木質(zhì)纖維素降解菌群的篩選組配及其對秸稈的降解效果

盧月霞等

摘要：采用苯胺藍脫色法和纖維素剛果紅培養(yǎng)基鑒別法，從所采樣品中分離篩選到8株能較好降解木質(zhì)纖維素的菌株。對8個菌株的LiP酶、MnP酶、Lac酶、C1酶、Cx酶和纖維二糖酶（BG酶）分別進行測定，得到4株酶類齊全且酶活較高的菌株H14、H17、W15、W23。在分析菌株相容性基礎上進行菌株組合，對菌群的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，，在優(yōu)化條件下的LiP酶活性可達28.02 U/mL，Cx酶活性達38.16 U/mL，對玉米秸稈粉末的降解率高達35.24%。該菌群具有進一步研究價值。

關鍵詞：木質(zhì)纖維素降解；混合菌群；秸稈；降解效果

中圖分類號：X172 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）18-4464-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.18.019

中國擁有數(shù)量龐大的秸稈資源，由于秸稈結構不均一，且各部分的化學成分非常復雜，使得秸稈在短時間內(nèi)不容易被降解。很多秸稈在田間被直接燒掉，破壞了生態(tài)平衡，使土壤肥力衰竭，造成農(nóng)業(yè)上的惡性循環(huán)，而且污染環(huán)境。利用適合常溫、組分失衡的微生物，構建具有高效木質(zhì)纖維素降解功能的混合菌群，使秸稈資源能被快速充分的利用，對于促進秸稈資源的有效利用、解決環(huán)境污染、保持經(jīng)濟可持續(xù)發(fā)展具有重大現(xiàn)實意義。為獲得高效降解木質(zhì)纖維素的混合菌群，以解決秸稈類固廢污染和秸稈資源的有效利用，本試驗進行了木質(zhì)纖維素降解菌群的篩選組配及其降解效果研究。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗分離所需樣品來自富含枯枝落葉的土壤和養(yǎng)殖場畜禽糞便。

初篩培養(yǎng)基、剛果紅鑒別培養(yǎng)基和液體發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法均參照文獻[1]。

木質(zhì)素酶檢測培養(yǎng)基（BM-Azure B 培養(yǎng)基）的成分為：酵母粉0.1 g/L， 葡萄糖2 g/L， Azure B 0.1 g/L， 瓊脂18 g/L， pH 6.5～7.0。

1.2 方法

木質(zhì)纖維素降解菌的初篩方法參照文獻[2]。

1.2.1 木質(zhì)纖維素酶活定性檢測 初篩得到的菌株分別用滅菌牙簽點接到鑒別培養(yǎng)基和苯胺藍脫色培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)48 h，選擇菌落周圍產(chǎn)透明圈和脫色圈的菌株進行液體發(fā)酵測定酶活。

1.2.2 木質(zhì)纖維素酶活定量測定 將篩選菌株接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基，28 ℃，160 r/min搖床振蕩培養(yǎng)1～2 d， 3 500 r/min離心10 min，收集上清液對菌株的各類酶活進行定量測定。纖維素酶包括三類酶，分別為Cx、C1和BG，其測定過程參照文獻[3，4]進行；木質(zhì)素降解酶主要包括三類：Lip、MnP和Lacase，3種酶活測定方法參考文獻[5]。

1.2.3 菌株相容性分析及菌群構建 將各酶活較高的菌株兩兩混合，點種于初篩培養(yǎng)基平板上，定期觀察菌株的生長情況，分析菌株之間的相容性，合理構建混合菌群。將相容性強的菌株經(jīng)過夜培養(yǎng)后的菌懸液以體積比1∶1混合，將混合菌液接種到天然纖維素培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)一周，定期測定各酶活，并測定秸稈類物質(zhì)的降解率。

1.2.4 菌群產(chǎn)酶條件優(yōu)化研究 將優(yōu)化組合接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基上，研究溫度、碳源、氮源、接種量對產(chǎn)酶的影響，優(yōu)化菌群發(fā)酵條件。

1.2.5 菌群對秸稈類木素纖維素物質(zhì)的降解率測定 根據(jù)降解前后底物干重的變化計算降解率。

2 結果與分析

2.1 木質(zhì)纖維素降解菌的分離純化與篩選

參照文獻[2]中所述方法分離純化出78個菌株，按照1.2.2的方法檢測出具有酶活性的菌株32株，其中8株菌的透明圈和脫色圈比較明顯，它們在剛果紅培養(yǎng)基平板和苯胺蘭脫色平板上透明圈和脫色圈直徑見表1，透明圈和脫色圈篩選法雖然直接快速，但僅以透明圈和脫色圈直徑大小作為菌株木質(zhì)纖維素酶活力大小的惟一指標并不可靠，為此需對各菌株酶系特點進行分析。

2.2 各菌株酶系特點

木質(zhì)素和纖維素的降解需要多種酶共同作用，木質(zhì)素降解酶系主要包括木質(zhì)素過氧化物酶（LiP）、錳過氧化物酶（MnP）和漆酶（Laccase），這些酶可在木質(zhì)素聚合物內(nèi)形成自由基，導致鍵的不穩(wěn)定從而打斷木質(zhì)素大分子，LiP被認為是在木質(zhì)素類物質(zhì)降解過程中起關鍵作用的酶。纖維素降解必須依靠外切型葡聚糖酶（C1）、內(nèi)切型葡聚糖酶（Cx）、纖維二糖酶（BG）3種酶協(xié)同作用才能完成，因此需要全面系統(tǒng)分析菌株各種木質(zhì)素和纖維素酶的活性。分別對8個菌株的6類酶進行定量測定，最后得到4株酶類齊全且酶活性較高的菌株，H14、H17、W15、W23，H14和H17為細菌，W15和W23為真菌。4菌株各類酶活測定結果如圖1。由圖1可知，菌株W23的LiP和Cx酶活最高，分別達到10.24 U/ mL和19.33 U/mL，但該菌株其他酶活較低，菌株各類酶活高低不同是限制天然木質(zhì)纖維素徹底降解的重要因素。

2.3 菌株相容性分析

將4菌株兩兩混合點接于初篩培養(yǎng)基平板上，定期觀察菌株的生長情況，具體生長情況見表2，結果表明，各菌株可以共存，彼此之間無拮抗現(xiàn)象發(fā)生，菌落之間無覆蓋或限制現(xiàn)象，各菌株之間的相容性為菌株組合協(xié)同降解天然木質(zhì)纖維素提供了研究基礎。

2.4 菌群構建及對天然木質(zhì)纖維素降解能力測定

將4菌株過夜培養(yǎng)后的菌懸液，以體積比1∶1∶1∶1混合，將混合菌液分別接種到玉米秸稈發(fā)酵液連續(xù)培養(yǎng)一周，定期測定發(fā)酵液各類酶活性，由圖2可知，各種酶活性均呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，各類酶活性高峰時間集中在第2天和第3天，且Cx在三類纖維素酶中活性最高，LiP在木質(zhì)素三類酶中也表現(xiàn)最明顯，Cx最高酶活性可達25.69 U/mL，LiP最高酶活性達16.41 U/mL，遠遠高于單菌株各類酶活性。天然木質(zhì)纖維素的降解需要各類酶協(xié)同作用，在實際應用中，應充分重視多種微生物之間的協(xié)同效應。在本試驗中，木質(zhì)纖維素降解的關鍵酶是Cx和LiP，為此選擇這兩種酶作為產(chǎn)酶條件優(yōu)化的測定指標。

2.5 菌群產(chǎn)酶條件優(yōu)化

2.5.1 溫度對酶活性的影響 將混合菌液以2%的接種量接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于不同溫度下，180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)72 h，取樣測定LiP和Cx的活性，由酶活性測定結果（圖3）可知，菌群在30 ℃時的酶活性最高，該溫度比較適合菌群的生長，故此溫度下菌群的產(chǎn)酶能力較強。曲線總體趨勢顯示初期酶活性隨溫度增高而增加，溫度超過30 ℃時，酶活性呈下降趨勢。

2.5.2 碳源對酶活性的影響 除去碳源的液體發(fā)酵培養(yǎng)基作為基礎培養(yǎng)基，分別加入不同碳源：木屑、玉米糠、稻米糠、麥麩和甘蔗渣，于30 ℃，180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)72 h，測定各發(fā)酵液LiP和Cx的活性，如圖4所示，碳源對菌株產(chǎn)酶能力有很大的影響，玉米糠可以明顯促進LiP和Cx的產(chǎn)生，而甘蔗渣作為碳源酶活性相對較低，

2.5.3 氮源對產(chǎn)酶影響 以除去氮源后的液體發(fā)酵培養(yǎng)基作為基礎培養(yǎng)基，分別加入不同氮源即酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、（NH4）2HPO4、 NH4H2PO4和尿素，培養(yǎng)條件同上，酶活測定結果（圖5）表明酵母膏更有利于酶的產(chǎn)生，（NH4）2HPO4、 NH4H2PO4能夠緩沖發(fā)酵過程中pH的變化，促進產(chǎn)酶的效果較好。

2.5.4 接種量對產(chǎn)酶的影響 將菌群以不同接種量接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基，于30 ℃，180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)72 h后測定各發(fā)酵液LiP和Cx的活性，接種量不同，酶活性相差較大，以4%的接種量接種酶活最高（圖6），接種量太低菌株適應環(huán)境較慢，所以產(chǎn)酶能力相對較差。同時木質(zhì)纖維素結構和成分的復雜性也決定在接種量較大情況下更有利于酶的產(chǎn)生。

2.6 菌群對不同底物的降解率測定結果

液體培養(yǎng)基中分別以木屑、玉米稈粉、稻米糠、麥麩和甘蔗渣作為碳源，將菌群接種液體培養(yǎng)基，30 ℃，180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)7 d后，測定菌群對木質(zhì)纖維素類底物的降解率，降解結果如圖7所示，在5種木質(zhì)纖維素物質(zhì)中，菌群對玉米稈粉的降解率最高，可達35.24%，其次是甘蔗渣、稻米糠和麥麩，降解率分別為28.12%、25.36%和20.14%，對木屑的降解率最低，只有19.15%，菌株降解率取決于底物結構，所以玉米稈粉更適合作為發(fā)酵底物。

3 小結與討論

本研究構建的混合菌群具有較高的LiP酶和Cx酶活性，且對木質(zhì)纖維素類物質(zhì)具有較高的降解率，顯示出其在未來木質(zhì)纖維素物質(zhì)降解轉(zhuǎn)化方面的應用潛力。木質(zhì)纖維素的降解是真菌、細菌及相應微生物群落共同作用的結果，利用微生物菌群降解木質(zhì)纖維素對實現(xiàn)木質(zhì)纖維素快速轉(zhuǎn)化和開發(fā)木質(zhì)纖維素廢棄物處理的新菌劑必然具有一定的理論指導和現(xiàn)實意義。木質(zhì)纖維素生物降解不僅依賴于微生物自身的降解能力，在很大程度上還取決于環(huán)境條件，培養(yǎng)溫度、碳源、氮源、接種量等都對菌株產(chǎn)酶能力有著較大的影響，因此，優(yōu)化菌群的產(chǎn)酶條件對提高降解效率、加快降解進程尤為重要，這方面的工作有待于進一步完善。

參考文獻：

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[2] 盧月霞，宋惠月，劉凱楠，等.一株纖維素降解菌的篩選及其產(chǎn)酶條件優(yōu)化[J].湖北農(nóng)業(yè)科學，2010，49（1）：95-97.

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[4] 劉 潔，李憲臻，高培基.纖維素酶活力測定方法評述[J].工業(yè)微生物，1994，24（4）：27-32.

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