冷凍水產(chǎn)品中乙萘酚殘留的測定與降解規(guī)律

劉伶俐， 洪 波*， 楊羅輝， 王冬武， 高 峰， 羅 玲， 劉 麗， 李曉玲

(1.湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所，湖南長沙 410153;2.長沙環(huán)境保護(hù)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙 410004)

乙萘酚(2-Naphthol)是萘的2位氫被羥基取代后形成的化合物，是1-萘酚的異構(gòu)體，主要用于制作防老劑乙萘酚、有機(jī)顏料及殺菌劑，同時(shí)作為防腐劑被廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)，其污染載體涉及大氣、水體以及食品。乙萘酚作為食品添加劑在使用量和使用途徑上沒有嚴(yán)格的控制和規(guī)范的管理。雖然水產(chǎn)品中暫未出現(xiàn)相關(guān)報(bào)道，但出于對水產(chǎn)品質(zhì)量安全以及人體健康的考慮，建立乙萘酚在冷凍水產(chǎn)凍中的殘留檢測方法意義重大。

目前乙萘酚的測定方法主要有高效液相色譜[1，2]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[3]、氣相色譜-質(zhì)譜法[4]、直接熒光光度法[5]，此外還有毛細(xì)管區(qū)帶電泳法[6]，而用于水產(chǎn)品中乙萘酚的檢測方法未見報(bào)道。本文借鑒水果、蔬菜、水體的測定方法，擬建立一種準(zhǔn)確、簡便的檢測方法來測定水產(chǎn)品中乙萘酚殘留物。乙萘酚在食品當(dāng)中殘留時(shí)間長、降解速率慢。本實(shí)驗(yàn)期望通過測定不同添加濃度和儲(chǔ)存時(shí)間的乙萘酚樣品的殘留量，揭示冷凍水產(chǎn)品中乙萘酚的自然降解規(guī)律。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Waters e2695高效液相色譜儀(美國，Waters公司)，配熒光檢測器(FD)；Q-101平行蒸發(fā)器(瑞士，Buchi公司)；Z323K高速冷凍離心機(jī)(德國，Hemel公司)；KQ5200DE超聲波清洗器(昆山超聲波儀器廠)；C18柱(500 mg/3mL，美國Varian科技有限公司)；LC-NH2固相萃取柱(500 mg/3mL，美國Varian科技有限公司)。

乙萘酚標(biāo)準(zhǔn)品(99%，國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心)。取乙萘酚標(biāo)準(zhǔn)品配制成質(zhì)量濃度為100 μg/mL的貯備液，再分別移取適量的貯備液配制成質(zhì)量濃度分別為0.50、1.00、2.00、5.00、10.00 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。甲醇、乙腈、正己烷、乙酸乙酯(色譜純，美國Tedia 公司)；甲苯(色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)；酸化乙腈：在1 L乙腈中加入8 mL 50%HCl；乙腈-甲苯溶液：乙腈和甲苯按體積比3∶1混合。實(shí)驗(yàn)用水為超純水(≥18.2 MΩ·cm)。

1.2 樣品制備

取出冷凍水產(chǎn)品供試樣品，在常溫下自然解凍，取適量的樣品制成細(xì)小、均勻的魚糜樣。

1.3 樣品提取與凈化

稱取5.00 g(±0.02 g)的樣品置于50 mL離心管中，加入15 mL酸化乙腈，勻漿30 s，35 ℃超聲提取10 min，5 000 r/min離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至平行蒸發(fā)管中，重復(fù)提取1 次，上清液合并至蒸發(fā)管中，經(jīng)40 ℃平行蒸發(fā)至近干，加入3 mL乙腈-甲苯溶液溶解殘留物。

將蒸發(fā)管置于-60 ℃超低溫冰箱中，冷凍處理15 min，取出后立即將液體全部轉(zhuǎn)移至使用5 mL 乙腈、5 mL 乙腈-甲苯溶液活化的LC-NH2固相萃取柱，用4.00 mL乙腈-甲苯溶液洗脫，40 ℃氮?dú)獯抵粮?，?.00 mL流動(dòng)相溶解后，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，供高效液相色譜儀分析。

1.4 色譜條件

色譜柱：Inertil ODS-SP C18柱(250×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈∶水=50∶50(V/V)；柱溫：35 ℃；流速：0.80 mL/min；進(jìn)樣量：30 μL；檢測波長：λex=250 nm，λem=410 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長的確定

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，掃描乙萘酚標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光光譜，結(jié)合樣品基質(zhì)的響應(yīng)強(qiáng)度，確定方法的激發(fā)波長為激發(fā)波長λex=250 nm，發(fā)射波長λem=410 nm。

2.2 提取溶液與提取方式的選擇

目前乙萘酚樣品的處理方式主要是有機(jī)試劑浸提[7]、溴酸鉀-羅丹明6G催化[8]等方式。實(shí)驗(yàn)以乙腈-水、乙腈及酸化乙腈做提取劑進(jìn)行對比試驗(yàn)。在相同條件下，以乙腈-水配制成體積比分別為70∶30、50∶50、30∶70的提取液分次提取后，加入乙酸乙酯進(jìn)行反萃取，離心后上下層之間有乳白色絮狀物形成，影響提取效果，且乙酸乙酯的反萃取效率較低，回收率僅為20.3%；乙腈分次提取的效果明顯好于乙腈-水，回收率在65.5%左右，但在提取如南美白對蝦、鰻鱺等脂肪、蛋白質(zhì)含量高的樣品時(shí)易在提取液下層形成一定體積的油狀物，從而對樣品濃縮和定容造成影響；采用酸化乙腈較好地解決了蛋白質(zhì)乳化影響，分次提取后濃縮的樣品色譜圖干擾峰極少，回收率較高，均在70.3%以上。實(shí)驗(yàn)選用酸化乙腈作為乙萘酚樣品的提取溶劑。

2.3 凈化方式的選擇

乙萘酚樣品的凈化以固相萃取、液液萃取、分散液相微萃取等方式為主。實(shí)驗(yàn)分別對C18柱凈化、冷凍去脂與LC-NH2固相萃取組合凈化兩種方式進(jìn)行了比較。前一種方式在樣品濃縮后分別加入3 mL甲醇和3 mL乙腈-甲苯溶液分次溶解殘留物，經(jīng)C18柱凈化；后者直接采用乙腈-甲苯溶液溶解，冷凍去脂與LC-NH2固相萃取組合凈化處理。結(jié)果顯示：前者的分析圖譜無干擾影響，但回收率始終低于65.1%；而后一種方式處理的各類樣品的回收率均在70%以上，且樣品在此色譜條件下分離效果更好，滿足分析要求。因此確立酸化乙腈提取、冷凍去脂與LC-NH2固相萃取組合凈化的方式。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線與方法檢出限

按1.4節(jié)的儀器條件對系列標(biāo)準(zhǔn)工作液分別進(jìn)樣分析，以峰面積對濃度作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，以3 倍信噪比(S/N)計(jì)算檢出限。結(jié)果表明：乙萘酚的方法檢出限為0.10 mg/kg，在0.50～10.00 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，其峰面積與質(zhì)量濃度線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2=0.9998。

2.5 回收率與精密度

以草魚、鰻鱺、南美白對蝦的陰性樣品添加0.50、1.00、5.00 mg/kg 3 個(gè)濃度的乙萘酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度做3個(gè)平行，按1.3節(jié)進(jìn)行處理。計(jì)算出乙萘酚加標(biāo)樣品的平均回收率為74.8%～91.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.5%～9.4%，均滿足實(shí)驗(yàn)室藥物殘留檢測的要求，相關(guān)數(shù)據(jù)如表1所示。

2.6 實(shí)際樣品的測定

在通過對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和添加樣品反復(fù)試驗(yàn)驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性和可靠性的基礎(chǔ)上，采用本方法對3 個(gè)批發(fā)市場隨機(jī)抽取的20 個(gè)冷凍樣品進(jìn)行分析測定，結(jié)果均為陰性。

表1 冷凍水產(chǎn)品中乙萘酚的添加回收率及精密度

圖1 乙萘酚的降解率曲線圖Fig.1 Degradation rate of 2-naphthal

2.7 乙萘酚降解試驗(yàn)

在空白樣品中添加1.00、10.0、50.0 mg/kg 3個(gè)濃度水平乙萘酚，每個(gè)濃度做5個(gè)平行，進(jìn)行冷凍水產(chǎn)品中乙萘酚的降解試驗(yàn)。對樣品進(jìn)行24、48、72、168 h和240 h取樣測定，整個(gè)試驗(yàn)過程樣品保持在閉光冷凍狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)表明1.00、10.0、50.0 mg/kg 3個(gè)濃度的降解速率按添加水平由高到低成比例關(guān)系，分別為50.0 mg/kg >10.0 mg/kg>1.00 mg/kg，降解率如圖1所示，3個(gè)濃度在24 h均有明顯下降，在48 h趨近平緩，之后物質(zhì)的降解不明顯，殘留水平穩(wěn)定。

3 結(jié)論

采用高效液相色譜-熒光檢測法測定冷凍水產(chǎn)品中的乙萘酚殘留，以酸化乙腈提取可有效地去除樣品中蛋白質(zhì)的影響，同時(shí)具有較高的提取效率；冷凍去脂和LC-NH2固相萃取組合凈化處理的方式避免了液夜萃取存在的耗時(shí)長、成本高、有機(jī)試劑用量大等問題。方法簡便、有效，能有效去除復(fù)溶液中脂肪類物質(zhì)的干擾；采用Inertil ODS-SP C18柱作為固定相，以乙腈-水(50∶50，V/V)作為流動(dòng)相，為本方法提供了高分離度。該方法簡便、穩(wěn)定、處理成本低、回收率高，能滿足水產(chǎn)品中乙萘酚的殘留檢測。乙萘酚殘留物穩(wěn)定性試驗(yàn)采用空白樣品添加，避光冷凍儲(chǔ)存24、48、72、168和240 h后取樣測定。發(fā)現(xiàn)在5 個(gè)時(shí)間段的測定結(jié)果，除在24 h時(shí)有一個(gè)明顯下降之后，殘留物的濃度變化不大，降解率不明顯，表明乙萘酚殘留物在冷凍避光的情況下穩(wěn)定性好，具有持續(xù)的污染能力。