蛹蟲草蟲草素提取工藝的研究

殷東林等

摘要：以蛹蟲草[Cordyceps militaris（Linn. ）Link]子實(shí)體為材料，首先通過單因素分析法探索蟲草素的最佳提取溶劑，結(jié)果表明，70%乙醇是蟲草素的最佳提取溶劑，并通過正交試驗(yàn)考察了微波助提法中微波功率、微波時間、提取次數(shù)和料液比4個因素對蟲草素提取功率的影響，最終建立了提取蟲草素的最佳工藝條件，即微波功率350 W，微波處理時間4 min，提取2次，料液比1∶50（g∶mL），提取率可達(dá)6.87%。

關(guān)鍵詞：蛹蟲草[Cordyceps militaris（Linn. ）Link]；蟲草素；正交試驗(yàn)；微波助提法

中圖分類號：S567.3+3；R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）18-4560-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.18.042

蛹蟲草[Cordyceps militaris（Linn. ）Link]最早源于中國，俗稱北蟲草，由于其藥用價(jià)值與冬蟲夏草（Cordyceps sinensis）相似，故藥典中亦記載為“北冬蟲夏草”[1]。蛹蟲草為子囊菌亞門，麥角菌目麥角菌科蟲草屬的模式種[2]，是國內(nèi)外公認(rèn)的食藥用真菌，民間用于肺炎、腎虛、腰疼等疾病的治療。其中所含的蟲草多糖、蟲草酸和蟲草菌素（也稱蟲草素）均高于冬蟲夏草，其獨(dú)特藥理作用已日益引起藥學(xué)界的高度重視。

蟲草素是第一個從真菌中分離出來的核苷類抗菌素，具有抗腫瘤、抑菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗炎[3]等非常廣譜的生物學(xué)活性。早在1950年就有學(xué)者觀察到被蛹蟲草寄生的昆蟲組織不易腐爛，進(jìn)而從中分離出一種抗菌性物質(zhì)，定名為蟲草素。目前，以蟲草素為主要成分的新藥已試用于臨床，有著良好的臨床應(yīng)用前景，但大量提取分離其純品非常不易，化學(xué)合成也存在一定的弊端，因此國際市場上蟲草素的價(jià)格非常昂貴。根據(jù)蟲草素溶于水、熱乙醇和甲醇的性質(zhì)，蟲草素的提取一般采用水、50%乙醇、乙醇和甲醇等溶劑。提取蟲草素的方法有浸提法、回流法、滲漉法、超聲波法、索氏提取法和超臨界萃取等，不同的提取原料適用的方法不同。但為了進(jìn)一步提高提取率和縮短提取時間，可用超聲波輔助浸提[4]和微波輔助浸提，這2種方法操作簡單且不易引入雜質(zhì)。而微波透過提取溶劑到達(dá)物料內(nèi)部使之快速升溫，進(jìn)而使其細(xì)胞內(nèi)部壓力增大，當(dāng)壓力超過細(xì)胞壁所能承受的能力時，細(xì)胞壁破裂，胞內(nèi)有效成分流出，提取溶劑易于進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，微波法要好于超聲波法[5]，有效縮短了提取時間。

蟲草素的紫外、紅外光譜[6]、超導(dǎo)核磁共振法[7]可以用于蟲草素的初步鑒定，而目前蟲草素的分析測定多采用高效液相色譜（HPLC）[8]分析法，也有采用紫外分光光度法。HPLC雖然靈敏度高、重復(fù)性好、對流量和溫度變化不敏感，但是成本高，一次性投資大。還有一種薄層色譜掃描法（TLCS）具有展開時間短、顯色方便、價(jià)格較便宜的特點(diǎn)，但此法測定蟲草素含量的準(zhǔn)確度和精密度均略低于HPLC，因此有人綜合HPLC與TLCS的優(yōu)點(diǎn)，將兩者結(jié)合起來對蟲草素含量進(jìn)行定性定量測定。本試驗(yàn)采用的是紫外分光光度法，結(jié)合單因素分析法和多因素正交分析法，對蟲草素提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，旨在為蟲草素的提取提供一套簡便、快捷、高效的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 無水乙醇、鹽酸、蒸餾水

1.1.2 儀器 80目篩、電子天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）、數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海梅香儀器有限公司）、微波爐（佛山市順德區(qū)格蘭仕微波爐電器有限公司）、TU-1810紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）、循環(huán)水式多用真空泵、抽濾瓶、pH測定儀、RE52-86A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）。

1.1.3 材料 蛹蟲草子實(shí)體干燥后粉碎，過80目篩；蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品（上海金穗生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 蟲草素的提取 用無水乙醇和蒸餾水按一定比例配制成20%、40%、50%、70%的乙醇；取干重2 g的蛹蟲草粉，分別加入到已經(jīng)調(diào)好的pH為5.0的100 mL蒸餾水、20%的乙醇、40%的乙醇、50%的乙醇、70%的乙醇、無水乙醇，70 ℃水浴20 min；然后用420 W微波輻射1 min，間隔1 min后再輻射1 min，如此間隔輻射直至總輻射時間達(dá)到4 min，然后轉(zhuǎn)入70 ℃水浴提取30 min，用抽濾瓶抽濾提取液，4 ℃保存提取液用于檢測。以上試驗(yàn)均做3次重復(fù)，取平均值。得到的提取液定容至50 mL即得到蟲草素原始樣品溶液，從每組樣品液中準(zhǔn)確吸取1 mL至500 mL容量瓶中并定容（即將原始樣品溶液稀釋500倍），用于測定其吸光度。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品0.001 0 g，用50%的乙醇溶液定容于10 mL的容量瓶，準(zhǔn)確量取上述儲備液一定體積，用50%乙醇配制蟲草素濃度均為2、4、6、8、10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。紫外吸收光譜標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：將濃度分別為2、4、6、8、10 μg/mL的蟲草素溶液以蒸餾水作為參比，掃描200～350 nm紫外圖譜，并測量259 nm處的吸光度，然后以蟲草素濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，每組做3次重復(fù)，取平均值。

1.2.3 樣品含量的測定 準(zhǔn)確量取已經(jīng)過稀釋的蟲草素樣品提取液于比色皿中，以蒸餾水為對照，在259 nm的波長處測定吸光度，將測得的吸光度帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，從而計(jì)算出樣品中蟲草素的含量。蟲草素提取率=測得蟲草素的含量/蛹蟲草粉末的質(zhì)量×100%。

1.2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 確定了蟲草素的最佳提取溶劑之后，用正交試驗(yàn)法L9（34）對微波助提法中的微波功率、微波時間、提取次數(shù)、料液比（g∶mL，下同）4個因素，分別取3個水平考察對蟲草素提取率的影響，以確定最佳提取條件。L9（34）正交試驗(yàn)中因素與水平見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線測定結(jié)果

以蟲草素質(zhì)量濃度對吸光度進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y=0.058 5X+0.019 6，R2=0.998 8，表明蟲草素在質(zhì)量濃度為2～10 μg/mL與吸光度呈良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

2.2 最佳溶劑的確定

6組溶劑的提取率見圖2。由圖2可以看出，在本試驗(yàn)所用的6種溶劑中，70%乙醇的提取率最高，為4.15%，確定為蟲草素的最佳提取溶劑。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。由表2可知，影響蟲草素提取率的主次因素為微波功率﹥微波時間﹥提取次數(shù)﹥料液比，最優(yōu)組合為A1B2C2D2，即微波功率350 W、微波處理時間4 min、提取2次、料液比1∶50，提取率可達(dá)6.87%。

3 小結(jié)

本研究以蛹蟲草子實(shí)體為材料，研究了蟲草素的提取工藝，通過單因素試驗(yàn)確定蟲草素的最優(yōu)提取溶劑為70%乙醇，該溶劑的提取率可達(dá)4.15%。通過正交試驗(yàn)考察了微波助提法中微波功率、微波時間、提取次數(shù)、料液比4個因素對蟲草素提取率的影響，建立提取蟲草素的最佳工藝條件為微波功率350 W、微波處理時間4 min、提取2次，料液比1∶50，提取率可達(dá)6.87%。由于蛹蟲草中含有的成分復(fù)雜，熱提取過程中單糖、水溶性蛋白質(zhì)以及鞣質(zhì)等一系列雜質(zhì)也會被一并提出，為蟲草素的純化帶來困難，試驗(yàn)所得的粗品中含有一定量蛋白質(zhì)；另一方面，在試驗(yàn)過程中存在一些系統(tǒng)誤差和偶然誤差，因此會對試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生一定程度的影響。蟲草素的提取方法有很多，為了進(jìn)一步提高提取率和縮短提取時間，本研究確定用微波助提法加以優(yōu)化。微波能透過提取溶劑到達(dá)物料內(nèi)部，使之快速升溫，進(jìn)而使其細(xì)胞內(nèi)部壓力增大。當(dāng)壓力超過細(xì)胞壁所能承受的能力時，細(xì)胞壁破裂，胞內(nèi)有效成分易于流出，提取溶劑易于進(jìn)入。但所用微波功率過大或處理時間過長可能會使有效成分分解，造成損失，故可通過正交試驗(yàn)確定最佳提取條件。微波輔助萃取技術(shù)具有快速、萃取率高、成本低、質(zhì)量好等優(yōu)點(diǎn)，是天然產(chǎn)物萃取中一種非常有發(fā)展?jié)摿Φ男滦图夹g(shù)。

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