第5天冷凍囊胚解凍培養(yǎng)4h與過夜培養(yǎng)20h移植的臨床結(jié)局比較

習(xí)海濤，葛紅山，池海虹，陳華，朱春芳，張帆，呂杰強(qiáng)

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 生殖中心，浙江 溫州 325027）

第5天冷凍囊胚解凍培養(yǎng)4h與過夜培養(yǎng)20h移植的臨床結(jié)局比較

習(xí)海濤，葛紅山，池海虹，陳華，朱春芳，張帆，呂杰強(qiáng)

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 生殖中心，浙江 溫州 325027）

目的：通過比較第5天冷凍囊胚解凍培養(yǎng)4 h與過夜培養(yǎng)20 h后移植的臨床結(jié)局，探討囊胚解凍后到移植用以培養(yǎng)的適宜時間。方法：在第5天冷凍囊胚解凍移植周期中，按照囊胚解凍后到移植用以培養(yǎng)的時間不同分為2組：解凍4 h后移植組（A組，移植周期157個，囊胚268枚）和提前解凍過夜培養(yǎng)20 h后移植組（B組，移植周期227個，囊胚370枚），比較其妊娠結(jié)局。結(jié)果：B組的囊胚孵化率明顯高于A組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；B組周期取消率稍高于A組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；B組在平均移植胚胎個數(shù)上稍少于A組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；A、B 2組在臨床妊娠率、胚胎種植率、流產(chǎn)率和多胎妊娠率上差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：囊胚提前解凍過夜培養(yǎng)20 h與培養(yǎng)4 h后移植的臨床結(jié)局無明顯差異，操作人員對于囊胚解凍時間上將有更多選擇。

囊胚；玻璃化冷凍；解凍；過夜培養(yǎng)；移植

近年來，輔助生殖技術(shù)發(fā)展迅速，商業(yè)化的序貫培養(yǎng)液的應(yīng)用提高了胚胎由卵裂期發(fā)育到囊胚的概率，囊胚培養(yǎng)技術(shù)日趨成熟完善。因囊胚具有較好的發(fā)育潛能，進(jìn)行新鮮的囊胚移植往往能得到較高成功率。越來越多的胚胎能夠被順利培養(yǎng)至囊胚后進(jìn)行移植，這勢必也會增加囊胚冷凍的數(shù)量，也使冷凍囊胚復(fù)蘇周期移植越來越普遍。冷凍胚胎移植可以減少卵巢過度刺激綜合征（ovarian hyperstimulation syndrome，OHSS）的危害［1-2］，子宮內(nèi)膜容受性更好［3］，也能降低異位妊娠率，提高成功率［4］。

一般認(rèn)為，體外培養(yǎng)環(huán)境無法完全模擬子宮內(nèi)環(huán)境，解凍胚胎復(fù)蘇后胚胎應(yīng)盡快移入母體。有學(xué)者［5］研究發(fā)現(xiàn)解凍囊胎移植前培養(yǎng)4～6 h，囊胚即可恢復(fù)活力。但也有人［6-7］認(rèn)為解凍囊胎移植前過夜培養(yǎng)20 h，效果更好。囊胚解凍后培養(yǎng)多久進(jìn)行移植，目前還不明確。本研究回顧性分析本中心近3年的囊胚解凍復(fù)蘇周期的病例資料，觀察比較囊胚提前解凍過夜培養(yǎng)20 h與提前4 h解凍后移植對妊娠結(jié)局的影響，以探討囊胚解凍后到移植用以培養(yǎng)的適宜時間。

1 對象和方法

1.1 研究對象 將2011年7月至2014年2月在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院生殖中心進(jìn)行冷凍胚胎移植人工周期解凍第5天囊胚列入本研究中。根據(jù)Gardner囊胚評分系統(tǒng)對形成的囊胚進(jìn)行評分［8］，評分4AA、4BB、4AB、4BA、3AA、3BB、3AB、3BA的囊胚視為優(yōu)質(zhì)囊胚。冷凍前胚胎沒有孵化。所有患者均簽署了冷凍移植的知情同意書。

1.2 分組 根據(jù)移植前解凍時間，將患者分為2組：A組為冷凍囊胚解凍后約4 h后移植，共計解凍168個周期（280枚囊胚），移植157個周期（268枚囊胚）；B組為冷凍囊胚解凍后約20 h（過夜）培養(yǎng)后移植，共計解凍248個周期（401枚囊胚），移植227個周期（370枚囊胚）。移植囊胚不超過2個。

1.3 玻璃化冷凍和解凍 玻璃化冷凍與解凍程序均按照加藤公司（Kitazato，Japan）操作說明進(jìn)行。解凍后所有囊胚均進(jìn)行激光輔助孵化。

1.4 內(nèi)膜準(zhǔn)備 本研究為減少內(nèi)膜不同準(zhǔn)備方案所帶來的差異，僅將使用較多的激素替代周期列入本研究中。激素替代周期用于閉經(jīng)、月經(jīng)不規(guī)律、無排卵且對克羅米芬及小劑量人類絕經(jīng)期促性腺激素（human menopausal gonadot ropin，HMG）無反應(yīng)的患者，于月經(jīng)周期第2～第3天口服補(bǔ)佳樂2～9 mg（拜耳醫(yī)藥，德國），根據(jù)內(nèi)膜生長情況調(diào)整劑量及用藥天數(shù)。

1.5 胚胎移植的時間 激素替代周期主要依據(jù)陰道B超下子宮內(nèi)膜厚度，當(dāng)≥8 mm時肌注黃體酮60～80 mg/d使內(nèi)膜轉(zhuǎn)化為分泌期，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組于內(nèi)膜準(zhǔn)備（黃體酮注射的120 h左右）第5天進(jìn)行胚胎移植。

1.6 黃體支持 激素替代周期用雌激素（補(bǔ)佳樂）+黃體酮支持，移植后依據(jù)患者情況連續(xù)或間斷給人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadot ropin，hCG）支持。

1.7 妊娠結(jié)局的判定 于移植后第14天測尿妊娠試驗(yàn)及血β-hCG以確定有無妊娠。如β-hCG＞25 mIU/mL為生化妊娠，如患者于移植后28 d陰道B超見宮內(nèi)有孕囊，確定為臨床妊娠。

1.8 隨診 懷孕前3個月于本中心隨診，之后采用電話隨診。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理方法 運(yùn)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析?？ǚ椒治雠R床因素與治療結(jié)局，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析A、B組患者年齡、內(nèi)膜厚度、平均移植胚胎個數(shù)等基本情況。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組患者基本情況比較 從表1可知，A、B 2組臨床因素、年齡、hCG日內(nèi)膜厚度、平均移植胚胎個數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 2組患者基本情況比較

表1 2組患者基本情況比較

注：本表中不含解凍后取消移植周期

組別　　臨床因素（%）　　年齡（歲）　hCG日內(nèi)膜厚度（mm）　平均移植胚胎個數(shù)男方因素　　女方因素　　雙方因素A組　26.1（41/157）　35.0（55/157）　38.9（61/157）　33.31±0.21　8.64±0.42　1.71（268/157）B組　24.2（55/227）　37.9（86/227）　37.9（86/227）　32.35±0.47　8.37±0.12　1.63（370/227）

2.2 解凍胚胎不同培養(yǎng)時間發(fā)育潛能比較 從表2可知，過夜培養(yǎng)的B組囊胚存活率明雖低于A組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；B組的囊胚孵化率明顯高于A組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；2組間周期取消率、囊胚優(yōu)胚率、移植囊胚優(yōu)胚率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 解凍胚胎不同培養(yǎng)時間臨床結(jié)局比較 從表3可知，2組臨床妊娠率、胚胎種植率、流產(chǎn)率和多胎妊娠率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

囊胚移植受到越來越多的關(guān)注。盡管不論移植新鮮或者冷凍囊胚都能獲得較高的成功率，但是對于冷凍囊胚解凍后培養(yǎng)多久再去移植，目前學(xué)界尚無定論。解凍后培養(yǎng)的時間又會影響到囊胚的發(fā)育甚至臨床結(jié)局，因此這一問題也亟待解決。相關(guān)研究［5］表明囊胚解凍后至恢復(fù)活力一般需要4～6 h。在這4～6 h中，由于時間太短而不能觀察到胚胎解凍后復(fù)蘇情況，而提前解凍過夜培養(yǎng)則可以解決這一問題，由于時間較長，也有利于工作安排。

表2 解凍胚胎不同培養(yǎng)時間發(fā)育潛能比較（%）

表3 解凍胚胎不同培養(yǎng)時間臨床結(jié)局比較（%）

在Gueri f等［6］的研究中，囊胚提前解凍培養(yǎng)20 h與培養(yǎng)4 h相比，妊娠率明顯提高（分別為27% 和8%，P＜0.05），因此認(rèn)為囊胚提前解凍過夜培養(yǎng)的效果更好。本研究中的臨床妊娠率（2組分別為60.4%和59.9%）遠(yuǎn)高于Guerif等［6］的研究，且囊胚解凍后過夜培養(yǎng)20 h與培養(yǎng)4 h比較，在囊胚存活率、臨床妊娠率、種植率方面并沒有顯示出明顯優(yōu)勢。筆者認(rèn)為出現(xiàn)這樣的結(jié)果主要得益于近年來冷凍技術(shù)的不斷提高和培養(yǎng)體系的不斷改進(jìn)，胚胎體外培養(yǎng)的環(huán)境越來越接近于體內(nèi)，胚胎在體外的發(fā)育潛能得到了進(jìn)一步的提高；另外，Gueri f等［6］采用的是程序化冷凍，而本研究采用的是玻璃化冷凍復(fù)蘇技術(shù)。

提前20 h解凍過夜培養(yǎng)與當(dāng)天解凍培養(yǎng)4 h再移植相比，流產(chǎn)率、多胎妊娠率有下降趨勢，但是差異無統(tǒng)計學(xué)意義，筆者推測可能是由于過夜培養(yǎng)有助于淘汰發(fā)育潛能差的胚胎，而降低了這部分差的胚胎著床后的流產(chǎn)率，同時，也造成過夜培養(yǎng)后平均移植胚胎數(shù)少于培養(yǎng)4 h組（本研究中，A組為1.63，B組為1.71），多胎率自然也低一些。

本研究中，過夜培養(yǎng)的囊胚的孵化率高達(dá)86.5%，解凍后培養(yǎng)4 h的囊胚孵化率僅為41.8%，此結(jié)果可能是由于培養(yǎng)時間過短，無法觀察到囊胚孵化造成。而種植率及臨床妊娠率在過夜培養(yǎng)與培養(yǎng)4 h之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。有研究［9-11］認(rèn)為正在孵化或已經(jīng)孵化的囊胚具有更好的發(fā)育潛能從而獲得更為積極的臨床結(jié)局，這與本研究結(jié)果不同。筆者認(rèn)為當(dāng)天解凍移植的囊胚可能需要更多的時間培養(yǎng)進(jìn)行孵化，但并不能否定胚胎的質(zhì)量；同時也證明本研究選擇了正確的質(zhì)量好的囊胚凍存。

在本研究中，B組提前解凍周期共解凍401枚胚胎，移植前仍存活370枚，有31枚胚胎停滯發(fā)育并退化，248個周期中有21個周期因此取消移植（周期取消率為8.5%）。雖然與A組相比，周期取消率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但提前解凍可能增加取消周期的風(fēng)險［7］。B組提前解凍過夜培養(yǎng)20 h后選擇繼續(xù)發(fā)育的胚胎移植，淘汰解凍后發(fā)育差的囊胚，平均移植胚胎數(shù)目雖然較A組少，但胚胎種植率稍高于A組，2組間妊娠結(jié)局差異未達(dá)到統(tǒng)計學(xué)意義。顯然，對于發(fā)育潛能較好的囊胚延長體外培養(yǎng)時間，并獲得質(zhì)量高的囊胚，種植率更高，而對于發(fā)育潛能差的囊胚，如果培養(yǎng)過程中停育或死亡，則有可能增加周期取消率，因此可充分告知患者利弊，在有較多優(yōu)質(zhì)囊胚冷凍時，可以考慮提前解凍囊胚過夜培養(yǎng)后移植，以提高移植效率。

綜上所述，本研究證明，囊胚解凍移植前的4～20 h，患者可以根據(jù)自己的工作安排，方便地掌握解凍的時間，其臨床結(jié)果并不受到影響。

［1］ Absalan F，Ghannadi A，Kazerooni M. Rep roductive outcome follow ing thawed embryo transfer in management of ovarian hyperstimulation syndrome［J］. J Reprod In fertil，2013，14（3）：133-137.

［2］ D'Angelo A. Ovarian hyperstimulation syndrome prevention strategies：cryopreservation of all embryos［J］. Sem in Reprod Med，2010，28（6）：513-518.

［3］ Garcia-Velasco JA，Simón C. Blastocyst transfer：does it really affect the outcome？［J］. Curr Opin Obstet Gynecol，2001，13（3）：299-304.

［4］ Wong KM，Mastenbroek S，Repping S. Cryopreservation of human embryos and its contribution to in vitro fertilization success rates［J］. Fertil Steril，2014，102（1）：19-26.

［5］ Kader AA，Choi A，Orief Y，et al. Factors affecting the out-come of human blastocyst vitrif cation［J］. Reprod Biol Endocrinol，2009，7（9）：99.

［6］ Guerif F，Cadoret V，Poindron J，et al. Overnight incubation im proves selection of frozen-thawed blastocysts for transfer：prelim inary study using supernumerary embryos［J］. Theriogenology，2003，60（8）：1457-1466.

［7］ 岳超敏，方叢，宮曉，等. 囊胚解凍過夜培養(yǎng)后移植對妊娠結(jié)局的影響［J］. 中山大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)科學(xué)版），2013，34（3）：415-421.

［8］ Gardner DK，Lane M，Stevens J，et al. Blastocyst score affects implantation and pregnancy outcome：towards a single blastocyst transfer［J］. Fertil Steril，2000，73（6）：1155-1158.

［9］ Chimote NM，Chimote NN，Nath NM，et al. Transfer of spontaneously hatching or hatched blastocyst yields better pregnancy rates than expanded blastocyst transfer［J］. J Hum Reprod Sci，2013，6（3）：183-188.

［10］ Van Landuyt L，Stoop D，Verheyen G，et al. Outcome of closed blastocyst vitrif cation in relation to blastocyst quality：evaluation of 759 warm ing cycles in a single-embryo transfer policy［J］. Hum Reprod，2011，26（3）：527-534.

［11］ Leoni GG，Berlinguer F，Succu S，et al. A new selection criterion to assess good quality ovine blastocysts after vitrifcation and to predict their transfer into recipients［J］. M ol Reprod Dev，2008，75（2）：373-382.

（本文編輯：丁敏嬌）

Com parison of the pregnancy outcom es of frozen blastocyst transferred 4 hours after being thaw ed or 20 hours after being cu ltured overnight

XI Haitao，GE Hongshan，CHI Haihong，CHEN Hua，ZHU Chunfang，ZHANG Fan，LYU Jieqiang. Department of Reproductive Center，the Second Affliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou，325027

Objective：To compare the pregnancy outcomes when frozen blastocyst was transferred 4 hours after being thawed or 20 hours after being cultured overnight. Methods：For the 5 days freezing thaw ing blastocysts transplantation cycle，all the cycles are divided into two groups based on different culture time before transfer，those blastocysts transferred 4 hours after being thawed were labeled as A group （n=157） and those cultured overnight before being transferred the next day were included in B group （n=227）. The pregnancy outcomes were com pared betw een the tw o groups. Results：The proportion of thaw ing cycles leading to no transfer did not differ between groups （1.2% versus 2.2% for A and B，respectively）. However，the proportion of hatched blastocysts derived from B group was signif cantly higher than that from A group （41.7% versus 86.5%，respectively，P＜0.001）. All differences of the clinical pregnancy rate，implantation rate，m iscarriage rate and multiple pregnancy rate between two groups have not yet reached the statistical signif cance. Conclusion：Overnight culture of thawed blastocyst before transfer does not affect the main pregnancy outcomes. For blastocyst thawing time，operators will have more choices.

blastocyst； vitrif cation； thawed； overnight culture； transfer

R71.6

B DOI：10.3969/j.issn.2095-9400.2015.10.013

2014-11-18

溫州市科技局科研基金資助項(xiàng)目（Y20120136）。

習(xí)海濤（1983-），男，湖北棗陽人，助理研究員，碩士。