山羊顳下頜關(guān)節(jié)盤(pán)細(xì)胞的表面形貌和力學(xué)特性研究

包廣潔 孔楠楠 郭曼麗 蘇雪蓮 康宏

1.西北民族大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)國(guó)家民族事務(wù)委員會(huì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730030；2.蘭州大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)研究所，蘭州 730000

顳下頜關(guān)節(jié)盤(pán)是位于顳骨關(guān)節(jié)窩和下頜骨髁突之間的纖維軟骨樣組織，在顳下頜關(guān)節(jié)行使功能過(guò)程中起到緩沖應(yīng)力的作用[1]。隨著年齡和顳下頜關(guān)節(jié)功能位置、負(fù)荷大小的改變，顳下頜關(guān)節(jié)盤(pán)也會(huì)發(fā)生相應(yīng)的組織改建[2]。據(jù)報(bào)道[3]，有20%～50%的人由于關(guān)節(jié)盤(pán)變性、變薄、穿孔等原因罹患關(guān)節(jié)盤(pán)功能障礙性疾??；而目前的治療方法除了手術(shù)摘除之外，仍缺乏其他有效的措施。

細(xì)胞替代療法是迄今最有前景的治療關(guān)節(jié)軟骨缺損的方法[4]，該方法中種子細(xì)胞的選擇非常關(guān)鍵。自體或異體的顳下頜關(guān)節(jié)盤(pán)細(xì)胞是重要的種子細(xì)胞來(lái)源，目前對(duì)其分類(lèi)和分型已取得了初步進(jìn)展，從組織學(xué)上可分為軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞和成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞[5-7]，但兩種類(lèi)型的細(xì)胞在生物力學(xué)方面的反應(yīng)特性尚不清楚。

生物原子力顯微鏡（atomic force microscopy，AFM）[8]具有納米級(jí)分辨率，且易于操作，便于定量測(cè)定生物樣本的結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能，因而廣泛用于細(xì)胞形態(tài)和生物力學(xué)研究中[9]。AFM通過(guò)高度靈敏的懸臂獲取細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)、剛度和黏附力[10]，這些特征可以揭示細(xì)胞的表面結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能以及與細(xì)胞功能之間的關(guān)系。本研究通過(guò)AFM接觸模式獲取顳下頜關(guān)節(jié)盤(pán)軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞和成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞的超微形貌特征，通過(guò)AFM力學(xué)模式獲取相關(guān)數(shù)據(jù)，對(duì)比細(xì)胞彈性和黏附力，探索顳下頜關(guān)節(jié)盤(pán)細(xì)胞的生物力學(xué)特性，為工程化顳下頜關(guān)節(jié)盤(pán)組織的后續(xù)研究提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 關(guān)節(jié)盤(pán)細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

分批購(gòu)置新鮮屠宰的1月齡山羊頭，充分清潔，75%乙醇中浸泡30 min。在無(wú)菌條件下取出雙側(cè)顳下頜關(guān)節(jié)盤(pán)，修剪周?chē)M織，用含100 U·mL-1青霉素和0.1 g·L-1鏈霉素雙抗的PBS充分沖洗3次，移入50 mL小燒杯中，將其剪碎至約1 mm3大??；加10 mL 0.2%Ⅰ型膠原酶（Sigma公司，美國(guó)），于37 ℃、86 r·min-1搖床上消化15 h。H-DMEM培養(yǎng)液（Hyclone公司，美國(guó)）重懸離心，收集細(xì)胞。一部分細(xì)胞以每毫升1×105個(gè)的密度接種于培養(yǎng)皿（無(wú)錫耐思生物科技有限公司）中，另一部分按每毫升2×105個(gè)的密度接種于50 mL培養(yǎng)瓶；加5 mL完全培養(yǎng)液，其中含有15%胎牛血清（杭州四季青生物科技有限公司）、1%維生素C（Sigma公司，美國(guó)）、2 mmoL·L-1谷氨酰胺（Sigma公司，美國(guó)）和1%青霉素-鏈霉素（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），于37 ℃、5%CO2及飽和濕度恒溫箱（HF90 Heal Force型二氧化碳培養(yǎng)箱，上海力申科學(xué)儀器有限公司）內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至85%～90%后以胰酶（Sigma公司，美國(guó)）消化，然后傳代。

1.2 關(guān)節(jié)盤(pán)細(xì)胞的鑒定

收集第1代關(guān)節(jié)盤(pán)細(xì)胞，制作細(xì)胞爬片，培養(yǎng)72 h，PBS液沖洗3 次；4%多聚甲醛固定，按照免疫組織化學(xué)試劑盒（SP-9002型，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）的SP法進(jìn)行Ⅰ型膠原鼠單克隆抗體（Abcam公司，英國(guó)）免疫組織化學(xué)鑒定，另外采用甲苯胺藍(lán)染色法進(jìn)行酸性糖氨多糖（glycosaminoglycan，GAG）鑒定。

1.3 AFM形貌測(cè)定

1.3.1 關(guān)節(jié)盤(pán)細(xì)胞表面形貌成像 接種到培養(yǎng)皿中的原代細(xì)胞培養(yǎng)2 d，待細(xì)胞充分伸展，更換不含胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，然后進(jìn)行Bio-AFM成像。使用安裝在Axiovert200 型倒置顯微鏡（卡爾蔡司公司，德國(guó)）上的JPK Nano Wizard 3型AFM（JPK公司，德國(guó)）進(jìn)行關(guān)節(jié)盤(pán)細(xì)胞成像。光鏡下分別挑選三角形的軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞和長(zhǎng)梭形的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，使用80 μm×80 μm大范圍掃描器和PNP-TR三角形懸臂硅探針（Nanoworld公司，美國(guó)）探頭進(jìn)行接觸模式掃描，掃描速度為0.1～0.25 Hz·s-1，接觸模式下采用的恒定的經(jīng)驗(yàn)側(cè)向力值（Setpoint）為0.533 nN，單次掃描持續(xù)和形貌復(fù)原時(shí)間為15 min。將掃描獲得的細(xì)胞表面形貌圖像用AFM系統(tǒng)的JPK Data Processing軟件進(jìn)行分析，從細(xì)胞納米分辨率水平上比較兩種類(lèi)型的關(guān)節(jié)盤(pán)細(xì)胞在生物力學(xué)特性上的差異。

1.3.2 細(xì)胞膜表面粗糙度分析 平均表面粗糙度Ra是細(xì)胞表面高度平均值的算術(shù)平均偏差，Rq為其均方根。在AFM細(xì)胞形貌圖上隨機(jī)選擇20個(gè)2 μm×2 μm的區(qū)域，通過(guò)JPK Data Processing軟件獲取Ra和Rq（單位：nm）。運(yùn)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

1.4 關(guān)節(jié)盤(pán)細(xì)胞生物力學(xué)特性分析

在倒置顯微鏡下分別隨機(jī)選取20個(gè)軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞和成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，分別在細(xì)胞的細(xì)胞核區(qū)和細(xì)胞質(zhì)區(qū)測(cè)定細(xì)胞的生物力學(xué)特性。掃描獲得細(xì)胞的力-位移曲線(xiàn)，通過(guò)JPK Data Processing軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合，分析兩種細(xì)胞的楊氏模量和黏附力。通過(guò)SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗(yàn)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 關(guān)節(jié)盤(pán)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

光學(xué)顯微鏡下，軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞呈三角形，成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，二者形態(tài)完全不同。原代細(xì)胞多以長(zhǎng)梭形的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞為主，部分呈圓形及多角形（軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞），折光性強(qiáng)；第1代后，細(xì)胞逐漸不規(guī)則，多角形增多（圖1A）。甲苯胺藍(lán)染色細(xì)胞質(zhì)呈紫藍(lán)色（圖1B），說(shuō)明關(guān)節(jié)盤(pán)細(xì)胞具有成軟骨的特性。Ⅰ型膠原免疫組織化學(xué)染色可見(jiàn)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有棕黃色的陽(yáng)性染色顆粒（圖1C），說(shuō)明關(guān)節(jié)盤(pán)細(xì)胞有成纖維特性。

圖1 顳下頜關(guān)節(jié)盤(pán)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察 光學(xué)顯微鏡 × 100Fig 1 Morphological observation of temporomandibular joint disc cells optical microscope × 100

2.2 兩種類(lèi)型關(guān)節(jié)盤(pán)細(xì)胞AFM形貌觀察

單細(xì)胞的AFM圖像能夠顯示出細(xì)胞表面的超微結(jié)構(gòu)，軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞和成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞的形貌特征見(jiàn)圖2。觀察AFM高度圖可見(jiàn)，軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞的細(xì)胞體高亮，邊緣部分略暗，比較圖中黑色橫截線(xiàn)所對(duì)應(yīng)的曲線(xiàn)圖發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核過(guò)渡不明顯（圖2E）。成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞的細(xì)胞核部分高亮，呈橢圓形，向細(xì)胞質(zhì)部分逐漸變暗，相應(yīng)的曲線(xiàn)剖面圖顯示，從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)區(qū)呈一個(gè)平緩的斜坡?tīng)钸^(guò)渡（圖2G）。二者的三維重建圖（圖2B、D）同樣可以看出這種趨勢(shì)。AFM偏轉(zhuǎn)圖能夠觀察到軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞邊緣伸出許多偽足，緊密貼合于培養(yǎng)皿基底，細(xì)胞連結(jié)部分的偽足相互交錯(cuò)，結(jié)合緊密，細(xì)胞體可見(jiàn)縱橫交錯(cuò)呈樹(shù)枝狀的骨架結(jié)構(gòu)，黑色橫截線(xiàn)所對(duì)應(yīng)的曲線(xiàn)圖發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表面輪廓凹凸不平，骨架結(jié)構(gòu)明顯凸起，支撐細(xì)胞的整體形態(tài)（圖2F）。成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞邊緣光滑，極少有偽足伸出，骨架結(jié)構(gòu)在細(xì)胞質(zhì)區(qū)規(guī)則排列（圖2H）。

2.3 表面粗糙度分析

軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞表面的Ra和Rq分別為（55.07±24.65） nm和（63.65±33.11） nm，成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞的Ra和Rq分別為（60.37±29.41） nm和（66.52±37.79） nm；經(jīng)t檢驗(yàn)，兩種類(lèi)型細(xì)胞的表面粗糙度的差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ra：P=0.587；Rq：P=0.769），說(shuō)明二者表面粗糙度接近，可能沒(méi)有區(qū)域性差異或者需要進(jìn)一步加大樣本量進(jìn)行分析。

2.4 兩種細(xì)胞力學(xué)特性分析

通過(guò)JPK Data Processing軟件計(jì)算得到軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞和成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞的細(xì)胞核區(qū)和細(xì)胞質(zhì)區(qū)的楊氏模量及黏附力見(jiàn)表1。經(jīng)t檢驗(yàn)，兩種細(xì)胞的細(xì)胞核區(qū)楊氏模量的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但是在細(xì)胞質(zhì)區(qū)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.047）；兩種細(xì)胞表面的黏附力無(wú)論是細(xì)胞核區(qū)還是細(xì)胞質(zhì)區(qū)，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞和成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞的楊氏模量和黏附力比較Tab 1 Comparison of Young’s modulus and adhesion of chondrocyte-like cells and fi broblast-like cells

3 討論

顳下頜關(guān)節(jié)盤(pán)細(xì)胞的分型一直存在爭(zhēng)議，通常將兩種類(lèi)型的關(guān)節(jié)盤(pán)細(xì)胞稱(chēng)為軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞和成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞[11-12]。光鏡和電子顯微鏡觀察顯示，軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞具有軟骨細(xì)胞典型的短小的細(xì)胞突起，具有成軟骨性；成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，是關(guān)節(jié)盤(pán)細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)細(xì)胞[5-6,13]，但是兩種細(xì)胞的生物學(xué)功能目前尚不十分清楚。

AFM掃描的細(xì)胞表面形貌是對(duì)電鏡和熒光顯微鏡觀察的有效補(bǔ)充，它能夠?qū)μ幱谂囵B(yǎng)液中細(xì)胞的表面形貌及生理狀態(tài)下的力學(xué)特性作實(shí)時(shí)觀察[14]。本實(shí)驗(yàn)利用AFM對(duì)兩種類(lèi)型的關(guān)節(jié)盤(pán)細(xì)胞的表面超微結(jié)構(gòu)作成像對(duì)比，結(jié)果可見(jiàn)：軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞較成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞體積略小，細(xì)胞核占細(xì)胞體的大部分，細(xì)胞邊緣伸出許多偽足，骨架結(jié)構(gòu)縱橫交錯(cuò)，覆蓋整個(gè)細(xì)胞體；成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，細(xì)胞核部分明顯高出細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞質(zhì)均勻平鋪在基底上，骨架結(jié)構(gòu)規(guī)則排列在整個(gè)細(xì)胞質(zhì)部分。細(xì)胞表面粗糙度是用來(lái)監(jiān)測(cè)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子之間的反應(yīng)并能夠反映細(xì)胞表面組成成分的一項(xiàng)指標(biāo)[15]，本研究?jī)煞N細(xì)胞的表面粗糙度沒(méi)有明顯差異，說(shuō)明兩種類(lèi)型細(xì)胞的表面組成成分可能是相近的。

AFM不僅可以觀察細(xì)胞形貌[16]，也可以通過(guò)力學(xué)曲線(xiàn)模式測(cè)定細(xì)胞的力學(xué)性能[17]，力-位移曲線(xiàn)能夠反映所加載的負(fù)荷和細(xì)胞形變之間的關(guān)系，例如細(xì)胞彈性，探針與細(xì)胞表面小分子相互作用的差異等[18]。AFM是從納米微觀尺度對(duì)組織不同區(qū)域的特殊位點(diǎn)剛性檢測(cè)的有效方法。AFM有兩種加載模式：輕敲和接觸模式。輕敲模式采用垂直向加載，接觸模式主要為水平向加載，兩種模式都可以復(fù)原細(xì)胞形貌，本實(shí)驗(yàn)采用后者。AFM在輕敲模式下的加載力為0.1～1 nN，在接觸模式下為10～40 nN，不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成不可逆的形變，對(duì)細(xì)胞復(fù)原無(wú)影響；但是需要說(shuō)明的是，多數(shù)實(shí)驗(yàn)中采用的探針加載力值為經(jīng)驗(yàn)值。本實(shí)驗(yàn)采用恒定側(cè)向加載的方式，經(jīng)驗(yàn)值（Setpoint）為0.533 nN，說(shuō)明JPK Nano Wizard 3 型生物AFM用于細(xì)胞形貌觀察的力值精度較以前的AFM更為理想。有研究[19]發(fā)現(xiàn)，軟骨細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的剛性比為1.4。本研究分別測(cè)定了細(xì)胞核區(qū)和細(xì)胞質(zhì)區(qū)的剛性和黏附力，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核區(qū)的剛性比細(xì)胞質(zhì)區(qū)要大。成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)大部分分布在細(xì)胞質(zhì)區(qū)，而軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)相對(duì)集中于細(xì)胞核區(qū)，兩種細(xì)胞細(xì)胞核區(qū)的剛性相近，而細(xì)胞質(zhì)區(qū)略有差異，成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞的剛性略大于軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞；黏附力在兩種細(xì)胞的細(xì)胞核區(qū)和細(xì)胞質(zhì)區(qū)的差異均不明顯，說(shuō)明黏附性跟細(xì)胞整體特性相關(guān)，不是由局部部位決定。

細(xì)胞力學(xué)性能對(duì)細(xì)胞與細(xì)胞之間的黏附性能（黏彈性變性）有重要的影響[20]，楊氏模量、細(xì)胞表面粗糙度和細(xì)胞黏附性之間存在正相關(guān)關(guān)系[21]，黏附事件的發(fā)生與細(xì)胞表面蛋白解聚和受體-配體、細(xì)胞骨架蛋白有關(guān)[22]。黏附性通常反映細(xì)胞表面小分子物質(zhì)的情況，單個(gè)黏附分子可以反映整體細(xì)胞的黏附特性[23]；本研究中關(guān)節(jié)盤(pán)兩種類(lèi)型細(xì)胞的黏附力沒(méi)有明顯差異，表明細(xì)胞表面的小分子物質(zhì)是相近的。兩種類(lèi)型的細(xì)胞雖然在形態(tài)學(xué)和分布上存在一定的差異，但是從目前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，關(guān)節(jié)盤(pán)細(xì)胞在生物力學(xué)特性上的差異并不明顯。這可能有兩方面的原因：一方面是兩種類(lèi)型的細(xì)胞在發(fā)育和成熟階段所起的力學(xué)作用沒(méi)有差異；另一方面可能是不同細(xì)胞在特定階段的力學(xué)效應(yīng)表現(xiàn)一致，可以相互轉(zhuǎn)化。這還需要今后對(duì)細(xì)胞受力后的內(nèi)部和外部反應(yīng)進(jìn)行深入研究。

本實(shí)驗(yàn)利用AFM從納米尺度對(duì)軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞和成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞的表面結(jié)構(gòu)進(jìn)行描述，并對(duì)比其生物力學(xué)特性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：兩種類(lèi)型的細(xì)胞在形態(tài)結(jié)構(gòu)上的差異較大，但其生物力學(xué)特性相近。通過(guò)黏附力對(duì)比分析和黏附相關(guān)蛋白的檢測(cè)可以闡明細(xì)胞去分化的機(jī)制[24]，這為以后顳下頜關(guān)節(jié)盤(pán)組織工程研究中種子細(xì)胞的選擇提供了思路。

致謝：感謝蘭州大學(xué)土木工程與力學(xué)學(xué)院生物力學(xué)與醫(yī)學(xué)工程研究所張寶平博士在本課題AFM觀察部分給予的大力協(xié)助！

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