Notch信號(hào)促進(jìn)核因子κB受體活化因子配體誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化的體外研究

何飛 吳勇 周艷

深圳市人民醫(yī)院口腔科，深圳 518020

破骨細(xì)胞分化的激活和功能亢進(jìn)是導(dǎo)致牙周病牙槽骨吸收的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。研究破骨細(xì)胞分化的信號(hào)調(diào)控，可以進(jìn)一步了解牙周病骨吸收原理；阻斷破骨細(xì)胞分化信號(hào)通路，也可能成為防止牙周病牙槽骨吸收的有效策略。已有的研究[1-4]顯示， Notch信號(hào)是破骨細(xì)胞分化調(diào)控的關(guān)鍵信號(hào)之一，但其具體作用尚存在不同意見。本研究旨在初步探討Notch信號(hào)在體外破骨前體細(xì)胞RAW264.7分化中的作用，為進(jìn)一步明確其作用的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞株（ATCC），DMEM、特級(jí)胎牛血清（Gibco公司，美國(guó)），鼠重組細(xì)胞核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor kappa B ligand，RANKL）、巨噬細(xì)胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，M-CSF）（Peprotech公司，美國(guó)），γ分泌酶抑制劑（γ-secretase inhibitor，GSI）（L685，458，Calbiochem公司，美國(guó)），破骨細(xì)胞分化標(biāo)志物抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphase，TRAP）染色試劑盒（Sigma公司，美國(guó)）。

1.2 破骨細(xì)胞分化誘導(dǎo)

將RAW264.7細(xì)胞復(fù)蘇后應(yīng)用高糖DMEM進(jìn)行培養(yǎng)，每隔3 d細(xì)胞換液1次，細(xì)胞鋪滿即可進(jìn)行傳代。為檢測(cè)Notch信號(hào)抑制對(duì)RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化的影響，本研究將不同濃度GSI與RANKL共同加入培養(yǎng)液。將細(xì)胞分為3組：陰性對(duì)照組（即空白對(duì)照組），RANKL誘導(dǎo)組（50 ng·mL-1），RANKL（50 ng·mL-1）+GSI（1、2、5 μmol·L-1）組。

1.3 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）

采用TRIzol試劑一步法抽提RAW264.7細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA260 nm/RNA280 nm光密度值以檢測(cè)RNA樣品的純度和濃度；然后按FERMENTAS逆轉(zhuǎn)錄試劑盒標(biāo)明的操作步驟進(jìn)行real-time PCR，cDNA合成42 ℃ 60 min，70 ℃滅活5 min。用SYBR GREEN試劑盒進(jìn)行real-time PCR分析。利用Primer Express 2.0設(shè)計(jì)針對(duì)基因與內(nèi)參照β-actin的引物，具體如下。Notch1正義鏈 5’-TGTGACAGCCAGTGCAACTC-3’，反義鏈 5’-TGGCACTCTGGAAGCACTGC-3’；Notch2正義鏈5’-CCCCTTGCCCTCTATGTACCA-3’，反義鏈5’-GGTAGGTGGGAAAGCCACACT- 3’；Delta1正義鏈 5’-ACCTTCTTTCGCGTATGCCTCAAG-3’，反義鏈5’-AGAGTCTGTATGGAGGGCTTC-3’；Jagged1正義鏈5’-ATTCGATCTACATAGCCTGTGAG-3’，反義鏈5’-CTATACGATGTATTCCATC-3’；Hes1正義鏈5’-GCCAGTGTCAACACGACACCGG-3’，反義鏈 5’-TCACCTCGTTCATGCACTCG-3’；TRAP正義鏈 5’-GCAAGGTCCCCAACGGCTATC -3’，反義鏈5’-GCCTCGGCAGCCTGGTCT-3’；Cathepsin K正義鏈5’-AAGAGGTGGTTCAGAAGATG-3’，反義鏈5’-TATTGGAAGGCATTGGTCAT-3’；β-actin正義鏈5’-GTGGGCCGCTCTAGGCACCAA-3’，反義鏈5’-CTCTTTGATGTCACGCACGCACGATTTC-3’。

PCR反應(yīng)體系均為20 μL，反應(yīng)液各成分分別為SYBR Premix Ex Taq Ⅱ10 μL，上游引物0.8 μL，下游引物0.8 μL，DNA模板2.0 μL，dH2O6.0 μL，ROX Reference Dye Ⅱ0.4 μL。每組設(shè)陰性對(duì)照，每組3個(gè)復(fù)孔。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，1個(gè)循環(huán)；95 ℃ 5 s，58 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)體系于ABI 7500 real-time PCR儀上進(jìn)行檢測(cè)，自動(dòng)掃描并記錄熒光強(qiáng)度。通過(guò)調(diào)整模板濃度使內(nèi)參β-actin擴(kuò)增Ct值為18～30。應(yīng)用ABI 7500 System SDS Software1.3.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，其相對(duì)表達(dá)量采用2－ΔΔCt方法計(jì)算。

1.4 TRAP染色及TRAP陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)

將RAW264.7細(xì)胞接種于24孔板中，按上述分組培養(yǎng)，結(jié)束后棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，4%甲醛固定液室溫固定10 min，PBS洗2次，甲醇和丙酮混合液（體積比1∶1）固定3～5 min，PBS洗2次，37 ℃條件下用TRAP染色液染色30 min，雙蒸水洗3次，光鏡觀察并進(jìn)行TRAP陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)。細(xì)胞核數(shù)目≥3個(gè)且TRAP染色陽(yáng)性的細(xì)胞視為破骨細(xì)胞。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RANKL誘導(dǎo)下破骨細(xì)胞分化

RAW264.7細(xì)胞正常生長(zhǎng)呈圓形、梭形或橢圓形（圖1）。經(jīng)50 ng·mL-1RANKL誘導(dǎo)后，部分細(xì)胞體積增大，形狀不規(guī)則，可見裙?fàn)?、放射狀或絲狀偽足伸出，胞核數(shù)目增多（細(xì)胞核≥3個(gè)），TRAP染色細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見玫瑰紅色顆粒（圖2），此細(xì)胞可視為破骨細(xì)胞。

圖1 正常RAW264.7細(xì)胞的形態(tài)觀察 倒置相差顯微鏡 × 100Fig 1 Observation of normal RAW264.7 cells inverted phase contrast microscope × 100

2.2 破骨細(xì)胞分化中Notch信號(hào)成分及破骨細(xì)胞標(biāo)志基因mRNA的表達(dá)

50 ng·mL-1RANKL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞3 d，RANKL誘導(dǎo)組Notch1、Notch2、Delta1、Jagged1、Hes1、TRAP、Cathepsin K的相對(duì)表達(dá)量分別為1.054±0.435、3.625±0.586、1.261±0.361、3.813±0.476、1.932±0.273、8.752±0.982、1.983±0.364。與空白對(duì)照組相比，Notch受體Notch1、Notch2，配體Delta1、Jagged1及靶基因Hes1 mRNA表達(dá)水平均有不同程度的提高，其中Notch2、Jagged1表達(dá)增高最顯著（P<0.05）；同時(shí)破骨細(xì)胞標(biāo)志基因TRAP及Cathepsin K的表達(dá)顯著增高（P<0.05）。提示RANKL可促進(jìn)Notch信號(hào)，參與破骨細(xì)胞分化過(guò)程，其中Notch2、Jagged1可能是主要發(fā)揮作用的受-配體。

圖2 破骨細(xì)胞的形態(tài)觀察 TRAP染色 × 100Fig 2 Observation of the osteoclasts TRAP staining × 100

2.3 Notch信號(hào)抑制對(duì)RAW264.7細(xì)胞分化的影響

經(jīng)檢測(cè)，GSI抑制Notch受體表達(dá)可致下游靶基因Hes1表達(dá)降低（圖3）?？瞻讓?duì)照組，RANKL誘導(dǎo)組，RANKL+GSI（1、2、5 μmol·L-1）組TRAP陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為5.2±1.3、125.6±12.7、94.5±10.8、70.3±8.9、37.5±5.2。與RANKL誘導(dǎo)組相比，加入GSI各組TRAP陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著減少，且呈劑量依賴性（P<0.05）。

圖3 PCR檢測(cè)Hes1 mRNA的表達(dá)Fig 3 The expression level of Hes1 mRNA analyzed by PCR

3 討論

Notch信號(hào)是調(diào)控細(xì)胞增殖和分化最重要的保守性信號(hào)途徑之一，在多種細(xì)胞的增殖和分化的調(diào)控中起關(guān)鍵作用[5-7]。破骨細(xì)胞作為牙周病骨吸收及牙槽骨改建的主要功能細(xì)胞，其分化同樣受到Notch信號(hào)的調(diào)控[1-4]。本研究顯示，RANKL誘導(dǎo)后小鼠RAW264.7細(xì)胞多種Notch信號(hào)成分及下游靶基因表達(dá)增強(qiáng)；以GSI抑制Notch受體的表達(dá)，其下游靶基因表達(dá)同步降低，同時(shí)RAW267.4細(xì)胞分化為多核破骨細(xì)胞的數(shù)量明顯減少。提示Notch信號(hào)可能促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化。與本研究相似，國(guó)內(nèi)外學(xué)者[1-2]通過(guò)對(duì)RAW264.7細(xì)胞及小鼠骨髓巨噬細(xì)胞（bone marrow-derived macrophages，BMMs）的研究，認(rèn)為Notch2信號(hào)具有促進(jìn)破骨細(xì)胞分化的作用。但有研究[3]顯示，當(dāng)BMMs的Notch1、Notch2、Notch3基因受到抑制時(shí)，其向破骨細(xì)胞分化能力加強(qiáng)；同樣的，Yamada等[8]研究發(fā)現(xiàn)Notch1-Delta1信號(hào)不但抑制破骨前體細(xì)胞自身分化，同時(shí)促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞RANKL/骨保護(hù)素（osteoprotegerin，OPG）的表達(dá)，抑制M-CSF的表達(dá)，進(jìn)一步抑制破骨細(xì)胞的分化。

分析各研究結(jié)果產(chǎn)生差異的原因，一方面可能與各研究所用的細(xì)胞種類及細(xì)胞所處的狀態(tài)不同有關(guān)。Notch信號(hào)是存在于細(xì)胞表面的信號(hào)分子，它的功能的實(shí)現(xiàn)依賴于細(xì)胞所處的微環(huán)境，從而導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)外界刺激的反應(yīng)不同[5]。另一方面，有研究[9]表明，Notch信號(hào)的不同受-配體組合在同一細(xì)胞中可能發(fā)揮不同的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，RAW264.7細(xì)胞中各Notch受-配體表達(dá)水平不同，RANKL誘導(dǎo)后表達(dá)變化也不同，其中以Notch2和Jagged1的本體表達(dá)及增強(qiáng)變化最為顯著，推測(cè)Notch2-Jagged1可能是Notch信號(hào)參與RAW264.7細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化的主要受-配體對(duì)。不同Notch受-配體在破骨細(xì)胞分化中的關(guān)系及具體作用機(jī)制都值得進(jìn)一步研究。

破骨細(xì)胞來(lái)源于骨髓單核/巨噬細(xì)胞系，其分化過(guò)程受多種信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。其中RANKL是調(diào)控其分化的關(guān)鍵因子[10]。多種因子通過(guò)與RANKL通路直接或間接的相互作用實(shí)現(xiàn)對(duì)破骨細(xì)胞分化的調(diào)控。已有研究[8]發(fā)現(xiàn)，Notch可通過(guò)對(duì)成骨細(xì)胞/骨髓基質(zhì)細(xì)胞中RANKL/OPG表達(dá)的調(diào)節(jié)影響破骨細(xì)胞的分化。另外，Notch信號(hào)與核因子κB信號(hào)間存在交互應(yīng)答關(guān)系[11-12]。核因子κB作為分布廣泛、且具有眾多下游靶基因的轉(zhuǎn)錄因子，與存在于靶基因上游調(diào)控區(qū)中的輔激活因子的特定組合是基因表達(dá)調(diào)控的重要模式之一。因此，進(jìn)一步對(duì)破骨細(xì)胞分化中Notch與其他信號(hào)間交互作用的研究，為更好的了解骨吸收原理提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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