超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定水和沉積物中磺胺類(lèi)、喹諾酮類(lèi)和氯霉素類(lèi)抗生素殘留

尹燕敏， 沈穎青， 朱月芳， 秦宏兵

(1.蘇州市環(huán)境監(jiān)測(cè)中心,江蘇蘇州 215004;2.江蘇省環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，江蘇南京 210036)

抗生素是人們接觸最為頻繁、用量最大的一類(lèi)藥物，其環(huán)境行為和效應(yīng)已受到關(guān)注[1]。該類(lèi)藥物通過(guò)多種途徑進(jìn)入環(huán)境后，可抑制環(huán)境中有益微生物的活性，刺激病原菌產(chǎn)生抗藥性，從而對(duì)陸生或水生生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生負(fù)面效應(yīng)[2]。環(huán)境中的抗生素長(zhǎng)期存在可直接影響到飲用水的安全，并通過(guò)食物鏈潛在影響人體健康。進(jìn)入水環(huán)境中的抗生素不僅種類(lèi)繁多，且多以ng/L級(jí)的低濃度存在[3，4]，而沉積物則基體復(fù)雜。因此，急需水環(huán)境及沉積物中抗生素殘留靈敏、準(zhǔn)確、快速的分析方法，為抗生素環(huán)境行為(分布、遷移轉(zhuǎn)化、降解動(dòng)態(tài)、生物富集)和生態(tài)效應(yīng)的研究提供必要的技術(shù)手段。

迄今為止，國(guó)內(nèi)對(duì)環(huán)境中抗生素的報(bào)道多為分析方法研究[5 - 10]，對(duì)于污染水平研究還很欠缺，也沒(méi)有一個(gè)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法可以參照。本研究結(jié)合實(shí)際情況，將固相萃取(SPE)及加速溶劑萃取技術(shù)(ASE)與超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)相結(jié)合，建立水和底泥中20種常見(jiàn)抗生素的分析方法，通過(guò)優(yōu)化樣品分離、富集和凈化等前處理?xiàng)l件，以及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜等相關(guān)參數(shù)，建立靈敏度高、選擇性好、準(zhǔn)確度高的痕量藥物檢測(cè)方法。運(yùn)用建立的方法調(diào)查蘇州市地表水及底泥樣品中20種目標(biāo)藥物殘留狀況，并進(jìn)行結(jié)果分析，為后續(xù)研究提供技術(shù)和數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

UPLC-XEVO-TQMS超高效液相色譜三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)，Waters公司)；Caliper Autotrace SPE(6位)；Dionex ASE-300型加速溶劑萃取儀 (美國(guó))，配34 mL 和66 mL萃取池；EYELA MG-2200氮吹儀。

磺胺嘧啶、磺胺-5-甲氧基嘧啶、磺胺-2-甲基嘧啶、磺胺甲基異惡唑、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嗪、磺胺乙酰、磺胺噻唑、磺胺吡唑、磺胺氯噠嗪、磺胺二甲異惡唑、磺胺喹惡啉、氧氟沙星、諾氟沙星、洛美沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、甲砜霉素、氟甲砜霉素及氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品，均購(gòu)于Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。乙腈、甲醇、甲酸為色譜純(Merck公司)；氫氧化鈉、乙酸銨為優(yōu)級(jí)純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 樣品處理

1.2.1地表水樣品水樣前處理采用固相萃取。固相萃取小柱依次用6 mL二氯甲烷、6 mL甲醇、6 mL甲酸溶液(pH=3)進(jìn)行活化。水樣經(jīng)0.45 μm 濾膜過(guò)濾后取500 mL水樣，加入0.5 g EDTA，調(diào)pH后過(guò)小柱，富集完成后用10 mL水淋洗，氮吹20 min，用12 mL洗脫液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液氮?dú)獯抵两珊笥贸跏剂鲃?dòng)相定容至1 mL，過(guò)0.2 μm膜后，進(jìn)樣分析。

1.2.2沉積物樣品沉積物樣品處理采用加速溶劑萃取。取5 g新鮮底泥樣品冷凍干燥后加入無(wú)水硫酸鈉，再加入1 g弗羅里硅土，混勻后裝入66 mL的萃取池中。所用溶劑為乙腈與乙酸乙酯(1∶1，V/V)，溫度80 ℃，壓力1 500 psi，預(yù)熱5 min，靜態(tài)提取5 min，重復(fù)2次，用40 mL溶劑快速?zèng)_洗樣品，氮?dú)獯祾呤占刻崛∫汉?，將其吹至近干，初始流?dòng)相定容至1 mL，過(guò)0.2 μm膜后，進(jìn)樣分析。

1.3 儀器條件

色譜條件：UPLC BEH C18色譜柱(50×2.1 mm,1.7 μm);流動(dòng)相:10 mmol/L乙酸銨(0.01%甲酸)(A相)和乙腈(B相)，流速為0.4 mL/min。梯度條件：0 min，95%A；7.0 min，80%A；7.5 min，80%A；8 min，0%A；8.5 min，95%A。柱溫35 ℃；進(jìn)樣量5 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)；霧化氣、脫溶劑氣、錐孔氣為氮?dú)?，碰撞氣為氬氣；源溫度和脫溶劑氣溫度分別為150 ℃和500 ℃ ；脫溶劑流速和錐孔氣流速分別為1 000和50 L/h；毛細(xì)管電壓為3.5 kV。檢測(cè)方式為MRM模式。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行分析?；前奉?lèi)及喹諾酮類(lèi)抗生素在正離子模式下，全掃描的分子離子[M+H]+最理想，而氯霉素類(lèi)在負(fù)離子模式下的分子離子[M-H]-理想，因此對(duì)于兩類(lèi)目標(biāo)化合物分別選用[M+H]+及[M-H]-作碰撞誘導(dǎo)解離的母離子。在MS/MS模式下，優(yōu)化錐孔電壓、碰撞電壓、毛細(xì)管電壓、錐孔電壓、離子源溫度、脫溶劑溫度等條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 目標(biāo)化合物的質(zhì)譜條件

2.2 色譜條件優(yōu)化

用液相色譜-質(zhì)譜法分析磺胺類(lèi)及喹諾酮抗生素常用的流動(dòng)相為甲酸水溶液與乙腈或甲醇按比例混合。但是氯霉素類(lèi)抗生素采用ESI-模式測(cè)定，酸的加入影響ESI-的靈敏度。傳統(tǒng)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用采用ESI-分析時(shí)，流動(dòng)相中適當(dāng)加入銨鹽可改善目標(biāo)分析物的電離情況，增強(qiáng)ESI-的靈敏度。當(dāng)水相中同時(shí)添加乙酸銨和甲酸時(shí)，有利于目標(biāo)分析物的分子離子化，目標(biāo)化合物的色譜峰峰形得到極大改善。

本實(shí)驗(yàn)考察了以乙腈-10 mmol/L乙酸銨(分別含0、0.01%、0.02%、0.05%和0.1%甲酸)作為流動(dòng)相對(duì)目標(biāo)化合物的影響。結(jié)果表明在甲酸含量為0時(shí)，喹諾酮類(lèi)無(wú)法洗脫，隨著甲酸濃度增加，目標(biāo)化合物的響應(yīng)有所下降，同時(shí)峰形展寬。根據(jù)峰形、響應(yīng)強(qiáng)度及分離度等因素，綜合考慮選擇乙腈-10 mmol/L乙酸銨(0.01%甲酸)為流動(dòng)相。

2.3 地表水樣品前處理優(yōu)化

影響固相萃取富集效率的因素有固相萃取小柱類(lèi)型、樣品pH、上樣速度等，采用空白加標(biāo)對(duì)上述因素進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)分別考察了HLB柱和普通C18柱對(duì)目標(biāo)化合物的萃取效果，研究發(fā)現(xiàn)HLB柱對(duì)目標(biāo)化合物的萃取效率高于C18柱。因此，本文采用HLB柱對(duì)樣品進(jìn)行富集和凈化。比較了樣品pH為3和7的空白加標(biāo)水樣的提取效率。發(fā)現(xiàn)pH為3時(shí)的提取效率優(yōu)于pH為7的效率，因此水樣用1 mol/L H2SO4調(diào)至pH等于3。實(shí)際水樣中通常含有一定量的金屬離子，易與抗生素螯合，給提取帶來(lái)困難，利用EDTA能有效降低抗生素與金屬離子的螯合。以Cu2+、Fe3+、Zn2+、Mg2+做干擾試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)有上述離子存在時(shí)，目標(biāo)化合物的回收率為11.4%～59.6%；加入EDTA后，回收率為68.4%～92.1%，且結(jié)果相對(duì)穩(wěn)定，所以本實(shí)驗(yàn)中加入EDTA以絡(luò)合部分金屬離子。分別用甲醇、乙腈和酸化的甲醇(0.01%甲酸)作為洗脫液進(jìn)行洗脫，發(fā)現(xiàn)使用甲醇和乙腈洗脫效率低于酸化的甲醇，因此，洗脫液采用含0.01%甲酸的甲醇溶液。上樣流速分別為5、10 mL/min時(shí)，空白加標(biāo)的回收率沒(méi)有顯著差異，選擇上樣速率為10 mL/min。

2.4 沉積物樣品前處理優(yōu)化

首先，準(zhǔn)確稱(chēng)取5.0 g底泥樣品，置于50 mL離心管中。加入10 mL乙腈/水(25∶75,V/V)溶液(用稀氨水調(diào)節(jié)至pH=10)，渦旋1 min，超聲提取15 min后，4 ℃離心10 min(4 500 r/min)。取出上清液，殘?jiān)偌尤?0 mL提取溶液，重復(fù)上述步驟。但是由于離心效果不好，無(wú)法實(shí)現(xiàn)分離。因此，采用加速溶劑萃取處理沉積物樣品。選用甲醇/乙酸乙酯(1∶1,V/V)，甲醇/丙酮(1∶1,V/V)，乙腈作為提取劑考察提取效率。發(fā)現(xiàn)以甲醇/乙酸乙酯作為提取劑時(shí)，喹諾酮類(lèi)和氯霉素類(lèi)的提取效率滿意，而磺胺類(lèi)的提取效率介于12.5%～60.3%；采用甲醇/丙酮作為提取劑時(shí)，氯霉素類(lèi)的提取效率滿意，而磺胺類(lèi)的16.4%～66.4%，喹諾酮類(lèi)的提取效率介于16.4%～37.1%；采用乙腈作為提取劑時(shí)，大部分磺胺類(lèi)的提取效率滿意，氯霉素類(lèi)的提取效率滿意，而喹諾酮類(lèi)的提取效率介于18.7%～30.9%。采用乙腈與乙酸乙酯混合作為提取溶劑，優(yōu)化乙腈與乙酸乙酯的比例，選擇乙腈與乙酸乙酯比例分別為5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1時(shí)，發(fā)現(xiàn)隨著乙酸乙酯的比例增加喹諾酮類(lèi)的回收率逐漸增加，而磺胺類(lèi)的回收率逐漸下降，而氯霉素類(lèi)的回收率則影響不大。綜合考慮，最終選擇乙腈與乙酸乙酯的比例為8∶2。

在其它萃取條件不變的情況下，選擇60、70、80、100 ℃ 4個(gè)提取溫度進(jìn)行研究，結(jié)果表明提取溫度對(duì)樣品加標(biāo)回收率的影響很大。當(dāng)提取溫度超過(guò)60 ℃，大部分化合物的加標(biāo)回收率明顯提高，但當(dāng)溫度超過(guò)80 ℃時(shí)提取雜質(zhì)增多，結(jié)果重復(fù)性差。與60、70、100 ℃時(shí)相比，80 ℃的提取效果較好，除磺胺醋酰、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺氯噠嗪外，樣品的加標(biāo)回收率均在40%～130%之間。這可能是由于隨著溫度的升高，溶劑的粘度下降，從而加強(qiáng)了溶劑浸潤(rùn)基質(zhì)和溶解目標(biāo)分析物的能力。加入的熱能同時(shí)也有助于破壞目標(biāo)化合物與基質(zhì)之間的作用力，增強(qiáng)目標(biāo)分析物從基質(zhì)表面擴(kuò)散到溶劑中的能力，從而提高萃取回收率。但隨著溫度進(jìn)一步提高，可能促進(jìn)了部分抗生素的分解，導(dǎo)致回收率降低，所以實(shí)驗(yàn)選擇最佳提取溫度為80 ℃。

2.5 方法線性范圍和檢出限

將抗生素儲(chǔ)備液(1 000 mg/L)用初始流動(dòng)相稀釋為0.5～50 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，按照1.3節(jié)的儀器條件進(jìn)行分析。以定量離子對(duì)的響應(yīng)面積(Y)和對(duì)應(yīng)濃度(X)進(jìn)行線性回歸得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明在此范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。以3倍信噪比(S/N≥3)估算方法檢出限，水樣和沉積物中20種目標(biāo)化合物的方法檢出限分別為0.01～0.50 ng/L和0.005～0.2 μg/kg之間，其線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限等見(jiàn)表2。

表2 目標(biāo)化合物的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及方法檢出限

2.6 方法精密度及加標(biāo)回收率

取空白水樣，分別制得濃度為4.0、40.0和100 ng/L加標(biāo)水平的加標(biāo)樣品，按照1.2節(jié)方法進(jìn)行樣品前處理，外標(biāo)法定量計(jì)算，每個(gè)濃度水平重復(fù)測(cè)定6次，得到添加濃度水平為4.0～100 ng/L時(shí)，各目標(biāo)化合物的平均回收率在68.0%～132%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.27%～16.0%；取空白土壤樣品，分別制得濃度為1.0，10.0和50.0 μg/kg加標(biāo)水平的加標(biāo)樣品，按照1.2節(jié)方法進(jìn)行樣品前處理，外標(biāo)法定量計(jì)算，每個(gè)濃度水平重復(fù)測(cè)定6次，得到添加濃度水平為1.0～50.0 μg/kg時(shí)，各目標(biāo)化合物的平均回收率在45.3%～110%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.94%～20.5%，結(jié)果顯示了較好的回收率與精密度，可滿足地表水和沉積物中抗生素檢測(cè)的要求。

2.7 實(shí)際樣品分析

應(yīng)用本方法對(duì)蘇州地區(qū)東太湖流域、陽(yáng)澄湖及京杭大運(yùn)河蘇州段等不同來(lái)源20余個(gè)點(diǎn)位的地表水及底泥樣品進(jìn)行分析測(cè)定。結(jié)果表明，對(duì)于地表水樣品，共有磺胺乙酰、磺胺甲基異惡唑、磺胺鄰二甲氧嘧啶、甲砜霉素、氟甲砜霉素、氧氟沙星、恩諾沙星、洛美沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星10種抗生素檢出，濃度范圍為0.79～240 ng/L，其中檢出濃度最高的是磺胺類(lèi)抗生素磺胺鄰二甲氧嘧啶，檢出率最高的是氟甲砜霉素，檢出率為100%；對(duì)于沉積物樣品，共有磺胺嘧啶、磺胺-5-甲氧基嘧啶、磺胺甲基異惡唑、磺胺鄰二甲氧嘧啶、甲砜霉素、氟甲砜霉素、氧氟沙星、恩諾沙星、洛美沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星11種抗生素檢出，濃度范圍為0.37～27.0 μg/kg，其中檢出濃度最高的是磺胺類(lèi)抗生素磺胺鄰二甲氧嘧啶，檢出率最高的是氟甲砜霉素，檢出率為100%。在所有樣品中，各個(gè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)都有不同濃度和組成的藥物殘留，表明了這些藥物在生產(chǎn)、消費(fèi)、處方和使用等模式上的區(qū)域差異，與其他藥物相比，檢出比例達(dá)80%以上的抗生素是磺胺類(lèi)藥物磺胺甲基異惡唑及氯霉素類(lèi)藥物甲砜霉素和氟甲砜霉素。證明了此類(lèi)藥物的廣泛使用。

3 結(jié)論

建立了水樣和沉積物樣品中喹諾酮和磺胺類(lèi)抗生素的超高效液相色譜三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用分析方法。該方法在9 min 內(nèi)完成對(duì)20種目標(biāo)化合物的分析，對(duì)于水樣和沉積物樣品的方法檢出限分別在0.01～0.50 ng/L和0.005～0.2 μg/kg之間，外標(biāo)法定量準(zhǔn)確性較好，地表水和相應(yīng)的沉積物測(cè)定結(jié)果表明地表水和沉積物中已經(jīng)受到抗生素污染。