伊犁黑蜂蜂膠對口腔主要致齲細菌生物膜作用的實驗研究

于倩 林靜 祖力卡爾江·阿合買提 趙今

新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院牙體牙髓病科·新疆維吾爾自治區(qū)口腔醫(yī)學研究所，烏魯木齊 830054

齲病是被世界衛(wèi)生組織列為人類重點防治的非傳染性疾病。牙菌斑生物膜與齲病的發(fā)生有密切的關系，它是存在于牙面的一個細菌生態(tài)環(huán)境，細菌在其中生長、發(fā)育、衰亡又不斷新生，并進行著復雜的物質(zhì)代謝，在一定條件下，細菌及其代謝產(chǎn)物會對牙齒產(chǎn)生破壞[1]。單純使用機械的方法并不能完全清除覆蓋于牙面的所有菌斑，因此使用藥物控制菌斑是必不可少的補充。蜂膠是一種天然的抗菌劑，安全無毒副作用，由于地域、季節(jié)和植物的不同，蜂膠的成分具有多樣性和差異性[2-3]。本研究采用新疆伊犁黑蜂蜂膠，通過其對口腔常見致齲菌單菌生物膜生長及代謝的影響，探討伊犁黑蜂蜂膠抗菌防齲的效果及可能的防齲機制。

1 材料和方法

1.1 黑蜂蜂膠醇粗提物的制備

蜂膠采自新疆伊犁尼勒克縣種蜂場。將粗蜂膠置于-20 ℃冰箱中過夜后在研缽內(nèi)粉碎，使用水浴法（m︰v=1︰8）在70 ℃下水浴除蠟，再用冷浸法提純蜂膠。稱取15 g除蠟蜂膠粉碎后按照固液比1︰5的比例，加70%乙醇75 mL（雖然70%的乙醇具有一定的抑菌能力，但是蜂膠醇溶液在梯度稀釋過程中乙醇的濃度也被稀釋得極低，蜂膠醇溶液中所含乙醇的濃度早已不具備抑菌的能力），封口后浸泡2周。濾去沉渣，蜂膠原重量減去沉渣干燥后的重量，配制成100 mg·mL-1蜂膠醇溶液，用1 mol·L-1NaOH調(diào)整pH=7.0后經(jīng)0.22 μm的無菌濾器過濾備用[4-5]。

1.2 實驗試劑和儀器

腦心浸液培養(yǎng)基（brain heart infusion，BHI）、厭氧發(fā)生劑、厭氧指示劑（梅里埃公司，法國），無菌脫纖維蛋白羊血（新疆醫(yī)科大學動物實驗中心提供），95%乙醇分析純（天津富宇精細化工有限公司），氯化血紅素（上海源葉生物科技有限公司），蒽酮試劑（天津市福晨化學試劑廠），葡聚糖T-40（北京索萊寶科技有限公司），濃硫酸（北京化工廠）。

垂直流超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司），隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海博訊實業(yè)有限公司），厭氧罐（三菱株式會社，日本），pH計（上海雷磁儀器廠）。

1.3 實驗菌株與菌液制備

變異鏈球菌（Streptococcus mutans ATCC 25175）、表兄鏈球菌（Streptococcus sobrinus ATCC 6715）、血鏈球菌（Streptococcus sanguis ATCC 10556）、黏性放線菌（Actinomyces viscosus ATCC 19246）、內(nèi)氏放線菌（Actinomyces naeslundii ATCC 12104）均購買于美國模式培養(yǎng)物集存庫（American Type Culture Collection）。

將凍存菌株接種于BHI血瓊脂培養(yǎng)基中，80%N2、20%CO2、37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，觀察菌落生長形態(tài)。隨機取單個菌落涂片鏡檢無污染，生化鑒定確定純培養(yǎng)后，再次接于血瓊脂培養(yǎng)基，80%N2、20%CO2、37 ℃下厭氧培養(yǎng)48 h后，取形態(tài)一致的菌落溶于BHI液體培養(yǎng)基中，采用麥氏比濁法測定細菌懸液濃度至3×106CFU·mL-1備用。

1.4 方法

1.4.1 黑蜂蜂膠對單菌最小生物膜清除濃度（minimum bio fi lm eradication concentration，MBEC）的測定 在96孔板中分別加入菌懸液50 μL和含1%蔗糖的BHI液體培養(yǎng)基150 μL，置于37 ℃下厭氧培養(yǎng)24 h形成生物膜。吸出96孔板中上清液，PBS洗去浮游菌，加入200 μL已梯度稀釋后的含藥BHI液體培養(yǎng)基，37 ℃下厭氧培養(yǎng)24 h。去上清液，PBS清洗3次以去浮游菌，室溫下干燥30 min，每孔加入0.1%結(jié)晶紫200 μL振蕩培養(yǎng)20 min后吸出，PBS清洗3次，室溫下干燥。每孔加入95%乙醇200 μL，振蕩培養(yǎng)1 h后將乙醇吸出至另一96孔板中，酶標儀在OD570處讀數(shù)，MBEC為OD值突然升高前的臨界值[6-7]。實驗重復3次。

1.4.2 黑蜂蜂膠對單菌生物膜產(chǎn)酸水平影響的測定將24 mm×24 mm無菌蓋玻片置于6孔板中，加入菌懸液1 mL和含1%蔗糖的BHI液體培養(yǎng)基5 mL，調(diào)定初始pH=7.0，放入?yún)捬跸渲?7 ℃下培養(yǎng)24 h形成生物膜。根據(jù)各測試菌MBEC的測定結(jié)果，選取MBEC值及以下的3個蜂膠粗提物濃度梯度配置成BHI液體培養(yǎng)基，吸出6孔板中BHI液體培養(yǎng)基，分別加入已梯度稀釋的含藥培養(yǎng)基5 mL，放入?yún)捬跸渲?7 ℃下培養(yǎng)24 h。吸出6孔板內(nèi)培養(yǎng)基放入離心管內(nèi)離心（8 000 r·min-1，4 ℃下離心30 min），測定離心后的上清測pH值，并計算pH值的變化值（ΔpH值），ΔpH值=初始pH值（7.0）-終末pH值。

1.4.3 黑蜂蜂膠對單菌生物膜合成水不溶性胞外多糖影響的測定 選擇主要產(chǎn)糖菌變異鏈球菌來研究蜂膠對其產(chǎn)水不溶性胞外多糖的影響。生物膜形成同上。根據(jù)各測試菌MBEC的測定結(jié)果，選取MBEC值及以下的3個蜂膠粗提物濃度梯度配置成含藥BHI液體培養(yǎng)基分別加入到6孔板中，置厭氧箱中37 ℃下培養(yǎng)24 h。去上清，PBS沖洗蓋玻片3次，用無菌刀片將菌膜輕輕刮至15 mL離心管中，加5 mL蒸餾水洗滌、離心2次（10 000 r·min-1，15 min），水洗后的沉淀加0.4 mol·L-1NaOH 5 mL洗滌、離心2次（10 000 r·min-1，15 min），合并上清作為樣本，使用蒽酮法檢測水不溶性胞外多糖含量。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，對各組數(shù)據(jù)先行方差齊性檢驗，若方差齊選用單因素方差分析LSD法；若方差不齊，先行秩和檢驗，各組有差異后用單因素方差分析Dunnett法。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 黑蜂蜂膠對單菌生物膜MBEC的測定結(jié)果

黑蜂蜂膠對變異鏈球菌、表兄鏈球菌、血鏈球菌、黏性放線菌、內(nèi)氏放線菌單菌生物膜MBEC的測定結(jié)果分別為6.25、1.56、3.13、0.78、0.78 mg·mL-1。結(jié)果表明，黑蜂蜂膠對所有測試菌株單菌生物膜均具有不同程度的清除作用。

2.2 黑蜂蜂膠對單菌生物膜產(chǎn)酸水平的影響

黑蜂蜂膠對單菌生物膜產(chǎn)酸水平的影響見表1。在各自MBEC以下4個濃度（包括MBEC濃度）時均可抑制測試菌的產(chǎn)酸，并呈現(xiàn)劑量依賴趨勢。各組與對照組間差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表1 蜂膠對測試菌單菌生物膜ΔpH值的影響Tab 1 ΔpH values of the bio fi lm in different concentration of propolis

2.3 黑蜂蜂膠對變異鏈球菌單菌生物膜合成水不溶性胞外多糖的影響

蜂膠MBEC濃度組、蜂膠1/2MBEC濃度組、蜂膠1/4MBEC濃度組、蜂膠1/8MBEC濃度組、空白對照組變異鏈球菌單菌生物膜合成水不溶性胞外多糖的測量結(jié)果分別為（0.036 5±0.000 65）、（0.057 1±0.002 42）、（0.065 9±0.003 21）、（0.073 4±0.003 86）、（0.083 8±0.014 83） mg·mL-1。蜂膠在MBEC及1/2MBEC濃度時對變異鏈球菌單菌生物膜狀態(tài)下合成胞外多糖有抑制作用，與對照組相比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

3 討論

菌斑生物膜是齲病發(fā)生的始動因素，與浮游菌相比，菌斑生物膜內(nèi)細菌的毒力、耐藥性和抵抗宿主免疫防御的能力更強[8]。而且在自然狀態(tài)下，細菌鮮少能以游離純培養(yǎng)的狀態(tài)存在，因此僅僅針對游離狀態(tài)致齲細菌的研究并不能作為其對菌斑生物膜內(nèi)細菌抑制作用效果的評價，為了更全面地評價藥物的防齲效果，對生物膜狀態(tài)下致齲細菌的研究必不可少。本課題組前期已完成黑蜂蜂膠對主要致齲細菌游離狀態(tài)下的相關實驗研究，結(jié)果顯示其對游離狀態(tài)下細菌的生長、產(chǎn)酸、產(chǎn)糖均有不同程度的抑制作用，現(xiàn)關于黑蜂蜂膠對口腔主要致齲細菌單菌生物膜的作用進行一系列實驗研究。

生物膜MBEC的實驗結(jié)果表明，黑蜂蜂膠能滲透單菌生物膜并殺死膜內(nèi)細菌，并有效清除口腔主要致齲菌的單菌生物膜，但對于不同的菌株其作用效果具有一定差異。根據(jù)課題組前期研究結(jié)果提示伊犁黑蜂蜂膠對變異鏈球菌、表兄鏈球菌、血鏈球菌、黏性放線菌、內(nèi)氏放線菌的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）分別為0.78、0.39、0.39、0.20、0.20 mg·mL-1。MBEC濃度和相應MIC濃度相比高出4～8倍，但抗生素對細菌生物膜生長抑制的劑量比浮游狀態(tài)下同種細菌抑菌劑量高100～1 000倍[9-10]。相比之下，蜂膠對菌斑生物膜和對浮游菌的抑制作用的濃度相差并不十分明顯，其對菌斑生物膜的抑制作用機制雖待進一步的研究，但可以肯定的是蜂膠同抗生素相比，毒副作用小，安全性高。

同時，通過檢測單菌生物膜ΔpH的變化，發(fā)現(xiàn)蜂膠在MBEC以下的濃度時即可抑制生物膜內(nèi)細菌的產(chǎn)酸能力，并且隨著蜂膠劑量的增加，抑制效果隨之增加。細菌的致齲性與其產(chǎn)酸、耐酸性相關，牙菌斑生物膜中產(chǎn)酸性最強的為鏈球菌，其中變異鏈球菌群尤勝。變異鏈球菌群的產(chǎn)酸力與主要毒力因子乳酸脫氫酶活性密切相關，而耐酸性則由質(zhì)子移位膜ATP酶和最適pH決定[1]，阻斷任意途徑即可達到抑制效果。Duarte等[11]研究表明，巴西6型蜂膠可減少變異鏈球菌、表兄鏈球菌生物膜的產(chǎn)酸量，并抑制質(zhì)子移位膜ATP酶的活性。Jeon等[12]研究表明蜂膠提取物反金合歡醇可通過增加胞膜的質(zhì)子通透性影響變異鏈球菌在游離和生物膜狀態(tài)下的產(chǎn)酸耐酸的能力。而本實驗中黑蜂蜂膠抑制生物膜產(chǎn)酸的機制是否與上述相似，可否抑制乳酸脫氫酶活性，還待進一步研究。

此外，實驗以變異鏈球菌為對象，研究了伊犁黑蜂蜂膠對其單菌生物膜狀態(tài)下合成水不溶性胞外多糖能力的影響。水不溶性胞外多糖能促進菌斑生物膜的形成，參與生物膜基質(zhì)的組成，既能將細菌黏附于牙面又對生物膜起支撐和屏障作用。本實驗結(jié)果表明伊犁黑蜂蜂膠可抑制生物膜狀態(tài)下水不溶性胞外多糖的產(chǎn)生，推測由此可減少生物膜內(nèi)基質(zhì)，降低生物膜密度，增加其滲透性，從而影響生物膜正常結(jié)構。有相關研究[13]表明，蜂膠可對變異鏈球菌游離狀態(tài)及生物膜狀態(tài)中的葡糖基轉(zhuǎn)移酶（glucosyltransferase，GTFs）B、C活性產(chǎn)生抑制作用；蜂膠中不同成分在不同程度上均可抑制包括游離和生物膜狀態(tài)下的GTFB、C、D的活性[14]。可推測黑蜂蜂膠作用機制與上述相似。

綜上所述，伊犁黑蜂蜂膠能夠有效清除口腔主要致齲細菌單菌生物膜，對其生物膜產(chǎn)酸均有明顯抑制作用，并且能有效抑制變異鏈球菌生物膜合成水不溶性胞外多糖的能力。推測伊犁黑蜂蜂膠對致齲過程的多個環(huán)節(jié)均有作用，可對不同致齲毒力因子產(chǎn)生不同程度的影響。在本研究中以單菌生物膜狀態(tài)為對象，但自然條件下牙菌斑生物膜為多菌混合生長，因此對多菌生物膜的研究勢在必行，且評估蜂膠對致齲細菌的主要毒力因子相關的酶和基因的影響亦十分重要。本課題組將進一步研究，探討其防齲機制，為開發(fā)具有防齲潛能的天然藥物奠定實驗基礎。

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