.1 mg）。組分EM經(jīng)過凝膠滲透柱層析Toyopea1HW-40分離，二氯甲烷-甲醇（1∶1）洗脫，得到Fr.EM1～Fr.EM6，F(xiàn)r.PK4（921.4 mg）再經(jīng)制備高效液相色譜及制備薄層色譜法分離純化，得到化合物8（20.5 mg）。

2.2胰島素抵抗HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗實(shí)驗(yàn) 將處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞消化后，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為105個(gè)/mL，轉(zhuǎn)入96孔板中。待細(xì)胞單層貼壁后，加入新配制的含有10-7mo1/L胰島素的培養(yǎng)液，并設(shè)無胰島素的空白孔，于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中孵育36 h后棄去培養(yǎng)液，先用pH4.0的無酚紅的DMEM洗4次，再用無酚紅DMEM洗2次后，換上無血清的培養(yǎng)基37℃孵育24 h后，用葡萄糖臨床試劑盒檢測培養(yǎng)基的葡萄糖含有量。實(shí)驗(yàn)分別設(shè)正常細(xì)胞組、胰島素抵抗模型組、化合物處理組（終濃度分別為1、5、10μmo1/L）。以不鋪細(xì)胞的空白孔為空白對(duì)照，計(jì)算24 h各組細(xì)胞的葡萄糖消耗量。根據(jù)初篩3個(gè)濃度下的葡萄糖消耗量重新設(shè)定5個(gè)濃度進(jìn)行EC50值的測定，測定的數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以±s表示，組間差異的顯著性采用t檢驗(yàn)方法進(jìn)行，EC50的計(jì)算采用非線性擬合方法進(jìn)行。

2.3磷酸化Akt及非磷酸化Akt蛋白水平的檢測

本實(shí)驗(yàn)采用免疫印跡法（Western B1ot法），方法簡述如下：細(xì)胞加裂解液裂解后取上清，加入5X蛋白上樣緩沖液95℃沸煮5 min后在10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠中電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，然后用5%的脫脂牛奶封閉1 h，洗膜后將膜分割，分別加入Akt、p-Akt和β-actin的抗體，稀釋比例為1∶1 000稀釋，4℃過夜。再次洗膜后加入第二抗體進(jìn)行反映，室溫孵育1 h，洗膜后ECL熒光顯色和曝光。利用圖像分析系統(tǒng)確定X線光膠片上蛋白條帶的相對(duì)灰度。

3　結(jié)果

3.1結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：黃色粉末，mp 247～249℃。1HNMR（CDC13，400 MHz）δ：6.88（1H，s，H-3），6.21（1H，s，H-6），6.51（1H，s，H-8），8.04（2H，d，J=8.3 Hz，H-2′，6′），7.21（2H，d，J= 8.3 Hz，H-3′，5′），12.90（1H，br s，OH-5），5.54（1H，br s，H-1″），1.10（3H，d，J=6.1 Hz，H-6″）。13C-NMR（CDC13，100 MHz）δ：164.1（C-2），104.8（C-3），182.8（C-4），162.4（C-5），98.6（C-6），165.3（C-7），95.0（C-8），158.4（C-9），104.9（C-10），124.9（C-1′），129.3（C-2′，6′），117.7（C-3′，5′），160.0（C-4′），99.9（C-1″），71.0（C-2″），71.3（C-3″），72.7（C-4″），70.8（C-5″），18.9（C-6″）。以上光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［3］報(bào)道基本一致，因此鑒定化合物1為芹菜素-4′-O-α-L-鼠李糖苷。

化合物2：白色粉末，mp 286～287℃。1HNMR（DMSO-d6，400 MHz）δ：1.09（3H，d，J= 6.5 Hz，H-6?），5.52（1H，dd，J=3，12.5 Hz，H-2），2.77（1H，dd，J=3.0，17.0 Hz，H-3），3.27（1H，dd，J=12.0，17.0 Hz，H-3），3.79（3H，s，OCH3-4′），3～3.58（10H，糖上質(zhì)子），4.54（1H，s，H-1?），4.95（1H，d，J=7.5 Hz，H-1″），6.15（1H，d，J=2.0 Hz，H-6），6.18（1H，d，J=2.0 Hz，H-8），6.93（3H，m，H-2′，5′，6′）。13C-NMR（DMSO-d6，100 MHz）δ：78.5（C-2），42.2（C-3），197.2（C-4），163.3（C-5），96.6（C-6），165.5（C-7），95.8（C-8），162.8（C-9），100.7（C-10），130.9（C-1′），114.3（C-2′），148.1（C-3′），146.7（C-4′），112.3（C-5′），117.9（C-6′），55.8（C-7′），99.8（C-1″），73.1（C-2″），76.5（C-3″），70.5（C-4″），75.7（C-5″），66.2（C-6″），103.9（C-1?），70.9（C-2?），72.2（C-3?），69.8（C-4?），68.1（C-5?），17.9（C-6?）。以上光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［4］報(bào)道基本一致，因此鑒定化合物2為橙皮苷。

化合物3：黃色粉末，mp 274～275℃。1HNMR（CD3OD，400 MHz）δ：12.45（1H，s，OH-5），8.08（2H，d，J=8.3 Hz，H-2′，6′），6.90（2H，d，J=8.3 Hz，H-3′，5′），6.38（1H，d，J= 1.8 Hz，H-8），6.17（1H，d，J=1.8 Hz，H-6）。13C-NMR（CD3OD，100 MHz）δ：148.2（C-2），137.3（C-3），177.5（C-4），162.7（C-5），99.5（C-6），165.7（C-7），94.6（C-8），158.4（C-9），104.7（C-10），121.9（C-1′），130.8（C-2′，6′），115.5（C-3′，5′），160.8（C-4′）。以上光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［5］報(bào)道基本一致，因此鑒定化合物3為山柰酚。

化合物4：白色針狀結(jié)晶（乙酸乙酯），mp 260～262℃。1H-NMR（CDC13，400 MHz）δ：0.74（3H，s，H-24），0.87（3H，s，H-25），0.89（3H，d，J=6.8 Hz，H-23），0.97（3H，s，H-30），1.00（3H，s，H-29），1.02（3H，s，H-26），1.05（3H，s，H-27），1.22（3H，s，H-28），2.3～2.4（2H，m，H-2）。13C-NMR（CDC13，100 MHz）δ：213.2（C=O），22.3（C-1），41.9（C-2），58.3（C-4），42.1（C-5），41.8（C-6），18.8（C-7），51.9（C-8），37.8（C-9），59.7（C-10），35.6（C-11），23.9（C-12），39.3（C-13），38.8（C-14），30.5（C-15），36.3（C-16），32.8（C-17），43.7（C-18），36.0（C-19），28.5（C-20），32.9（C-21），39.5（C-22），16.9（C-23），14.9（C-24），18.5（C-25），17.7（C-26），19.5（C-27），31.7（C-28），34.6（C-29），31.9（C-30）。以上光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［6］報(bào)道基本一致，因此鑒定化合物4為木栓酮。

化合物5：淡黃色粉末，mp 269.5～270.5℃。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）δ：6.19（1H，d，J=9.5 Hz，H-3），7.79（1H，d，J=9.5 Hz，H-4），6.95（1H，s，H-5），6.77（1H，s，H-8）。13C-NMR（CD3OD，100 MHz）δ：164.4（C-2），113.9（C-3），146.8（C-4），112.5（C-5），144.5（C-6），150.5（C-7），103.8（C-8），152.3（C-9），112.9（C-10）。以上光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［7］報(bào)道基本一致，因此鑒定化合物5為6，7-二羥基香豆素。

化合物6：無色針晶，mp 170～172℃。1HNMR（CD3OD，400 MHz）δ：7.46（2H，d，J=8.6 Hz，H-2，6），6.76（2H，d，J=8.6 Hz，H-3，5），7.60（1H，d，J=16.0 Hz，H-7），6.29（1H，d，J=16.0 Hz，H-8）。13C-NMR（CD3OD，100 MHz）δ：127.9（C-1），131.5（C-2，6），116.8（C-3，5），161.8（C-4），146.9（C-7），115.8（C-8），171.2（C-9）。以上光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［8］報(bào)道基本一致，因此鑒定化合物6為反式-對(duì)香豆酸。

化合物7：無色片狀晶塊（甲醇），mp 165.0～167.0℃。1H-NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ：1.61（1H，m，H-1），2.26（1H，m，H-2），2.41（1H，m，H-2），2.54（2H，m，H-6），2.59（1H，m，H-1），2.94（1H，m，H-5），3.98（1H，m，H-5），4.60（1H，t，J=7.8 Hz，H-10b），6.52（1H，s，H-7），6.54（1H，s，H-10）。13C-NMR（DMSO-d6，100 MHz）δ：27.7（C-1），31.6（C-2），172.4（C-3），36.9（C-5），27.6（C-6），123.8（C-6a），115.7（C-7），144.3（C-8），144.5（C-9），112.0（C-10），128.7（C-10a），55.9（C-10b）。以上光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［9］報(bào)道基本一致，因此鑒定化合物7為金蓮花堿。

化合物8：淡黃色粉末，mp 207～209℃。1HNMR（CD3OD，400 MHz）δ：7.05（1H，d，J=2.0 Hz，H-2），6.77（1H，d，J=8.2 Hz，H-5），6.95（1H，dd，J=2.0，8.2 Hz，H-6），7.50（1H，d，J=16.0 Hz，H-7），6.18（1H，d，J=16.0 Hz，H-8）。13C-NMR（CD3OD，100 MHz）δ：128.4（C-1），115.7（C-2），147.6（C-3），149.9（C-4），117.1（C-5），123.5（C-6），147.4（C-7），115.8（C-8），167.8（C-9）。以上光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［10］報(bào)道基本一致，因此鑒定化合物8為咖啡酸。

化合物9：白色粉末，mp 90.5～91.0℃，不溶于無機(jī)酸，易溶于堿，推測為脂肪酸；EI-MS m/z87，101，115，129，157，171，185，213，227，255，297，311，325，339，353，367，424；與二十八烷酸對(duì)照品TLC的Rf值一致。其光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［11］報(bào)道基本一致，因此鑒定化合物9為二十八烷酸。

3.2化合物對(duì)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗的影響 本實(shí)驗(yàn)對(duì)分離得到的各個(gè)化合物進(jìn)行了抗糖尿病的初步活性測定，利用胰島素抵抗的HepG2細(xì)胞為體外模型，測定化合物1～9對(duì)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響，結(jié)果如圖1所示，化合物1～4能夠有效地促進(jìn)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞的葡萄糖消耗，其中化合物1的作用最為顯著。根據(jù)初步活性結(jié)果，確定了EC50的濃度測定范圍，對(duì)化合物1進(jìn)行了EC50濃度測試，測試濃度分別為（1μmo1/L、5μmo1/L、10μmo1/L、50μmo1/L、100μmo1/L），其EC50值為12.67μmo1/L。

3.3化合物1對(duì)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞Akt磷酸化水平的影響 蛋白激酶B（Akt/PKB）是一種重要的蛋白激酶，參與包括細(xì)胞凋亡和葡萄糖代謝在內(nèi)的細(xì)胞過程，它在西部代謝、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞生長凋亡等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用，與胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［12］。本實(shí)驗(yàn)利用胰島素抵抗的HepG2細(xì)胞，測定化合物1在濃度分別為1、5、10μmo1/L時(shí)對(duì)胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下HepG2細(xì)胞蛋白激酶B（Akt/PKB）的磷酸化水平的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，化合物1在不影響Akt總蛋白表達(dá)的前提下能夠顯著降低胰島素抵抗HepG2細(xì)胞Akt的磷酸化水平，并呈現(xiàn)劑量依賴性，顯示化合物1可能通過降低Akt磷酸化水平來改善HepG2細(xì)胞的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)從而提高葡萄糖消耗，提示化合物1具有一定的抗糖尿病活性。

圖1　化合物1～9對(duì)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響Fig.1　Effect on gIucose consum ption of compounds1-9 in insu Iin resistance HepG2 ceIIs

4　討論

本實(shí)驗(yàn)從馬齒莧石油醚和乙酸乙酯極性部位提取分離得到9個(gè)化合物，其中化合物1為首次從該植物中分離得到。根據(jù)馬齒莧的現(xiàn)代藥理學(xué)研究結(jié)果以及文獻(xiàn)報(bào)道黃酮及黃酮苷類化合物具有顯著的抗糖尿病活性［13-14］，利用胰島素抵抗HepG2細(xì)胞對(duì)化合物1～9進(jìn)行抗糖尿病作用的初步篩選，初步篩選結(jié)果表明，黃酮類化合物1～4能夠有效地提高胰島素抵抗的HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量，其中化合物1的效果最為顯著；進(jìn)一步對(duì)Akt磷酸化水平評(píng)價(jià)表明，化合物1能劑量依賴性的降低胰島素抵抗HepG2細(xì)胞Akt磷酸化水平，改善胰島素抵抗，提高細(xì)胞對(duì)葡萄糖的利用，顯示了明確的體外抗糖尿病作用。本實(shí)驗(yàn)利用胰島素抵抗的HepG2細(xì)胞模型對(duì)馬齒莧的抗糖尿病活性進(jìn)行了初步研究，為中藥馬齒莧的抗糖尿病應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

圖2　不同濃度化合物1對(duì)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞Akt磷酸化水平的影響Fig.2　Effect of compound 1 w ith different concentrations on the phosphoryIation IeveIof Akt of insu Iin resistance HepG2 ceIIs

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Anti-diabetic constituents of Portulaca oleracea L.

JIN Yan， XU Hua-ying， CHEN Chen
（The Second Hospital of Tianjin Medical University，Tianjin 300211，China）

AIM To study the chemica1constituents from Portulaca oleracea L.and their anti-diabetic activity.METHODS The constituents extracted from P.oleracea with 75%ethy1a1coho1were iso1ated by chromatography of si1ica ge1，ODS，Toyopear1HW-40 and preparative HPLC.Their structureswere identified on the basis of the physica1properties and spectra1 ana1ysis.Furthermore，the anti-diabetic activities were eva1uated by g1ucose consumption assay and the effect on Akt phosphory1ation in insu1in-resistance HepG2 ce11s.RESULTS Nine compounds were iso1ated from P.oleracea L.and identified as apigenin-4′-O-α-L-rhamnopyranoside（1），hesperidin（2），kaempfero1（3），friede1in（4），6，7-dihydroxycoumarin（5），E-p-coumatic acid（6），tro11isine（7），caffeic acid（8），O ctacosanoic acid（9），and compounds1-4 had significant1y stimu1ated g1ucose consumption in insu1in resistance HepG2 ce11s，especia11y compound 1，and decreased their Akt phosphory1ation.CONCLUSION Compound 1 is iso1ated from P.oleracea L.for the first time and exhibits remarkab1e anti-diabetic activity.

Portulaca oleracea L.；f1avonoid g1ycoside；apigenin-4′-O-α-L-rhamnopyranoside；antidiabetic activity

R284.1

A

1001-1528（2015）01-0124-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.01.025

2014-02-28

金 妍（1986—），女，藥師，從事藥房工作。Te1：13920294947，E-mai1：386831119@qq.com