茶葉生產(chǎn)廢料中表沒食子兒茶素沒食子酸酯的純化工藝

許敏等

摘要：分析了茶葉生產(chǎn)廢料中表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）的純化工藝，并采用大孔樹脂對其進(jìn)行分離純化。結(jié)果表明，運(yùn)用靜態(tài)吸附與動態(tài)吸附相結(jié)合的方法分析得到，適用于茶葉生產(chǎn)廢料中EGCG分離純化用的大孔吸附樹脂為D101。其最佳分離純化條件為：將20.0 mg/mL上柱液以1.5 BV/h上柱4.5 BV，使用20%乙醇以0.5 BV/h洗脫4.0 BV。

關(guān)鍵詞：茶葉生產(chǎn)廢料；表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）；純化

中圖分類號：S571.1；TS272.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）18-4570-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.18.045

茶葉是恩施土家族苗族自治州的六大經(jīng)濟(jì)支柱產(chǎn)業(yè)之一，在其生產(chǎn)過程中會產(chǎn)生大量的廢料——茶梗、茶末、茶樹修剪枝條等。這些廢料因含有表沒食子兒茶素沒食子酸酯（以下簡稱EGCG）而極具開發(fā)價值[1]。據(jù)文獻(xiàn)報道，EGCG具有抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、對糖尿病腎臟的保護(hù)、防輻射等作用，還可以降壓、降脂、降血糖[2-7]。為了綜合開發(fā)茶葉資源，促進(jìn)恩施州茶葉產(chǎn)業(yè)鏈的有效延伸，增加當(dāng)?shù)夭柁r(nóng)的收入，采用當(dāng)?shù)禺a(chǎn)量大、價格低廉的茶葉生產(chǎn)廢料提取EGCG，并對其提取工藝進(jìn)行研究，以期更有效地開發(fā)利用茶葉廢料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶葉生產(chǎn)廢料購于恩施市清江生物有限公司。大孔樹脂：D608、 HPD100、 XDA-1、 D302、 D101B、D609、D103、D102、D4020、DM130、D101、D301、X-5及聚酰胺型樹脂（上海摩速科學(xué)器材有限公司）。

EGCG標(biāo)準(zhǔn)品（批號：100603，含量≥98%，上海融禾醫(yī)藥科技有限公司提供）；水為純化水；甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑為分析純。

1.2 儀器

DIONEX U3000 高效液相色譜儀（Chromeleon色譜工作站），Acclaim 120 C18 5 μm Analytical （4.6 mm×250 mm）色譜柱，VWD3100檢測器； MS105 半微量天平（感量0.01 mg，METTLER TOLEDO）；AL204 分析天平（感量0.1 mg，METTLER TOLEDO）；LGJ-10凍干機(jī)（北京四環(huán)科學(xué)儀器廠）；KQ-2500超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司，33 kHz）；UV2600紫外可見分光光度計（上海天美科學(xué)儀器有限公司）；微孔濾膜（有機(jī)系，0.22 μm）。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密稱取EGCG標(biāo)準(zhǔn)品適量，置于棕色量瓶中，加甲醇溶解制成濃度為0.3 mg/mL的溶液，搖勻，微孔濾膜過濾，取濾液作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液。取5、10、15、20、25 μL標(biāo)準(zhǔn)品溶液參照文獻(xiàn)[8]的色譜條件分別測定峰面積，平行測定3次。以進(jìn)樣量X（μg）為橫坐標(biāo)軸、峰面積A為縱坐標(biāo)軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算其線性回歸方程。

1.3.2 EGCG測定方法 稱取茶葉生產(chǎn)廢料細(xì)粉0.2 g，置于10 mL棕色量瓶中，加甲醇超聲提取30 min，放冷，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，微孔濾膜過濾，取濾液測定峰面積并帶入回歸方程計算茶葉生產(chǎn)廢料中EGCG的含量。

1.3.3 EGCG提取方法 取茶葉生產(chǎn)廢料粗粉10 g置于索氏提取器中，參照文獻(xiàn)[9]的方法提取2次，趁熱抽濾，合并濾液，減壓濃縮至無乙醇味，得茶葉生產(chǎn)廢料提取液。

1.3.4 EGCG純化工藝

1）樹脂的篩選。對大孔樹脂進(jìn)行預(yù)處理[10，11]，分別量取預(yù)處理好的大孔樹脂10 mL，置250 mL具塞錐形瓶中，加入100 mL已知EGCG濃度的茶葉生產(chǎn)廢料提取液，25 ℃、100 r/min振蕩24 h后取出，測定EGCG吸附量，并計算比吸附量（比吸附量=EGCG吸附量/樹脂體積）；靜態(tài)吸附完成后，過濾除去茶葉生產(chǎn)廢料提取液，將樹脂重新置于250 mL具塞錐形瓶中，加入100 mL 95%乙醇以25 ℃、100 r/min振蕩24 h取出，測定EGCG解吸量，計算解析率（解析率=被解析EGCG量/被吸附EGCG量×100%）。選擇比吸附量大且解析率高的大孔樹脂作為分離純化EGCG的樹脂。

2）吸附條件優(yōu)化。改變樣品的濃度、上樣速度對吸附條件進(jìn)行優(yōu)化[10，11]。分別取60 mL篩選出的樹脂裝入3根玻璃柱，充分沉降均勻，將樣品溶液以一定速度通過樹脂柱，前150 mL流出液不收集，后每15 mL收集1份，分別取5 μL測定EGCG峰面積，繪制曲線圖，確定上樣濃度及上樣速度。根據(jù)確定的上樣濃度和上樣速度進(jìn)行動態(tài)吸附，并測定EGCG峰面積，繪制泄露曲線。

3）洗脫條件優(yōu)化。改變乙醇的體積分?jǐn)?shù)、洗脫流速對洗脫條件進(jìn)行優(yōu)化[10，11]。按上述確定的吸附條件上柱，吸附平衡后，用2 BV純化水淋洗樹脂柱，后依次用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液以不同的流速淋洗樹脂柱，各濃度淋洗液的量為3 BV。收集淋洗液，每15 mL收集1份，每份淋洗液取5 μL進(jìn)行液相色譜儀分析，測定EGCG峰面積，繪制洗脫曲線，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、洗脫流速對洗脫效果的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

線性回歸方程為：A=22.733X-0.5571，r=0.999 8（n=5）。

2.2 含量測定

采用HPLC分析得到茶葉生產(chǎn)廢料中EGCG的含量為82.42 mg/g。

2.3 樹脂的篩選

在篩選的14種樹脂中，多種大孔樹脂對茶葉生產(chǎn)廢料中EGCG的比吸附量都較大，但以D101型樹脂為好，從解析率來看，也以D101型樹脂為最好，故確定D101型樹脂為分離純化茶葉生產(chǎn)廢料提取液中EGCG的最佳樹脂。

2.4 吸附條件優(yōu)化

2.4.1 上樣濃度 不同上樣濃度的曲線見圖1。從圖1可以看出，上樣濃度對單位樹脂吸附EGCG的量影響不大，但對吸附時間有比較大的影響。在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)上樣濃度超過20 mg/mL以后，樣品溶液在上柱過程中易產(chǎn)生沉淀，堵塞樹脂柱，故最終確定上樣濃度為20 mg/mL。

2.4.2 上樣速度 上柱流速為1.0、1.5、2.0 BV/h，當(dāng)漏出液EGCG峰面積達(dá)拐點(diǎn)時，其上柱液體積分別為4.5、4.5、4.2 BV，上柱操作時間分別為270、180、126 min。從試驗(yàn)過程來看，1.5 BV/h比1.0 BV/h的上樣速度要快得多，但樹脂吸附EGCG總量卻沒有差異，故確定上柱流速為1.5 BV/h。

2.4.3 泄露曲線 泄露曲線見圖2。從圖2可以看出，從第18號收集液開始，EGCG的峰面積急劇增大，說明此時EGCG已經(jīng)開始明顯泄露，故確定茶葉生產(chǎn)廢料提取物溶液的上柱量為4.5 BV。

2.5 洗脫條件優(yōu)化

2.5.1 乙醇體積分?jǐn)?shù) 當(dāng)采用10%的乙醇洗脫時，EGCG很快就被洗脫下來，表兒茶素沒食子酸酯（以下簡稱ECG）卻沒有洗脫出來，隨著時間的推移，EGCG和ECG相伴洗出；當(dāng)乙醇達(dá)到20%時，EGCG和ECG的洗脫速率明顯變快。但是當(dāng)乙醇達(dá)到30%時，洗脫液中的雜質(zhì)種類明顯增多，故選擇20%乙醇作為洗脫劑。

2.5.2 洗脫流速 不同洗脫速度的洗脫效果見圖3。從圖3可以看出，當(dāng)采用0.5 BV/h的洗脫速度進(jìn)行洗脫時洗脫效果較好。

2.5.3 洗脫曲線 洗脫曲線見圖4。由圖4可以看出，從第15份洗脫液開始EGCG峰面積值很小，到第17份時已基本為零，表明此時大孔吸附樹脂吸附的EGCG已基本完全洗脫，故確定洗脫劑用量為4.0 BV。

3 小結(jié)與討論

運(yùn)用靜態(tài)吸附與動態(tài)吸附相結(jié)合的方法找到適用于茶葉生產(chǎn)廢料提取物中EGCG分離純化用的大孔吸附樹脂為D101。其最佳分離純化條件為：將20.0 mg/mL上柱液以1.5 BV/h上柱4.5 BV，使用20%乙醇以0.5 BV/h洗脫4.0 BV。

從茶葉生產(chǎn)廢料中提取、分離純化EGCG的全過程均采用對設(shè)備和環(huán)境友好的乙醇水溶液作為溶劑，其兼容性及連續(xù)性增強(qiáng)，溶劑回收方便，能耗降低，生產(chǎn)周期縮短，且乙醇廉價無毒，對環(huán)境沒有污染，生產(chǎn)企業(yè)對“三廢”的處理成本也會大大降低，有利于企業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)。

本研究從茶葉生產(chǎn)廢料中提取分離純化生產(chǎn)高附加值的EGCG，是茶葉產(chǎn)業(yè)鏈很好的延伸，與恩施州的產(chǎn)業(yè)鏈建設(shè)政策高度契合，且有利于充分利用恩施州的茶葉資源，變廢為寶，提高茶農(nóng)的收入，為恩施州茶葉產(chǎn)業(yè)鏈的建設(shè)注入新的活力。

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