體外試驗評價甘草對腸黏膜P-糖蛋白的影響

李秀瓊，孫亞彬，劉思佳，張繼平

1.佛山市中醫(yī)院藥劑科，廣東 佛山 528000 2.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院藥物臨床試驗機構(gòu)，廣東 廣州 510515 3.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 廣州 510515 4.南方醫(yī)科大學(xué)附屬佛山醫(yī)院，廣東 佛山 528000

體外試驗評價甘草對腸黏膜P-糖蛋白的影響

李秀瓊1，孫亞彬2，劉思佳3，張繼平4

1.佛山市中醫(yī)院藥劑科，廣東 佛山 528000 2.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院藥物臨床試驗機構(gòu)，廣東 廣州 510515 3.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 廣州 510515 4.南方醫(yī)科大學(xué)附屬佛山醫(yī)院，廣東 佛山 528000

目的：觀察甘草對P-糖蛋白（P-gp）底物經(jīng)大鼠不同區(qū)段腸黏膜透過性的差異，以評價其對腸黏膜P-gp功能的影響。方法：通過對大鼠口服甘草煎液、生理鹽水一周后，使用體外擴散池（Ussing Chamber）技術(shù)評價羅丹明123（R123）和熒光素鈉（CF）經(jīng)大鼠空腸回腸結(jié)腸黏膜的經(jīng)時吸收方向和分泌方向的透過量和表觀滲透系數(shù)。R123和CF在接受室的濃度用熒光分光光度計檢測。結(jié)果：R123的透過性比較中，甘草組與生理鹽水組組內(nèi)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=5.602，P=0.000）。CF的透過性比較中，甘草組組內(nèi)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=20.140，P=0.000）。結(jié)論：甘草對底物藥物R123的影響可能與存在于腸黏膜的P-gp有關(guān)，這可能是甘草與藥物產(chǎn)生協(xié)同作用的機制之一。

甘草；Ussing Chamber技術(shù)；P-糖蛋白（P-gp）

中醫(yī)學(xué)素有“十方九草，無草不成方”之說，甘草配伍其他藥物有增強藥物療效的作用。許立等［1］研究提示了甘草對肝藥酶有誘導(dǎo)作用。由于多藥耐藥蛋白P-糖蛋白（P-gp）的底物特異性很大程度上與細(xì)胞色素P450相似［2］，二者有很多重疊的底物，所以研究甘草對腸黏膜P-gp產(chǎn)生的影響是非常有意義的。因此，筆者采用體外擴散池（Ussing cham ber）實驗技術(shù)的方法來分析甘草對P-gp底物經(jīng)大鼠不同區(qū)段腸黏膜的透過的影響，找出甘草對P-gp底物藥物吸收影響的可能機理之一。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 羅丹明123（R123，批號046K3688），熒光素鈉（CF，批號047K0676），羥乙基哌嗪乙硫磺酸緩沖液（Hepes）｛（2-［4-（2-Hydroxyethyl）-1-piperazine］ethanesulfonic acid，批號 016K54331）｝，Trizm a base［Tris（hydroxyethyl am inom ethane），批號103K5411］。以上試劑均采購自美國Sigm a公司。二甲基亞砜（DMSO）購自廣州化學(xué)試劑廠，戊巴比妥鈉購自中國醫(yī)藥（集團）上海化學(xué)試劑廠，其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備 熒光分光光度儀（美國W aters公司，型號為474）；CQ-20超聲波清洗器（明珠電器）；TGL-16B臺式離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；單向電容運轉(zhuǎn)電動機（上海非標(biāo)電機有限公司）；7m LUssing cham ber裝置（Harvard，美國）。

1.3 藥物溶液的制備

1.3.1 甘草提取液 甘草稱重后加入15倍量的蒸餾水，浸泡90m in，煮沸，煎煮60m in后藥液冷卻用布氏漏斗過濾，再將提取液用蒸發(fā)皿濃縮至1 L相當(dāng)于原生藥500 g，即甘草水煎液，得到的甘草液中甘草劑量為500 g/L。

1.3.2 Hepes-Tris緩沖液配制 取Hepes 6 g，溶于800m L蒸餾水中，使之完全溶解。通入混合氣體（95%O2∶5%CO2）10 m in后，加入1.8 m L KCl（3 m ol/L），1.8 m L CaCl2（1 m ol/L），0.8m LM gSO4（1m ol/L），8.18 g NaCl，完全溶解，用Tris溶液（1 mol/L）調(diào)節(jié)pH至7.4，再加入5 m L葡萄糖溶液（1 m ol/L），用蒸餾水稀釋至1000m L，混勻，即得。

1.3.3 實驗用藥物溶液 分別將稱量好的R123或CF溶解在pH7.4的 O2/CO2氣體飽和的 Hepes-Tris緩沖液中，Hepes-Tris緩沖液需每天制備，R123或CF的最終濃度均為4m g/L。

1.4 動物分組及處理 W istar大鼠，雄性，體重為（250±20）g，由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號為SCXK粵2006-0015。動物實驗的方法符合南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會的有關(guān)規(guī)定和要求。

Ussing cham ber實驗。R123組：使用Ussing Cham ber實驗法，取離體大鼠腸黏膜，檢測灌胃給藥1周后，120m in內(nèi)R123經(jīng)大鼠空腸、回腸、結(jié)腸黏膜的經(jīng)時透過量。將大鼠隨機分成2組：甘草組及生理鹽水組。灌胃給藥（20m L/kg），每天2次，連續(xù)7天。觀察各組大鼠一般情況并記錄大鼠每天體重變化。大鼠給予樣品1周后，禁食16～18 h，3%戊巴比妥鈉（32m g/kg）腹腔注射麻醉，空腸組：大鼠取Treitz韌帶處行空腸置管；回腸組：自回盲部向上25 cm處置管；結(jié)腸組：行結(jié)腸置管。在腸段前端插入硅膠管（內(nèi)徑2mm）結(jié)扎，腸段末端剪開一小口，之后緩慢地用0.9%生理鹽水沖洗腸段2次、通入空氣4次，分離腸段置Hepes-Tris緩沖液中，冰浴培養(yǎng)5m in，剪取3～4 cm長的腸段，迅速分離剝離筋膜層，將腸黏膜固定于擴散池上。吸收方向?qū)嶒灂r（轉(zhuǎn)運方向為從黏膜側(cè)到漿膜側(cè)，M-S），黏膜側(cè)加入7m LR123-Hepes溶液，漿膜側(cè)加入7m LHepes緩沖液；分泌方向?qū)嶒灂r（轉(zhuǎn)運方向為：從漿膜側(cè)到黏膜側(cè)，S-M），漿膜側(cè)黏膜側(cè)所加溶液與吸收方向?qū)嶒灂r所加的溶液相反。在混合氣體（95%O2∶5%CO2）的情況下以及37.5℃水浴保溫下，分別于15、30、45、60、75、90、120m in在接收側(cè)取樣（0.5m L），同時補充0.5m L 37.5℃的Hepes-Tris緩沖液。各份取樣后的樣品于冰箱中保存直到進行熒光分析。CF組：使用Ussing Cham ber實驗法，取離體大鼠腸黏膜，觀察灌胃給藥一周后，120m in內(nèi)CF經(jīng)大鼠腸黏膜的經(jīng)時透過量，方法與R123組相同。

1.5 定量方法的建立

1.5.1 R123和CF的測定方法學(xué)考察 測定R123的熒光強度的波長為：激發(fā)波長為485 nm，發(fā)射波長為535 nm。R123在（10～200）μg/L范圍內(nèi)，熒光強度對濃度進行回歸，回歸方程：Y=0.2237X+2.5658（r2=0.9993），線性關(guān)系良好，回收率和日內(nèi)精密度分別為99.9%和0.9%。測定CF的熒光強度的波長為：激發(fā)波長480 nm，發(fā)射波長為520 nm。CF在（200～2000）μg/L范圍內(nèi)，熒光強度對濃度進行回歸，回歸方程：Y=0.6386X+0.0679（r2=1），線性關(guān)系良好，回收率和日內(nèi)精密度分別為99.8%和2.3%。

1.5.2 累計滲透量及表觀滲透系數(shù)的測定 將熒光分析法測定的每個樣品進行數(shù)據(jù)處理，得到給定時間吸收方向（漿膜側(cè)）的藥物濃度Ctn1和分泌方向（黏膜側(cè)）的藥物濃度Ctn2，用下列公式計算累計透過量（Qtn）：Qtn=∑［0.1Ctn-1］+7Ctn（其中0.1和7代表取樣體積和加入藥液量，分別為0.1m L和7 m L）。根據(jù)給藥劑量D，計算累計透過百分率（Qtn/D×100%），并繪制經(jīng)時累計透過百分率曲線圖。表觀滲透系數(shù)（Papp）是表示藥物經(jīng)黏膜透過能力的重要指標(biāo)，計算公式為Papp=（dQ/dt）×（1/AC0），其中dQ/dt表示穩(wěn)態(tài)時時間-累計透過量線性回歸所得的斜率，A為有效滲透面積，C0為加入藥液側(cè)初始藥物濃度。

2 實驗結(jié)果

2.1 生理鹽水組對R123經(jīng)不同區(qū)段腸黏膜透過的影響

2.1.1 R123經(jīng)大鼠空腸黏膜透過 見圖1。R123經(jīng)大鼠空腸黏膜吸收方向（M-S）和分泌方向（S-M）的經(jīng)時曲線計算得到S-M組及M-S組的表觀滲透系數(shù)Papp（×10-5，cm/s）分別為1.16±0.46和0.28±0.15，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=10.233，P=0.000），分泌是透過的（5.69±4.13）倍。

2.1.2 R123經(jīng)大鼠回腸黏膜透過 見圖1。R123經(jīng)大鼠回腸腸黏膜吸收方向（M-S）和分泌方向（S-M）的經(jīng)時曲線計算得到M-S組及S-M組表觀滲透系數(shù)Papp（×10-5，cm/s）分別為0.64±0.16和 2.07±0.92，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=9.333，P=0.000）。分泌是透過的（3.51±2.20）倍。

2.1.3 R123經(jīng)大鼠結(jié)腸黏膜透過 見圖1。R123經(jīng)大鼠結(jié)腸黏膜吸收方向（M-S）和分泌方向（S-M）的經(jīng)時曲線計算得到M-S組及S-M組表觀滲透系數(shù)Papp（×10-5，cm/s）分別為0.51±0.68和 1.00±0.52，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=0.866，P=0.000）。分泌是透過的（2.02±0.84）倍。

2.2 生理鹽水組對CF經(jīng)不同區(qū)段腸黏膜透過的影響

2.2.1 CF經(jīng)大鼠空腸黏膜透過 見圖2。CF經(jīng)大鼠空腸黏膜吸收方向（M-S）和分泌方向（S-M）的經(jīng)時曲線計算得到M-S組及S-M組表觀滲透系數(shù)Papp（×10-5，cm/s）分別為1.96± 1.55和1.28±0.16，分泌方向CF的透過能力同吸收方向差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2.2 CF經(jīng)大鼠回腸黏膜透過 見圖2。CF經(jīng)大鼠回腸黏膜吸收方向（M-S）和分泌方向（S-M）的經(jīng)時曲線計算得到M-S組及S-M組表觀滲透系數(shù)Papp（×10-5，cm/s）分別為2.64± 0.13和2.4±0.24，ER為0.91±0.09，分泌方向CF的透過能力同吸收方向差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2.3 CF經(jīng)大鼠結(jié)腸黏膜透過 見圖2。CF經(jīng)大鼠結(jié)腸黏膜吸收方向（M-S）和分泌方向（S-M）的經(jīng)時曲線計算得到M-S組及S-M組表觀滲透系數(shù)Papp（×10-5，cm·s-1）分別為2.81± 0.2和2.42±0.34，分泌方向CF的透過能力同吸收方向差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3 甘草組對R123經(jīng)不同區(qū)段腸黏膜Papp比較

圖1 生理鹽水組對R123經(jīng)大鼠不同區(qū)段腸黏膜透過圖

圖2 生理鹽水組對CF經(jīng)不同區(qū)段結(jié)腸黏膜透過圖

2.3.1 R123經(jīng)空腸轉(zhuǎn)運的Papp的影響 見表1。各組R123分泌方向和吸收方向累計透過率隨時間呈遞增關(guān)系，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=10.189，P=0.000）。分泌與吸收方向中，甘草組透過率均顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（分泌方向：F=14.897，P=0.009）；吸收方向（F=26.124，P=0.005）。吸收方向中，甘草透過率均有顯著差異（P=0.005）。不同分組間Papp有顯著差異（F=7.974，P=0.000）。

2.3.2 R123經(jīng)回腸轉(zhuǎn)運的Papp的影響 見表1。各組R123分泌方向和吸收方向累計透過率隨時間呈遞增關(guān)系，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=15.021，P=0.000）。分泌和吸收方向中，各組差異均無顯著性（P＞0.05）。不同分組間Papp差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=7.974，P=0.000），

2.3.3 R123經(jīng)結(jié)腸轉(zhuǎn)運的Papp的影響 見表1。各組R123分泌方向和吸收方向累計透過率隨時間呈遞增關(guān)系，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=24.568，P=0.000）。分泌方向和吸收方向中，各組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 甘草對R123經(jīng)不同區(qū)段腸黏膜Papp比較 %

2.4 甘草組對CF經(jīng)不同區(qū)段腸黏膜Papp比較

2.4.1 CF經(jīng)空腸轉(zhuǎn)運的Papp的影響 見表2。各組R123分泌方向和吸收方向累計透過率隨時間呈遞增關(guān)系，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）。分泌與吸收方向中，甘草組透過率均顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（分泌方向F=14.987，P=0.009；吸收方向：F=20.147，P=0.005）。吸收方向中，甘草透過率均有顯著差異（P=0.006）。不同分組間Papp有顯著性差異（F=7.974，P=0.000）。

2.4.2 CF經(jīng)回腸轉(zhuǎn)運的Papp的影響 見表2。各組R123分泌方向和吸收方向累計透過率隨時間呈遞增關(guān)系，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=6.258，P=0.000）。分泌方向和吸收方向中，各組差異均無顯著性意義（P＞0.05）。不同分組間Papp差異顯著（F= 7.974，P=0.000）。

2.4.3 CF經(jīng)結(jié)腸轉(zhuǎn)運的Papp的影響 見表2。各組R123分泌方向和吸收方向累計透過率隨時間呈遞增關(guān)系，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=8.249，P=0.000）。分泌方向和吸收方向中，各組差異均無顯著性意義（P＞0.05）。

表2 甘草對CF經(jīng)不同區(qū)段腸黏膜Papp比較±s） %

表2 甘草對CF經(jīng)不同區(qū)段腸黏膜Papp比較±s） %

腸段空腸回腸結(jié)腸組別M-S S-M M-S S-M M-S S-M 15min 0.08±0.05 0.17±0.18 0.06±0.02 0.15±0.20 0.10±0.04 0.09±0.12 30min 0.19±0.10 0.28±0.27 0.12±0.04 0.26±0.27 0.16±0.07 0.23±0.17 45min 0.34±0.13 0.46±0.45 0.20±0.10 0.46±0.38 0.25±0.15 0.38±0.27 60min 0.60±0.22 0.62±0.60 0.32±0.15 0.71±0.54 0.34±0.18 0.57±0.37 75min 0.86±0.30 0.80±0.70 0.45±0.22 1.00±0.65 0.46±0.23 0.78±0.45 90min 1.15±0.39 1.06±0.94 0.61±0.27 1.34±0.78 0.61±0.27 1.05±0.57 120min 1.78±0.63 1.48±1.14 0.99±0.45 2.05±1.11 0.99±0.32 1.60±0.79

3 討論

Ussing cham ber技術(shù)是建立在大鼠腸黏膜基礎(chǔ)上，可以用于預(yù)測藥物在人體吸收的一個有效的手段。Watanabe E等［3］通過擴散池實驗得到了15種水溶性及脂溶性藥物的Papp并比較了與人吸收系數(shù)（Fa）的相關(guān)性。結(jié)果表明，實驗藥物的Papp與Fa之間存在良好的相關(guān)性。P-gp在藥物處置（吸收，分布，排泄）中發(fā)揮著極其重要的作用，其具有廣泛的底物，抑制劑和誘導(dǎo)劑，因此在聯(lián)合用藥過程中常會出現(xiàn)影響藥物臨床療效的P-gp分子水平上的競爭性或非競爭性藥物相互作用。因此在藥物間和食物間相互作用以及在制劑處方設(shè)計中不可忽視P-gp這個關(guān)鍵因素。

R123是P-gp的典型底物，由于其檢測方便，在細(xì)胞模型中評價P-gp中已廣泛應(yīng)用。本實驗通過體外Ussing cham ber技術(shù)，測得R123在空腸、回腸、結(jié)腸中的轉(zhuǎn)運滲透系數(shù)分泌方向大于吸收方向，與國際上研究的結(jié)果一致，表明存在泵出系統(tǒng)：其在小腸中的轉(zhuǎn)運是以分泌為主，顯示以R123為底物藥物來預(yù)測口服藥物在腸內(nèi)轉(zhuǎn)運與P-gp的關(guān)系是可行的。而熒光素鈉（CF）則作為對照藥物進行實驗。這是由于兩者的轉(zhuǎn)運機制不同，R123是主動轉(zhuǎn)運且是ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白的一種外排轉(zhuǎn)運蛋白P-gp的底物；而CF是被動轉(zhuǎn)運（細(xì)胞旁路途徑）。而且這兩種化合物容易分析，都具有可見光范圍的熒光，檢測靈敏度高。因此選用CF作為對照。

在本試驗中，大鼠灌胃甘草后，R123在不同腸段間與生理鹽水組比較，透過性不同。一方面是表明甘草中的某些成分可能改變了細(xì)胞膜通透性，從而改變了R123雙方向的滲透，另外可能是由于甘草對腸道內(nèi)不同腸段內(nèi)中的影響使R123的滲透能力存在部位差及P-gp在不同腸道區(qū)段的含量不同所導(dǎo)致。因此，這可能是甘草與某些藥物合用產(chǎn)生協(xié)同作用的機理之一。而在評價甘草對CF影響的實驗中，甘草對CF經(jīng)不同腸段腸黏膜轉(zhuǎn)運的吸收方向及分泌方向的透過性與生理鹽水比較，均無顯著差異（P＞0.05）。因此表明甘草可能對旁細(xì)胞通路不產(chǎn)生影響。

通過以上實驗分析可知：甘草對腸黏膜P-gp起一定的誘導(dǎo)作用。P-gp是藥物外排泵，能夠使其介導(dǎo)的藥物分泌增加，吸收減小。但是筆者只做了一種濃度的藥液，而很多藥物對P-gp的影響都具有濃度依賴性和飽和性，因此，在未來的實驗中，應(yīng)該增加更多濃度的藥液的相關(guān)實驗以及在體實驗。

致謝：在本項目的研究中，得到南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院藥學(xué)部博士生導(dǎo)師李國鋒教授的悉心指導(dǎo)，深表感謝！

［1］許立，孫曉進，王志剛.甘草、海藻相伍用對小鼠肝藥酶的影響［J］.遼寧中醫(yī)藥雜志，1998（2）：84-85.

［2］繆海均，劉皋林.P-糖蛋白與藥代動力學(xué)［J］.中國藥房，2002，13（1）：49-51.

［3］W atanabe E，TakahashiM，HayashiM.A possibility to predict the absorbability of poorly w ater-soluble drugs in hum ans based on rat intestinalperm eability assessed by an in vitro chamberm ethod［J］.Eur JPharm Biopharm，2004，58：659-665.

（責(zé)任編輯：駱歡歡）

R285.5

A

0256-7415（2015）06-0276-04

10.13457/j.cnki.jncm.2015.06.129

2014-11-15

國家自然科學(xué)基金項目（81073061）；南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院院長基金項目（2012C028）；廣東省醫(yī)學(xué)科研基金項目（B2013244）

李秀瓊（1977-），女，主管中藥師，主要從事中藥藥理與臨床應(yīng)用研究工作。

張繼平，E-mail：fszjping@163.com。