大孔樹脂分離純化天仙子總生物堿的研究

李 巖，　趙 欣，　李曉靜，，　孫 婷，　孟慶勇，　程雪梅，　王長虹*

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥劑物化教研室，新疆　烏魯木齊　830011；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所，中藥標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點實驗室，中藥新資源與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)綜合評價國家中醫(yī)藥管理局重點研究室，上海市復(fù)方中藥重點實驗室，上海　201210）

大孔樹脂分離純化天仙子總生物堿的研究

李 巖1，趙 欣1，李曉靜1，2，孫 婷1，孟慶勇1，程雪梅2，王長虹2*

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥劑物化教研室，新疆烏魯木齊830011；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所，中藥標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點實驗室，中藥新資源與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)綜合評價國家中醫(yī)藥管理局重點研究室，上海市復(fù)方中藥重點實驗室，上海201210）

目的 研究大孔樹脂分離天仙子中總生物堿的最佳工藝條件。方法 采用HPLC法測定，以東莨菪堿、莨菪堿的吸附量和解吸率為考察指標(biāo)，分別考察東莨菪堿、莨菪堿在5種類型的大孔樹脂（LSA5B、LSA21、LSD001、HPD600、D101）上的吸附和解吸附行為，并分析提取液pH、吸附體積流量、洗脫體積流量等參數(shù)對分離的影響。結(jié)果 所比較的5種樹脂中，LSA5B型大孔吸附樹脂對天仙子總生物堿分離純化效果最好，富集能力強，最佳富集工藝條件為以1.5 BV/h的體積流量上樣，4 BV蒸餾水洗去水溶性雜質(zhì)，最佳的洗脫溶劑為體積分?jǐn)?shù)為50%乙醇，最佳洗脫體積流量為1.5 BV/h，洗脫用量為10 BV，東莨菪堿和莨菪堿的洗脫率可達74%和86%。結(jié)論 經(jīng)LSA5B型大孔吸附樹脂純化的天仙子總生物堿中東莨菪堿、莨菪堿可達1.85%、4.03%。

天仙子；莨菪堿；東莨菪堿；大孔吸附樹脂

天仙子為茄科So1anaceae植物莨菪Hyoscyamus niger L.的干燥成熟種子，最早收載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。天仙子性溫，味苦辛，有毒，具有定癇、止痛的功效，常用于治療癲狂、風(fēng)痹厥痛、惡瘡等癥［1］。國內(nèi)外學(xué)者已從天仙子的莖葉及種子中分離出近百種化合物，包括生物堿類、多糖類、黃酮類、香豆素類、木脂素酰胺類、甾族皂苷類等化合物［2-7］。其中托烷類生物堿（主要為莨菪堿和東莨菪堿）被認(rèn)為是天仙子發(fā)揮治療神經(jīng)系統(tǒng)作用相關(guān)疾病的有效成分，但藥材中其含有量很低。因此，需要進行進一步的分離純化。超速離心法、凝膠層析法、膜分離技術(shù)、大孔樹脂吸附技術(shù)、高速逆流色譜技術(shù)、分子蒸餾技術(shù)等是近年來常用的中藥分離純化技術(shù)。其中，大孔樹脂吸附技術(shù)是目前應(yīng)用較廣泛的一種［8-9］。本實驗采用大孔吸附樹脂對天仙子總生物堿有效組分進行分離純化。以東莨菪堿、莨菪堿的量為指標(biāo)，對分離純化工藝條件進行優(yōu)化，為其相關(guān)新藥的研究奠定良好的基礎(chǔ)。

1　儀器與試藥

Waters 2695-2998型高效液相色譜儀（Waters公司）；DKZ-2系列電熱恒溫振蕩水槽（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；MDF1-100手提式中藥粉碎機（上海民德機械制造有限公司）；N-1001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；5415R離心機（Eppendorf，德國）；BS/BT電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）；分析色譜柱Symmetrix ODS-H（4.6 mm×250 mm，5μm）；超純水器（Mi11ipore公司）。

天仙子（批號20120510-1、20120510-2、20120510-3，安徽德昌藥業(yè)飲片有限公司提供，產(chǎn)地：新疆），由上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心吳立宏副研究員鑒定為茄科植物天仙子的Hyoscyamus niger L.的干燥種子；氫溴酸東莨菪堿對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號100050-200309）；硫酸阿托品（Sigma-A1drich，批號077K1047）；不同型號的大孔吸附樹脂（LSA5B、LSA-21、LSD001、HPD600、D101，由西安藍曉科技有限公司提供）；乙腈（色譜級，F(xiàn)isher公司）；甲醇（色譜純，F(xiàn)isher公司）；乙醇為工業(yè)級；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1定量測定 參考文獻［10-13］，采用前期建立的HPLC法對樣品中的東莨菪堿和莨菪堿進行測定。Symmetrix ODS-H色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相為乙腈-0.1%三氟乙酸（14∶86）；檢測波長210 nm；體積流量1.0 mL/min；柱溫30℃；進樣量20μL。氫溴酸東莨菪堿和硫酸阿托品的線性范圍分別為4.02～513.64μg/mL（r= 0.999 9）和4.00～512.00μg/mL（r=0.999 8），平均加樣回收率分別為98.41%（RSD=1.92%，n=3）和98.79%（RSD=1.99%，n=3）；高、中、低質(zhì)量濃度日內(nèi)、日間精密度RSD均小于2.0%；重復(fù)性測定東莨菪堿、莨菪堿的RSD分別為1.40%、1.51%。

2.2天仙子提取液的制備 參照文獻［14］，取天仙子粗粉1 000 g，8倍量1%H2SO4于50℃溫浸24 h，離心，取上清液，為天仙子藥材提取液，即作為大孔樹脂的上樣液。經(jīng)定量測定表明提取液中含東莨菪堿和莨菪堿的質(zhì)量濃度分別為44.72 μg/mL和76.44μg/mL。

2.3樹脂的預(yù)處理 新樹脂先用3 mo1/L的NaOH浸泡8 h，然后用水清洗至中性，再用3 mo1/L的HC1浸泡8 h，用水清洗至中性，最后用95%乙醇浸泡24 h，再用水清洗至樹脂無醇味。

2.4大孔吸附樹脂型號的選擇

2.4.1靜態(tài)吸附量測定 取預(yù)處理好的5種大孔吸附樹脂（包括HPD600、LSA5B、LSD001、LSA21、D101）各1 g置于具塞錐形瓶中，分別加入天仙子提取液200 mL，置于搖床上振搖24 h（室溫），測定吸附平衡后藥液中莨菪堿和東莨菪堿的含有量，按公式［Q=（C0-Ce）V/m，其中C0為待測物初始質(zhì)量濃度（mg/mL），Ce為待測物剩余質(zhì)量濃度（mg/mL），V為溶液體積（mL），m為樹脂質(zhì)量（g）］計算樹脂分別對莨菪堿和東莨菪堿的吸附量。5種大孔吸附樹脂對東莨菪堿和莨菪堿吸附量Q（mg/g）的測定結(jié)果見表1。

2.4.2靜態(tài)吸附曲線的繪制 取預(yù)處理好的5種大孔吸附樹脂各1 g置于具塞錐形瓶中，分別加入200 mL天仙子提取液，在室溫下置于搖床上振搖24 h，分別于0.5、1、3、5、7、9、12、24 h取樣，測定吸附藥液中莨菪堿和東莨菪堿的量，計算樹脂對莨菪堿和東莨菪堿的吸附量Q（mg/g）。以吸附時間和靜態(tài)吸附量Q為橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)，分別繪制莨菪堿和東莨菪堿在不同大孔吸附樹脂上的靜態(tài)吸附曲線。結(jié)果如圖1、2所示。

表1　5種不同型號的大孔吸附樹脂對東莨菪堿和莨菪堿的靜態(tài)吸附量（±s，n=3）Tab.1 Static adsorption capacity of scopoIam ine and hyoscyam ine on five types ofmacro-porous resins（±s，n=3）

表1　5種不同型號的大孔吸附樹脂對東莨菪堿和莨菪堿的靜態(tài)吸附量（±s，n=3）Tab.1 Static adsorption capacity of scopoIam ine and hyoscyam ine on five types ofmacro-porous resins（±s，n=3）

成 分吸附量Q/（mg·g-1）LSA5B HPD 600 LSA 21 D 101 LSD001東莨菪堿4.43±0.01 1.70±0.01 3.06±0.02 2.58±0.01 1.70±0.01莨菪堿10.99±0.12 4.31±0.11 7.33±0.01 6.47±0.02 4.31±0.11

圖1　東莨菪堿在不同類型的大孔吸附樹脂中的靜態(tài)吸附曲線Fig.1　Static adsorption curve of scopoIam ine on differentm acroporous resins

圖2　莨菪堿在不同類型的大孔吸附樹脂中的靜態(tài)吸附曲線Fig.2　Static adsorption curve of hyoscyam ine on differentmacroporous resins

從圖1、圖2可看出，型號為LSA5B的大孔吸附樹脂對東莨菪堿和莨菪堿的靜態(tài)吸附量較大，LSA21、D101、LSD001大孔吸附樹脂對東莨菪堿和莨菪堿的靜態(tài)吸附量相差不大。因此，LSA5B可以作為富集天仙子總生物堿的樹脂。

2.5上樣液pH對東莨菪堿和莨菪堿吸附的影響

稱取LSA5B型大孔吸附樹脂1 g，置于具塞錐形瓶中，加入pH分別為1.0（原液）、2.5、5.0、8.0和11.0的天仙子提取液（原藥液分別用鹽酸和氫氧化鈉調(diào)至所需pH）200 mL，室溫下置于搖床上振搖24 h，測定吸附平衡后藥液中莨菪堿和東莨菪堿的量，計算LSA5B樹脂對莨菪堿和東莨菪堿的吸附量Q（mg/g）：Q=（C0-Ce）V/m。

將上樣液pH分別調(diào)為2.5、5.0、8.0、11.0，吸附24 h后，上樣液中東莨菪堿和莨菪堿的含有量隨pH的升高而減小，如表2所示。LSA5B大孔吸附樹脂對不同pH上樣液中東莨菪堿和莨菪堿的吸附量如表3所示。從表2可以看出，天仙子藥材原上樣液的pH為1.0，將其pH調(diào)高至2.5、5.0、8.0、11.0后，上樣液中東莨菪堿和莨菪堿的含有量均有不同程度的下降。隨pH的升高，LSA5B對莨菪堿的吸附量逐漸減少，但對東莨菪堿的吸附量并無變化（表3）。說明表2中東莨菪堿和莨菪堿的量發(fā)生不同程度的下降是由于pH的升高引起東莨菪堿和莨菪堿的穩(wěn)定性下降、分解造成的。而且，當(dāng)pH調(diào)至8.0以上時，溶液中有油狀沉淀產(chǎn)生，吸附上樣液的樹脂被包裹于油狀物中，無法完全洗脫，且油狀沉淀有極難聞的臭味。因此，選擇原溶液為上樣液。

表2　不同pH中上樣液中東莨菪堿和莨菪堿含有量的變化（±s，n=3）Tab.2 Effects of different pH vaIues on the concentration of scopoIam ine and hyoscyam ine in Ioading soIution（±s，n=3）

表2　不同pH中上樣液中東莨菪堿和莨菪堿含有量的變化（±s，n=3）Tab.2 Effects of different pH vaIues on the concentration of scopoIam ine and hyoscyam ine in Ioading soIution（±s，n=3）

pH 東莨菪堿/（μg·mL-1）莨菪堿/（μg·mL-1）溶液狀態(tài)1.0（原液）44.72±0.52 76.44±0.52黃色澄清溶液2.5 43.94±0.28 72.49±0.72淡黃的溶液，有絮狀物沉于底部5.0 40.26±0.90 70.52±1.69青綠色溶液，有絮狀物沉于底部8.0 39.63±0.90 67.88±0.72墨綠色溶液，有油狀物沉于底部11.0 28.04±0.62 18.68±0.19紅棕色溶液，有油狀物沉于底部

表3　LSA5B對不同pH上樣液中東莨菪堿和莨菪堿吸附量Q的影響（±s，n=3）Tab.3 Effects of different pH vaIues on the static adsorption capacity Q of scopoIam ine and hyoscyam ine on LSA5B macroporous resin（±s，n=3）

表3　LSA5B對不同pH上樣液中東莨菪堿和莨菪堿吸附量Q的影響（±s，n=3）Tab.3 Effects of different pH vaIues on the static adsorption capacity Q of scopoIam ine and hyoscyam ine on LSA5B macroporous resin（±s，n=3）

上樣液pH東莨菪堿/（mg·g-1）莨菪堿/（mg·g-1）1.0 4.43±0.01 9.89±0.12 2.5 1.98±0.61 7.02±0.52 5.0 3.03±0.26 8.46±0.69 8.0 4.51±0.45 8.69±0.22 11.0 4.61±0.37 3.68±0.19

2.6上樣體積流量對樹脂動態(tài)吸附量的影響 取上樣液適量，加至預(yù)處理好的LSA5B型大孔樹脂吸附柱上，于室溫下分別以1.5、2、3 BV/h的體積流量上樣，分段收集流出液（每1 BV為一個流分），樣品處理后用HPLC隔點檢測洗脫液中莨菪堿和東莨菪堿的量，繪制泄漏曲線。由于大孔樹脂的上樣液中東莨菪堿的量比莨菪堿的量少，且會先泄露。因此，規(guī)定當(dāng)流份中東莨菪堿的濃度達到上樣液中東莨菪堿濃度的10%時，即認(rèn)為吸附達到飽和。結(jié)果見圖3、圖4。

圖3　不同體積流量下東莨菪堿在LSA5B樹脂上的泄漏曲線Fig.3　Curves for scopoIam ine Ieakage in LSA5B resin at different fIow rates

當(dāng)流份中東莨菪堿的含有量達到上樣液的10%時，即認(rèn)為吸附飽和。飽和吸附量=東莨菪堿的含有量達到上樣液的10%時的吸附體積×上樣液中東莨菪堿的含有量。體積流量為1.5、2、3 BV/h時的東莨菪堿的飽和吸附量分別為2.83、2.20和0.78 mg/g。由圖3、4可看出，在上述3種上樣體積流量下，東莨菪堿和莨菪堿的泄漏率差異較大。根據(jù)結(jié)果最終選取1.5 BV/h的體積流量為最佳的上樣體積流量。

2.7梯度洗脫曲線的繪制 因上樣液中含有大量的糖類和色素等雜質(zhì)，因此先將吸附飽和的LSA5B樹脂柱先用4 BV的蒸餾水進行沖洗，再依次用4 BV的不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇（10%、30%、50%、70%、90%）進行洗脫，分段收集洗脫液，用HPLC檢測洗脫液中莨菪堿和東莨菪堿的量，計算生物堿的洗脫量Z（mg），Z=ρV，式中ρ為乙醇洗脫液中生物堿的質(zhì)量濃度（mg/mL），V為洗脫用量（mL）。以乙醇體積分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)，洗脫量為縱坐標(biāo)繪制洗脫曲線。如圖5所示，50%乙醇的洗脫量最大。因此，選擇50%乙醇作為洗脫劑。

圖4　不同體積流量下莨菪堿在LSA5B樹脂上的泄漏曲線Fig.4　Curves for hyoscyam ine Ieakage in LSA5B resin at different fIow rates

圖5　不同體積分?jǐn)?shù)乙醇對東莨菪堿和莨菪堿的洗脫曲線Fig.5　Effects of ethanoIconcentration on the desorption of scopoIam ine and hyoscyam ine

2.8洗脫體積流量及洗脫終點的確定 取上樣液加至預(yù)處理好的LSA5B型大孔樹脂吸附柱中上樣，待吸附完全后，先以4 BV的蒸餾水以1.5 BV/h的速率洗脫雜質(zhì)，再以50 BV的50%乙醇按一定的體積流量（1.5、2、3 BV/h）進行洗脫，每2 BV洗脫液為一流份進行收集。將收集的流份用HPLC檢測生物堿量，計算不同體積流量下的累積洗脫率。累積洗脫率（%）=（洗脫溶劑中生物堿的洗脫量Z之和/上樣液中生物堿的總量）×100%。以洗脫體積數(shù)為橫坐標(biāo)，生物堿質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)繪制動態(tài)洗脫曲線，分別如圖6、7、8、9所示。當(dāng)洗脫劑用量達16 BV時，東莨菪堿基本可以洗脫完全。洗脫體積流量為1.5 BV/h時，10 BV的50%的乙醇即可將74%和86%的東莨菪堿和莨菪堿洗脫下來。因此，采用50%乙醇為洗脫劑的最佳洗脫體積流量為1.5 BV/h（圖6、7），最佳的洗脫劑用量為10 BV（圖8、9）。

圖6　東莨菪堿在不同體積流量下的洗脫曲線Fig.6　EIution curves of scopoIam ine at different fIow rates

圖7　莨菪堿在不同體積流量下的洗脫曲線Fig.7　EIution curves of hyoscyam ine at different fIow rates

圖8　東莨菪堿在不同體積流量下的累積洗脫率Fig.8　Cumu Iative eIution rate of scopoIam ine at different fIow ratses

2.9沖洗雜質(zhì)用水量的確定 取上樣液加至預(yù)處理好的LSA5B型大孔吸附樹脂柱中，待吸附完全后，先以4、8和12 BV水洗脫。然后用20 BV的 50%乙醇進行洗脫，收集洗脫液，濃縮，干燥，稱定，測定出膏量。同時對其中的生物堿含有量進行檢測，分別計算莨菪堿和東莨菪堿的損失率，結(jié)果見表4。

圖9　莨菪堿在不同體積流量下的累積洗脫率Fig.9　Cumu Iative eIution rate of hyoscyam ine at different fIow rates

表4　沖洗雜質(zhì)用水量的考察（n=3）Tab.4 Investigation of water consumption for washing impurities（n=3）

表4表明，采用水沖洗除雜，其中的生物堿也有一定程度的損失。水洗次數(shù)越多，生物堿的損失量越大。但水洗可以除去雜質(zhì)，從而可以提高總生物堿的量（見表4）。當(dāng)沖洗用水量由4 BV增加到8 BV時，東莨菪堿的損失率由0.6%增加到2%，醇洗脫液中東莨菪堿的量也有相應(yīng)的減少。因此，最終定洗脫用水量為4 BV。

因此，確定最佳工藝條件為：樣品溶液以1.5 BV/h的體積流量上樣，以4 BV蒸餾水清洗除去水溶性雜質(zhì)，再采用10 BV的50%乙醇以1.5 BV/h的最佳洗脫體積流量進行洗脫。

2.10驗證試驗 按選定的最佳工藝條件，稱取LSA5B大孔吸附樹脂1 g，濕法裝柱，平行3份。吸取天仙子提取液150 mL，以1.5 BV/h的體積流量上樣，先用4 BV蒸餾水洗除去水溶性雜質(zhì)，再用10 BV的50%乙醇以1.5 BV/h的體積流量洗脫莨菪堿和東莨菪堿，收集50%乙醇洗脫液。從表5可以看出，50%乙醇洗脫東莨菪堿和莨菪堿的洗脫率分別可以達到74%和86%，所得浸膏量為86.6 mg，浸膏中東莨菪堿和莨菪堿的含有量分別為2.1%和4.4%。

表5　驗證試驗Tab.5 VaIidation test

2.11重復(fù)放大試驗 稱取預(yù)處理好的LSA5B型大孔吸附樹脂0.5 kg，濕法裝柱。按選定的最佳工藝條件進行重復(fù)放大試驗：以1.5 BV/h的體積流量上樣，上樣量為52.80 L（相當(dāng)于6.2 kg天仙子藥材），用4 BV蒸餾水清洗除去水溶性雜質(zhì)，再以10 BV的50%乙醇在1.5 BV/h的體積流量下洗脫東莨菪堿和莨菪堿，結(jié)果東莨菪堿和莨菪堿的吸附率分別為95.01%和100%，50%乙醇洗脫液中東莨菪堿和莨菪堿的洗脫率分別為74.03%和86.88%，浸膏得量為105.58 g，浸膏中東莨菪堿和莨菪堿的含有量分別為1.85%和4.03%。

3　討論

莨菪烷類生物堿多以成鹽的形式存在于天仙子等植物中，在堿性條件下，則以游離態(tài)形式存在，應(yīng)該有利于樹脂對生物堿的吸附，但從結(jié)構(gòu)上看，莨菪堿和東莨菪堿是莨菪烷衍生的氨基醇與不同的有機酸縮合成的酯型生物堿，易水解，特別是在堿液中更易進行，水解生成莨菪醇和莨菪酸。因此，隨著pH的升高，上樣液中東莨菪堿和莨菪堿的量有不同程度的下降，樹脂對東莨菪堿和莨菪堿的吸附量也會相應(yīng)減少。因此，本實驗最終選擇原藥液上樣。

通過不同特性的大孔樹脂對天仙子總生物堿吸附行為的比較，以LSA5B型大孔吸附樹脂對天仙子總生物堿分離純化效果最好，富集能力強。在確定的工藝條件下，得到東莨菪堿、莨菪堿含有量為1.84%、4.02%的天仙子總生物堿提取物。LSA5B型大孔吸附樹脂富集制備的天仙子的生物堿有效組分中生物堿的含有量比富集前提高了18倍。

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Separation and purification of totaIaIkaIoids from Hyoscyami Semen by macroporous resin

LIYan1， ZHAO Xin1， LI Xiao-jing1，2， SUN Ting1， MENG Qing-yong1， CHENG Xue-mei2，WANG Chang-hong2*
（1.Department of Pharmaceutics，College of Pharmacy，Ⅹinjiang Medical University，Urumqi 830011，China；2 Institute of Chinese Materia Medica，Shanghai University of Traditional ChineseMedicine；TheMOE Key Laboratory for Standardization ofChineseMedicinesand The SATCM Key Laboratory for New Resources and Quality Evaluation of Chinese Medicines；Shanghai Key Laboratory of TCM Complex Prescription，Shanghai201210，China）

AIM To optimize the processing conditions in the purification of the tota1a1ka1oids from Hyoscyami Semen bymacroporous resin.METHODS The adsorption and desorption rates of scopo1amine and hyoscyamine，as the indexes，were determined by HPLC.The bestmacroporous resin was screened out from five resins，LSA5B，LSA21，LSD001，HPD600 and D101，and the parameters of pH va1ue of 1oading so1ution，adsorption f1ow rate and desorption f1ow rate were a1so investigated.RESULTS Among the five macroporous resins，LSA5B，with the best purification and enrichment potency for tota1a1ka1oids from Hyoscyami Semen，was considered the optima1one. The optimum enrichment process for a1ka1oidswas so determined：at the 1oading f1ow rate of 1.5 BV/h，wash off the water-so1ubi1ity impurity with 4 BV water，and then enrich tota1a1ka1oids by 50%ethano1with a consumption of 10 BV so1ution.The desorption efficiency of scopo1amine and hyoscyamine cou1d exceed 74%and 86%，respective1y.CONCLUSION The contentof scopo1amine and hyoscyamine in tota1a1ka1oids prepared by LSA5B can be 1.85%and 4.03%，respective1y.

Hyoscyami Semen；hyoscyamine；scopo1amine；macro-porous resin

R284.2

A

1001-1528（2015）01-0089-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.01.018

2014-06-17

新疆維吾爾自治區(qū)科技支撐項目（201433104）

李 巖（1969—），女，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：藥物新劑型與新制劑。Te1：（0991）4362442，E-mai1：ykd1y@ 126.com

王長虹（1964—），男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：中藥新劑型與體內(nèi)過程。Te1：（021）51322511，E-mai1：wchcxm @163.com