MAPK信號(hào)通路在肺炎衣原體感染小鼠中的作用

吳俊等

[摘要] 目的 研究MAPK信號(hào)通路在肺炎衣原體（CP）感染APOE基因敲除（APOE）小鼠促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化形成中的作用。 方法 48只APOE小鼠分為感染-高脂組、高脂組、感染組和對(duì)照組，每組12只，喂養(yǎng)20周，采用Western blot和Real time-PCR法檢測(cè)胞外信號(hào)調(diào)控激酶（p-ERK1/2）、p-P38的蛋白表達(dá)和白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子（TNF-α）的基因的表達(dá)。 結(jié)果 感染-高脂組、高脂組、感染組APOE小鼠的主動(dòng)脈IL-6和TNF-α水平明顯高于對(duì)照組（P < 0.05）。與對(duì)照組比較，感染-高脂組、高脂組、感染組p-ERK1/2、p-P38蛋白表達(dá)的水平顯著降低（P < 0.05）。 結(jié)論 CP感染激發(fā)和加重動(dòng)脈內(nèi)炎性反應(yīng)可促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化，MAPK信號(hào)通路是CP促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的潛在機(jī)制。

[關(guān)鍵詞] 動(dòng)脈粥樣硬化；白介素-6；絲裂原活化蛋白激酶

[中圖分類號(hào)] R543.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2015）09（a）-0015-05

[Abstract] Objective To investigate the role of MAPK in APOE mice induced atherosclerosis （AS） by chlamydia pneumoniae （CP） infection. Methods Forty-eight APOE mice were divided into four groups including CP infection and hyperlipidemia group， hyperlipidemia group， CP infection group and control group， each group had 12 mice. The mice were sacrificed at 20 week of age. Western blot and Real time-PCR were used to detect the p-ERK1/2， p-P38 protein expression and the gene expression of IL-6， TNF-α. Results The levels of IL-6 and TNF-α in CP infection and hyperlipidemia group， hyperlipidemia group， CP infection group were significantly higher than those in control group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Compared with the control group， the levels of p-ERK1/2， p-P38 protein expression in CP infection and hyperlipidemia group， hyperlipidemia group， CP infection group significantly reduced， with statistically significant differences （P < 0.05）. Conclusion Infection with CP may contribute to AS by the initiation and progression of the inflammatory reaction within the artery. MAPK is a potential mechanism of CP induced AS.

[Key words] Atherosclerosis； IL-6； MAPK

當(dāng)今心腦血管疾病的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)，隨著全球人口老齡化的進(jìn)程和生活飲食習(xí)慣的改變，發(fā)病人群有逐年增加和年輕化的趨勢(shì)[1-2]。動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）作為心腦血管疾病的病變基礎(chǔ)，其發(fā)病機(jī)制至今仍不明確[3-5]。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外一些研究發(fā)現(xiàn)，肺炎衣原體（chlamydia pneumoniae，CP）感染可能參與動(dòng)脈粥樣硬化病變的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程[6]。

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。MAPK信號(hào)通路在調(diào)控心血管疾病的研究中日益受到人們的重視。筆者以往研究已經(jīng)證實(shí)，CP可以加速小鼠AS的形成。在此基礎(chǔ)上本研究進(jìn)一步探討MAPK信號(hào)通路在CP對(duì)高脂誘導(dǎo)的APOE小鼠AS發(fā)病過(guò)程中的作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及分組

48只健康雄性APOE小鼠，5周齡，體重15～18 g，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（鄂）2004-0028]，飼養(yǎng)條件：溫度18～25℃，相對(duì)濕度50%～80%，每日光照12 h，攝食、飲水自由。普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，再按照隨機(jī)化原則將APOE小鼠分為4組，每組12只。對(duì)照組：常規(guī)飼料喂養(yǎng)，接種0.01 mol/L，pH 7.4 PBS緩沖液；感染組：常規(guī)飼料喂養(yǎng)，接種CP；高脂組：高脂飼料喂養(yǎng)，接種0.01 mol/L，pH 7.4 PBS緩沖液；感染-高脂組：高脂飼料喂養(yǎng)，接種CP。

1.2 飼料配方

飼料普通飲食由同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。高脂飲食按照Godfrey配方：脂肪21.00%，膽固醇0.15%，基礎(chǔ)飼料78.85%[7]。

1.3 肺炎衣原體培養(yǎng)

肺炎衣原體菌株（ATCC VR-1310），購(gòu)于上海慧穎生物科技有限公司，在Hep-2細(xì)胞中傳代培養(yǎng)，每0.5毫升凍存在-80℃冰箱至接種。接種物的濃度為1×107包涵體單位。將CP懸浮液及PBS緩沖液以鼻內(nèi)途徑接種小鼠。

1.4 實(shí)驗(yàn)室試劑

pH 7.4 PBS緩沖液配方：NaCl 8.0 g，KH2PO4 0.2 g，Na2HPO4·12H2O 2.9 g，KCl 0.2 g將這些試劑按次序加入定量容器中，加適量蒸餾水溶解后，再定容至1000 mL，調(diào)pH值至7.4，高壓消毒滅菌后備用。Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。蛋白雜交PVDF膜購(gòu)自美國(guó)Intergen公司。預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自Bio-Rad公司。Western雜交顯影用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑購(gòu)自Pierce公司。各種限制性內(nèi)切酶購(gòu)自大連寶生物TaKaRa公司。其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.5 生化指標(biāo)檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)在小鼠5、15和20周時(shí)進(jìn)行，各組小鼠眼眶后竇靜脈取血于EP管中，立即在4℃下3000 r/min離心10 min，取上層血清，用生化儀行總膽固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇檢測(cè)。

1.6 動(dòng)脈標(biāo)本采集

以2%戊巴比妥（30 mg/kg）經(jīng)腹腔麻醉小鼠，眼球摘除法獲得血液標(biāo)本，各組取5只20周小鼠用生理鹽水及4%多聚甲醛從左心室逆行灌注固定主動(dòng)脈后，自主動(dòng)脈根部至腹主動(dòng)脈末端離斷整個(gè)主動(dòng)脈。

1.7 免疫印跡法

采用Trizol試劑盒抽提純化各樣本蛋白質(zhì)。①制SDS-聚丙烯酞胺凝膠緩沖液；②處理樣品；③拔出梳子，將處理好的樣品依一定次序加入點(diǎn)樣孔中，同時(shí)點(diǎn)樣Bio-Rad預(yù)染蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)5 μL作為分子量參照；④接通電源，垂直電泳分離蛋白質(zhì)，開(kāi)始時(shí)電壓80 V，樣品進(jìn)入分離膠后電壓加大到110 V。⑤配制1×轉(zhuǎn)膜緩沖液，倒入托盤中；⑥電泳完成后，取出玻璃夾心，拆卸凝膠夾層，去除積層膠，切一塊與凝膠大小相同的PVDF膜和2張濾紙；⑦組裝轉(zhuǎn)印夾層；⑧將轉(zhuǎn)印夾夾緊，放入電泳槽中，25 V電壓下4℃轉(zhuǎn)膜過(guò)夜，將蛋白質(zhì)通過(guò)電轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)至PVDF膜上；⑨將膜放入封閉液中室溫下封閉2～3 h；⑩TBS-T洗膜后，加入單克隆抗體（1∶2000稀釋），4℃搖動(dòng)過(guò)夜；用TBS-T于室溫下洗膜4次，每次15 min；加入辣根過(guò)氧化物酶（HRPO）偶聯(lián)的羊抗兔IgG抗體（1∶8000稀釋）；采用化學(xué)發(fā)光底物進(jìn)行發(fā)光顯跡。

1.8 Real-time PCR法

采用Trizol試劑盒抽提純化各樣本總RNA。采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，TNF-α：上游 5'-TGTTCA-TCCATTCTCTACCC-3'，下游5'-TCACTGTCCCAGC-ATCTTGT-3'；IL-6：上游 5'-AGTCACAGAAGGAGT-GGCTAAG-3'，下游5'-GAGGAATGTCCACAAACTGATA-3'；GAPDH：上游 5'-ACCACAGTCCATGCCA-TCAC-3'，下游5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。反應(yīng)體系是由7.2 μL DEPC水、10 μL SYBR Green Realtime PCR Master Mix、0.4 μL上游引物、0.4 μL下游引物和2 μL cDNA組成。反應(yīng)條件：95℃ 30 s預(yù)溫，95℃ 20 s、60℃ 20 s和72℃ 20 s做40個(gè)循環(huán)，72℃ 4 min退火。TNF-α含量（%）=TNF-α/GAPDH×100%；IL-6含量（%）=IL-6/GAPDH×100%。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中小鼠體重變化

感染-高脂組、高脂組、感染組和對(duì)照組小鼠5、10、15、20周體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），表明對(duì)于APOE小鼠無(wú)論高脂飲食還是CP感染，對(duì)小鼠體重均無(wú)明顯影響。也就是說(shuō)，AS的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中體重不會(huì)發(fā)生顯著變化。見(jiàn)圖1。

2.2 各組APOE小鼠血脂水平比較

5、15周齡時(shí)各組總膽固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。20周齡時(shí)，高脂組和感染-高脂組總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇水平顯著高于對(duì)照組（P < 0.01），高密度脂蛋白膽固醇水平低于對(duì)照組（P < 0.05）；感染-高脂組的三酰甘油水平明顯高于對(duì)照組（P < 0.05），高脂組和感染組的三酰甘油水平與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；感染組各指標(biāo)水平與對(duì)照組間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。提示CP感染可以加重因高脂引起的AS血脂濃度。見(jiàn)表1。

2.3 各組20周齡動(dòng)脈粥樣硬化小鼠主動(dòng)脈TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)水平比較

感染-高脂組、高脂組、感染組APOE小鼠主動(dòng)脈IL-6和TNF-α mRNA含量明顯高于對(duì)照組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。提示高脂飲食引起APOE小鼠體內(nèi)IL-6和TNF-α mRNA含量升高，CP感染也可以引起或加重高脂血癥小鼠IL-6和TNF-α mRNA水平的升高。高脂組、感染組和感染-高脂組IL-6和TNF-α mRNA水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見(jiàn)表2、圖2。

2.4 各組APOE小鼠p-P38和p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平比較

感染-高脂組、高脂組、感染組APOE小鼠p-P38和p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平均明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；感染-高脂組、高脂組、感染組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。提示高脂飲食引起APOE小鼠體內(nèi)p-P38和p-ERK1/2表達(dá)水平降低，CP感染也可以引起或加重高脂血癥小鼠p-P38和p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平的降低。提示CP感染可能是通過(guò)減少肝臟中p-P38和p-ERK1/2的表達(dá)來(lái)促進(jìn)AS的發(fā)生發(fā)展。見(jiàn)表3、圖3。

3 討論

AS的發(fā)生發(fā)展與炎癥相關(guān)，例如，CP、巨細(xì)胞病毒（HCMV）、幽門螺桿菌（Hp）等一些感染性因素有可能是AS的危險(xiǎn)因子，尤其是CP感染，可促發(fā)人類心血管系統(tǒng)疾病的炎性反應(yīng)。CP是一種嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生的病原體，通常引起上呼吸道和肺部感染[8-11]。CP經(jīng)過(guò)呼吸道侵入到機(jī)體，再被單核巨噬細(xì)胞識(shí)別、吞噬，跟隨血液循環(huán)侵入血管壁，可感染內(nèi)皮細(xì)胞，參與AS的發(fā)病[12-14]。

活化MAPK通過(guò)磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞骨架蛋白及酶類等參與細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化及凋亡的調(diào)節(jié)，并與炎癥、腫瘤等多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)。MAPK在介導(dǎo)炎癥過(guò)程中的激活和細(xì)胞因子生成中起著重要作用。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中MAPK亞族主要包括ERK1/2、JNK、p38和ERK5，這幾條通路之間存在相互協(xié)調(diào)、相互調(diào)控的關(guān)系[15-17]。ERK通路參與應(yīng)激刺激、細(xì)菌產(chǎn)物、炎癥介質(zhì)等引起的細(xì)胞反應(yīng)，表明ERK通路的激活與炎癥密切相關(guān)[18]。JNK通路能被生長(zhǎng)因子、脂多糖（LPS）、TNF-α、IL-1、熱休克等激活。p38通路能被LPS、生血細(xì)胞因子[促紅細(xì)胞生成素（EPO）]和IL-3、致炎細(xì)胞因子、細(xì)菌成分、熱休克等激活。LPS介導(dǎo)的細(xì)胞炎性反應(yīng)是一個(gè)典型的病原體與機(jī)體相互作用的過(guò)程。LPS刺激細(xì)胞激活ERK、JNK和P38，然后作用于各自的底物，影響多種轉(zhuǎn)錄因子的活性，從而調(diào)節(jié)包括TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等多種細(xì)胞因子在內(nèi)的基因的表達(dá)。而TNF-α、IL-1、花生四烯酸（arachdonic acid，AA）產(chǎn)物、內(nèi)皮素等多種炎癥介質(zhì)能激活不同MAPK，通過(guò)促進(jìn)或抑制基因的轉(zhuǎn)錄來(lái)調(diào)控其他炎癥介質(zhì)的生成。最近，MAPK信號(hào)通路在調(diào)控心血管疾病的研究方面日益受到人們的重視[19]。

本研究表明，AS的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中體重?zé)o顯著變化。在血脂方面，小鼠20周齡時(shí)，感染-高脂組相比于對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這說(shuō)明CP感染可以加重因高脂引起的AS血脂濃度。感染-高脂組、感染組和高脂組APOE小鼠的主動(dòng)脈IL-6和TNF-α mRNA含量明顯高于對(duì)照組（P < 0.01）。說(shuō)明高脂飲食引起APOE小鼠體內(nèi)的IL-6、TNF-α mRNA含量升高，CP感染也可以引起或加重高脂血癥小鼠的IL-6、TNF-α mRNA水平的升高。感染-高脂組、感染組和高脂組APOE小鼠p-P38、p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組（P < 0.05），其三組間蛋白水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。提示高脂飲食引起APOE小鼠體內(nèi)的p-P38、p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平的降低，CP感染也可以引起或加重高脂血癥小鼠p-P38、p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平的降低。因而，CP感染是通過(guò)減少p-P38、p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平來(lái)促進(jìn)AS的發(fā)生發(fā)展。研究表明，在CP感染APOE小鼠過(guò)程中MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路具有重要作用[20]。MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可通過(guò)P38和ERK來(lái)促進(jìn)小鼠的AS[21]。

綜上所述，筆者推測(cè)CP感染誘導(dǎo)APOE小鼠的AS機(jī)制可能與MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活有關(guān)。但CP感染誘導(dǎo)APOE小鼠AS中的作用還需要進(jìn)一步研究，其聯(lián)系以及相互作用機(jī)制的闡明將為探索AS有效防治途徑提供新線索。

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