羅丹明類染料-磷鉬酸復合納米微粒的合成、表征及應用

潘宏程， 朱俊杰, 姜立萍*

(生命分析化學國家重點實驗室，南京大學化學化工學院，江蘇南京 210093)

羅丹明類染料因具有光穩(wěn)定性好、熒光量子產(chǎn)率高，以及三線激發(fā)態(tài)形成程度較低等優(yōu)點，在化學與生物分析領域得到了較為廣泛的應用[1，2]。利用該類染料與金屬離子形成離子締合物，發(fā)展了一系列測定金屬離子的萃取光度法和催化光度法[3，4]。利用羅丹明染料的熒光特性可建立高靈敏的熒光光度法[5，6]，也可以通過氧化活化使熒光增強，用于測定金屬離子[7]。

羅丹明類染料在水溶液中帶正電荷，能與磷鉬酸(PMA)根陰離子結(jié)合生成離子締合物。PMA與羅丹明B(RhB)、丙酮、明膠、聚乙烯醇等形成的有機溶劑膠束包合絡合物在592 nm波長處顯色，可用于微量磷的測定[8]。劉保生等[9]利用十二烷基苯磺酸鈉存在下，吖啶橙-羅丹明6G(R6G)發(fā)生有效能量轉(zhuǎn)移，使R6G的熒光大大增強，而酸性條件下PMA與R6G形成的離子締合物使R6G的熒光猝滅，從而建立了測定痕量磷的能量轉(zhuǎn)移熒光法。蔣治良等[10]發(fā)現(xiàn)在硫酸介質(zhì)中，PMA與羅丹明S形成的締合物在610 nm處的共振光散射急劇增強，表明PMA-羅丹明S締合物有可能形成微納米級的結(jié)構(gòu)。在疏水作用力和靜電引力下，羅丹明類染料與PMA形成離子締合物后能進一步形成大的微粒。羅丹明類染料分子聚集在締合物微粒中產(chǎn)生強烈的電子耦合效應，導致共振增強的光散射現(xiàn)象。這類有機-無機雜化復合納米材料表現(xiàn)出優(yōu)異的光電性能和生物親和性，為高靈敏度的化學與生物分析提供了嶄新的研究思路。但是與其廣闊的應用前景相比，羅丹明類染料-PMA復合納米材料的制備和性能的研究還相當匱乏。

本研究制備了R6G -PMA和RhB-PMA復合納米微粒，并用掃描電鏡(SEM)、紫外-可見(UV-Vis)吸收光譜、熒光光譜、共振光散射(RLS)光譜對復合納米微粒進行了表征。制備了R6G -PMA修飾玻碳電極(R6G -PMA/GCE)，并研究了H2O2在R6G -PMA/GCE上的電化學行為，建立了一種測定H2O2的計時電流分析新方法。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

GHI660B電化學工作站(上海辰華儀器有限公司),采用三電極系統(tǒng):R6 G-PMA/GCE(Φ=3 mm)為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑柱電極為對電極。TGL-16型高速離心機(江蘇金壇市中大儀器廠)；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(河南予華儀器有限公司)；KAWH古川9050超聲波清洗器；DHG -9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱；8-S1型磁力攪拌器(江蘇金壇市環(huán)宇科技儀器廠)。

殼聚糖，磷酸鹽緩沖溶液(PBS)(0.1 mol/L，pH=7.48)，羅丹明B(RhB)，羅丹明6G(R6G)(上海華藍化學)；磷鉬酸(PMA，國藥集團化學試劑有限公司)；抗壞血酸(0.001 mol/L，西隴化工有限公司)；H2O2(0.001 mol/L，西隴化工有限公司)；尿酸(0.001 mol/L，上海華藍化學)。所用其它試劑均為分析純以上。實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 羅丹明類染料-PMA復合納米微粒的制備

稱取0.1 mmol的RhB或R6G于100 mL燒杯中，加入40 mL乙醇，攪拌溶解。再稱取0.2 g PMA于另一燒杯中，加入10 mL二次水溶解。當兩者分別溶解完全后，迅速混合，于40 ℃恒溫水浴中攪拌反應2 h。自然冷卻后，以4 000 r/min離心5 min，沉淀用15 mL 50%的乙醇反復洗滌、離心，最后沉淀在40 ℃下烘干4 h，得到暗紅色的羅丹明類染料-PMA復合納米微粒。將干燥后的RhB-PMA和R6G -PMA復合納米微粒各取0.0065 g，超聲分散于5 mL 50%的乙醇中，待用。

1.3 R6G -PMA復合納米微粒修飾玻碳電極的制備

將玻碳電極(GCE)先用金相砂紙(1#～7#)逐級拋光，再依次用粒度為1.0、0.3、0.05 μm的α-Al2O3懸濁液在麂皮上拋光至鏡面。每次拋光后先洗去表面污物，再移入超聲水浴中清洗，每次2～3 min，重復三次，最后依次用乙醇(1+1)、HNO3(1+1)和二次水超聲清洗后，電極在0.5～1.0 mol/L的H2SO4中用循環(huán)伏安法活化(電位掃描范圍1.0～-0.2 V)，反復掃描直至達到穩(wěn)定的循環(huán)伏安曲線為止。然后在0.20 mol/L的KNO3溶液中記錄在1.0×10-3mol/L K3[Fe(CN)6]溶液中的循環(huán)伏安曲線，以測試電極性能。掃描速度50 mV/s，電位掃描范圍-0.2～0.9 V，所得循環(huán)伏安曲線中的峰電位差在80 mV以下。

將0.0065 g R6G-PMA復合納米材料超聲分散于5 mL 50%的乙醇中。移取100 μL該溶液與50 μL 1%殼聚糖溶液(溶于1%乙酸)混合均勻。滴加5 μL該混合溶液于已處理好的GCE表面，自然晾干，即得R6G -PMA/GCE。

2 結(jié)果與討論

2.1 掃描電子顯微鏡表征

圖1A為RhB-PMA復合納米微粒的掃描電鏡(SEM)照片。從圖中可以看出，RhB-PMA復合納米微粒表面光滑，呈近似球形和橢球形，堆積成三維有空隙的結(jié)構(gòu)。圖1B給出了隨機選取的50個RhB-PMA復合納米微粒的粒徑分布圖，其平均粒徑為343±144 nm。

圖1 RhB-PMA復合納米微粒的SEM圖(A)和粒徑分布圖(B)Fig.1 SEM image (A) and diameter distribution (B) of RhB-PMA hybrid nanoparticles

2.2 紫外-可見吸收光譜

圖2為R6G、RhB、R6G -PMA和RhB-PMA在50%的乙醇中的紫外-可見(UV-Vis)吸收光譜。R6G和RhB的最大吸收峰分別為526 nm和553 nm(圖2A)。當R6G、RhB與PMA形成復合納米微粒時，吸收峰分別紅移至562 nm和555 nm(圖2B)，表明R6G、RhB與PMA發(fā)生了締合作用。這種作用力可能主要來自R6G、RhB的正電荷與PMA所帶負電荷之間的靜電引力，以及R6G、RhB分子之間的疏水作用力。

圖2 (A)R6G、RhB的紫外-可見光譜；(B)R6G -PMA和RhB-PMA(b)復合納米微粒的紫外-可見光譜Fig.2 (A)UV-Vis spectra of R6G and RhB;(B)UV-Vis spectra R6G -PMA and RhB-PMA hybrid nanoparticles

2.3 熒光和共振光散射光譜

R6G -PMA和RhB-PMA復合納米微粒都表現(xiàn)出優(yōu)異的熒光性能。R6G -PMA和RhB-PMA納米微粒的熒光峰分別位于581 nm和580 nm，分別見圖3和圖4。與相應的羅丹明類染料分子相比(R6G熒光峰為525 nm，RhB熒光峰為550 nm)，復合納米微粒的熒光峰都發(fā)生了紅移，這與吸收光譜的結(jié)果相符。進一步研究了R6G -PMA和RhB-PMA復合納米微粒的共振光散射(RLS)效應。結(jié)果表明，R6G和RhB溶液的RLS信號很微弱，這是因為R6G和RhB染料分子在溶液中散射截面很小，主要為Rayleigh散射。但是R6G、RhB與PMA締合后，聚集成幾百納米的微粒，其RLS信號急劇增強，R6G -PMA和RhB-PMA分別在581 nm和654 nm產(chǎn)生最大RLS峰。

根據(jù)Parkash等人[11]用量子理論對染料聚集體引起的RLS增強現(xiàn)象的研究，聚集體的尺寸和電子耦合強度是影響RLS的主要因素。R6G -PMA和RhB-PMA復合納米微粒由于靜電引力和疏水作用力而發(fā)生聚集，形成粒徑可達數(shù)百納米的復合物微球(圖1)。在聚集體中，由于羅丹明類染料具有共軛大π鍵，相鄰染料分子之間強烈的電子耦合會導致很強的共振光散射現(xiàn)象。

圖3 R6G -PMA復合納米微粒的熒光(a)和共振光散射(b)光譜Fig.3 Fluorescence(a) and RLS(b) spectra of R6G -PMA hybrid nanoparticles

圖4 RhB-PMA復合納米微粒的熒光(a)和共振光散射(b)光譜Fig.4 Fluorescence (a) and RLS (b) spectra of RhB-PMA hybrid nanoparticles

2.4 R6G -PMA復合納米微粒修飾電極的H2O2傳感器

采用R6G -PMA復合納米微粒修飾GCE，構(gòu)建了一種新型的H2O2電化學傳感器。圖5A給出了不同濃度的H2O2在R6G -PMA/GCE上的循環(huán)伏安圖，支持電解質(zhì)為pH=7的0.1 mol/L PBS。無H2O2時，R6G -PMA/GCE上無明顯氧化電流產(chǎn)生；隨著H2O2的加入，R6G -PMA/GCE的氧化電流增大。由于裸GCE上H2O2的氧化電流很弱，因此R6G -PMA/GCE對H2O2的氧化有明顯的催化作用。

另外，采用計時電流法考察了R6G -PMA/GCE對H2O2的電流-時間(i-t)響應情況(圖5B)。在0.9 V工作電位下，R6G -PMA/GCE對H2O2具有快速的響應，信號達到95%的時間小于4 s，且當H2O2濃度在3.3×10-6～5.6×10-5mol/L范圍內(nèi)時呈線性響應(圖5C)，其線性方程為:I(μA)=1.366+0.1553c(10-6mol/L)，相關系數(shù)r2為0.9921，檢出限(3σ)為2.0×10-8mol/L。

同時，進一步考察了常見干擾物質(zhì)尿酸(UA)和抗壞血酸(AA)對H2O2測定的影響(圖5D)。在H2O2濃度為3.3×10-6mol/L時，等量的UA和10倍的AA對H2O2測定的影響<1%。這說明R6G -PMA/GCE對H2O2的測定有較好的選擇性。

圖5 (A)H2O2在R6G -PMA/GCE上的循環(huán)伏安圖；(B)R6G -PMA/GCE上持續(xù)加入3.3×10-6 mol/L H2O2的i -t響應曲線；(C)催化電流與H2O2濃度的線性關系；(D)尿酸(UA)和抗壞血酸(AA)對H2O2測定的影響Fig.5 (A) Cyclic voltammograms of the R6G -PMA/GCE with different concentrations of H2O2;(B) i -t response curve for successive addition of 3.3×10-6 mol/L H2O2 for R6G -PMA/GCE in 0.1 mol/L PBS(pH=7) at the applied potential of 0.9 V;(C) Plots of the electrocatalytic current vs H2O2 concentration;(D) Effect of uric acid and ascorbic acid on the detection of H2O2

3 結(jié)論

合成了R6G -PMA和RhB-PMA兩種復合納米微粒，研究了羅丹明類染料-PMA復合納米微粒的光學性能，結(jié)果表明這一類復合納米微粒具有非常好的熒光和共振光散射增強效應。羅丹明類染料與PMA通過靜電引力和疏水作用力相互結(jié)合，形成納米級的聚集體。在聚集體中，由于羅丹明類染料具有共軛大π鍵，相鄰染料分子之間強烈的電子耦合效應會導致很強的共振光散射現(xiàn)象。這類復合納米微粒有望成為新型的熒光和RLS探針應用于生物分子檢測、免疫標記等領域。我們構(gòu)建了R6G -PMA/GCE的H2O2電化學傳感器。R6G -PMA/GCE對H2O2的氧化有明顯的催化作用，并且對尿酸和抗壞血酸有較好的抗干擾能力。