FGFR2功能增強(qiáng)對小鼠下頜骨髁突發(fā)育影響

梁鑫，張波，劉蘋，翁土軍，張莉，賀龍珠，李芳菲，屈晨，王萍

1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院口腔科，重慶 400016；

2.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所第四研究室，重慶 400042

FGFR2功能增強(qiáng)對小鼠下頜骨髁突發(fā)育影響

梁鑫1，張波2，劉蘋2，翁土軍2，張莉2，賀龍珠1，李芳菲2，屈晨1，王萍1

1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院口腔科，重慶 400016；

2.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所第四研究室，重慶 400042

成纖維細(xì)胞生長因子受體2(Fibroblast growth factor receptor,FGFR2)是參與調(diào)控骨骼發(fā)育的重要分子，在調(diào)控軟骨內(nèi)成骨過程中發(fā)揮著重要作用。為了探討FGFR2功能增強(qiáng)對小鼠下頜骨髁突生長發(fā)育的影響，文章以FGFR2功能增強(qiáng)型點突變(Fgfr2+/S252W)小鼠為研究對象，采用番紅固綠染色研究Fgfr2+/S252W小鼠下頜骨髁突不同生長發(fā)育階段的組織形態(tài)；利用免疫細(xì)胞化學(xué)染色和實時熒光定量PCR方法檢測X型膠原(Col X)在3周齡小鼠髁突肥大軟骨細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果顯示，1周齡、3周齡和6周齡突變型小鼠下頜骨髁突的軟骨細(xì)胞層寬度都比同窩野生型窄，鈣化軟骨細(xì)胞層退化時間早，骨小梁鈣化綠染程度深；Col X在突變型小鼠下頜骨髁突的表達(dá)高于同窩野生型小鼠(P<0.001)。結(jié)果表明，F(xiàn)GFR2功能增強(qiáng)可導(dǎo)致小鼠下頜骨髁突軟骨層組織形態(tài)異常，抑制髁突軟骨內(nèi)成骨，從而導(dǎo)致下頜骨髁突發(fā)育畸形。

下頜骨；髁突；成纖維細(xì)胞生長因子受體2

下頜骨髁突的發(fā)育由軟骨內(nèi)成骨完成[1]。軟骨內(nèi)成骨受多種生長因子介導(dǎo)的信號通路調(diào)控，其中成纖維細(xì)胞生長因子(Fibroblast growth factors, FGFs)是參與軟骨內(nèi)成骨的重要分子[2]。FGFs需與其特異性的受體 FGFR(Fibroblast growth factor receptor)1~4[3]結(jié)合才能發(fā)揮功能。

Apert綜合征(Apert syndrome,AS)是一種常見的人類顱縫早閉綜合征，以冠狀縫早閉、顱頜面部畸形、下頜反畸形、侏儒和并指/趾為典型體征。研究表明，AS主要由兩種FGFR2功能增強(qiáng)型點突變，即Fgfr2 Ser252Trp或者Pro253Arg突變引起，其中 66%的 AS由 Fgfr2 Ser252Trp突變引起[4]。Fgfr2+/S252W小鼠為Fgfr2 Ser252Trp突變小鼠，該突變小鼠導(dǎo)致FGFR2與配體結(jié)合的范圍擴(kuò)大，從而使靶細(xì)胞的FGFR2功能持續(xù)增強(qiáng)[5]。

Fgfr2+/S252W突變小鼠有明顯的顱頜面畸形，類似人類Apert綜合征顱骨表型，即圓顱和短顱畸形，同時伴有嚴(yán)重的反畸形。Fgfr2+/S252W小鼠是研究AS患者下頜反畸形的良好動物模型[6]。本研究選用不同生長發(fā)育階段的Fgfr2+/S252W小鼠為研究對象，通過對Fgfr2+/S252W小鼠及同窩野生型小鼠的下頜骨髁突進(jìn)行組織學(xué)及分子生物學(xué)對比研究，探索FGFR2功能增強(qiáng)對下頜骨髁突發(fā)育的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

Fgfr2+/S252W-neo小鼠購自美國國立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health，NIH)。EIIA-Cre、C57BL/6J小鼠由解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實驗動物中心提供。Fgfr2+/S252W小鼠由Fgfr2+/S252W-neo小鼠和EIIA-Cre小鼠交配后獲得。所有小鼠遺傳背景皆為C57BL/6J；所有小鼠均為SPF級。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計

小鼠基因型鑒定及實時熒光定量PCR(qRT-PCR)所需引物由上海生工生物工程技術(shù)股份有限公司合成。引物序列見表1。

1.2.2 Fgfr2+/S252W模型小鼠的保種繁殖

Fgfr2+/S252W-neo小鼠和EIIA-Cre小鼠進(jìn)行交配，子代將獲得約1/4數(shù)量的Fgfr2+/S252W小鼠，通過基因型鑒定明確為Fgfr2+/S252W突變小鼠后進(jìn)行后續(xù)實驗。Fgfr2+/S252W-neo小鼠和 EIIA-Cre小鼠分別與C57BL/6J野生型小鼠交配得以繁殖[7]。

表1 小鼠基因型鑒定及qRT-PCR引物序列

1.2.3 小鼠基因型鑒定

分別剪取出生10 d的EIIA-Cre、Fgfr2+/S252W-neo、Fgfr2+/S252W小鼠腳趾，經(jīng)組織提取獲得各自的基因組DNA。分別對Cre基因、neo基因、Fgfr2+/S252W小鼠基因組的突變位點進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系(PCR Amplification Kit(R011),TaKaRa)包括：2×PCR mix 10 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，DNA 1 μL，超純水補(bǔ)足體積20 μL。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性4 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，共35個循環(huán)；72℃延伸10 min。擴(kuò)增后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠自動成像儀記錄電泳圖譜。

1.2.4 番紅固綠染色

選取1周齡、3周齡和6周齡Fgfr2+/S252W小鼠及同窩對照野生型小鼠各3只，取右側(cè)下頜骨固定、脫鈣、酒精梯度脫水、二甲苯透明、包埋、切片。常規(guī)石蠟切片脫蠟、復(fù)水，番紅O(Sigma,USA)染色，流水沖洗，固綠(上海生工生物工程技術(shù)股份有限公司)染色，冰醋酸快速漂洗，流水沖洗，常規(guī)脫水、透明、封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.5 免疫細(xì)胞化學(xué)染色

選取3周齡Fgfr2+/S252W小鼠及同窩對照野生型小鼠各5只，取右側(cè)下頜骨固定、脫鈣、脫水、透明、包埋、切片。常規(guī)石蠟切片脫蠟、復(fù)水，參照試劑盒說明書(SP9001，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)SP法進(jìn)行抗 Col X(Rabbit polyclonal against mouse(ab58632)，Abcam)免疫細(xì)胞化學(xué)染色，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.6 實時熒光定量PCR檢測基因表達(dá)

選取3周齡Fgfr2+/S252W小鼠及同窩對照野生型小鼠各5只，解剖顯微鏡下分離得到小鼠右側(cè)下頜骨髁突軟骨層，提取總RNA(TRIzol,Invotrogen)，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，檢測軟骨晚期標(biāo)志基因Col X表達(dá)情況。PCR擴(kuò)增體系：2×master mix 10 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，cDNA2 μL，ROX 0.2 μL，ddH2O 7 μL(SYBR?Premix Ex Taq?II(RR820A), TaKaRa)。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃ 5 s，57℃ 30 s，40個循環(huán)；95℃ 15 s，57℃ 30 s至95℃15 s連續(xù)掃描，0.2℃/s進(jìn)行溶解曲線分析。以內(nèi)參基因(GAPDH)進(jìn)行校正。每次做3個復(fù)孔，每個基因重復(fù)3次。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)處理

Col X免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽性細(xì)胞的積分光密度值(IOD)及mRNA表達(dá)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，對兩樣本均數(shù)比較采用成組t檢驗方法。P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR產(chǎn)物電泳鑒定結(jié)果

圖1 小鼠基因型鑒定電泳圖A：EIIA-cre小鼠基因型鑒定結(jié)果(481 bp)，無條帶為野生型小鼠；B：Fgfr2+/S252W-neo小鼠基因型鑒定結(jié)果(400 bp)，無條帶為野生型小鼠；C：Fgfr2+/S252W小鼠基因型鑒定結(jié)果(520 bp/460 bp)，無條帶及單條帶者皆為野生型小鼠。MT：Fgfr2+/S252W小鼠；WT：野生型小鼠。

電泳結(jié)果顯示：位于481 bp處有單一條帶鑒定為EIIA-Cre小鼠，無條帶的為野生型小鼠(圖1A)；位于400 bp處有單一條帶鑒定為Fgfr2+/S252W-neo小鼠，無條帶的為野生型小鼠(圖1B)；位于460 bp處和520 bp處出現(xiàn)雙條帶鑒定為Fgfr2+/S252W小鼠，無條帶及單條帶的為野生型小鼠(圖1C)。

2.2 Fgfr2+/S252W小鼠顱頜面觀察

與同窩野生型小鼠相比，F(xiàn)gfr2+/S252W小鼠有明顯的反牙合畸形，下頜過度前伸，上下頜咬合關(guān)系異常；同窩野生型小鼠表現(xiàn)為正常的咬合關(guān)系(圖2)。

2.3 Fgfr2+/S252W小鼠髁突組織學(xué)觀察

出生早期(1周齡)(圖3：A，B)，野生型小鼠下頜骨髁突軟骨分層清楚，排列有序，從表面纖維層到肥大軟骨細(xì)胞層可見細(xì)胞由扁平逐漸向橢圓形、圓形過渡，大而圓的肥大軟骨細(xì)胞整齊排列于軟骨下骨化中心上方。Fgfr2+/S252W小鼠下頜骨髁突軟骨細(xì)胞分層清楚，但各層細(xì)胞排列不整齊，特別是肥大軟骨細(xì)胞層和鈣化軟骨細(xì)胞層，軟骨層厚度較野生型小鼠窄。Fgfr2+/S252W小鼠的肥大軟骨細(xì)胞大小不一，部分細(xì)胞可見細(xì)胞核消失，與鈣化軟骨細(xì)胞層界限不清；鈣化軟骨細(xì)胞層軟骨基質(zhì)已部分鈣化綠染，且染色程度較野生型小鼠深。小鼠生長發(fā)育中期(3周齡)(圖3：C，D)，F(xiàn)gfr2+/S252W小鼠髁突軟骨細(xì)胞層厚度較野生型小鼠明顯變薄，鈣化軟骨細(xì)胞層僅部分殘留，髁突軟骨下骨化中心骨小梁結(jié)構(gòu)較野生型更粗壯成熟。小鼠生長發(fā)育晚期(6周齡)(圖3：E，F(xiàn))，可明顯觀察到Fgfr2+/S252W小鼠軟骨細(xì)胞層更窄，增殖層和肥大層軟骨細(xì)胞數(shù)量明顯減少，而鈣化軟骨細(xì)胞層已完全被骨組織替代，骨小梁形態(tài)粗壯成熟。

圖2 突變型小鼠(MT(Fgfr2+/S252W))和同窩對照野生型小鼠(WT)顱頜面觀察左側(cè)突變型小鼠上下頜咬合關(guān)系異常，而右側(cè)野生型小鼠上下頜咬合關(guān)系正常。黑色箭頭指向上切牙。

2.4 免疫組化檢測Fgfr2+/S252W小鼠髁突Col X表達(dá)

采用Image-pro Plus 6.0圖像分析軟件對3周齡Fgfr2+/S252W小鼠和野生型小鼠髁突表達(dá)Col X的陽性細(xì)胞進(jìn)行積分光密度值(IOD)分析，結(jié)果表明Fgfr2+/S252W小鼠Col X的表達(dá)明顯高于野生型小鼠(P<0.001)(圖4：A，B，C)。

2.5 Fgfr2+/S252W小鼠髁突Col X mRNA的表達(dá)

3周齡Fgfr2+/S252W小鼠下頜骨髁突Col X mRNA的表達(dá)較野生型小鼠明顯上調(diào)(P<0.001)(圖4：D)。

3 討 論

下頜骨髁突發(fā)育由軟骨內(nèi)成骨完成[1]。全身骨骼除了顱骨和鎖骨等扁骨外，其他大部分的骨骼都是通過軟骨內(nèi)成骨發(fā)育形成。在這種成骨方式中，間充質(zhì)細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞，然后軟骨細(xì)胞增殖、分化并有序排列形成生長板，最后軟骨組織被骨組織替代形成骨骼[8]。其中生長板軟骨細(xì)胞的分化從靜息軟骨細(xì)胞開始，逐漸分化為增殖軟骨細(xì)胞，最后分化為肥大軟骨細(xì)胞[9]。

髁突軟骨是覆蓋于下頜骨髁突表面的一層結(jié)締組織，由纖維軟骨組成。髁突軟骨有其特有的“層域化”結(jié)構(gòu)[10]，各層界限分明，從外到里依次為：表面纖維層，增殖淺層，增殖深層，肥大軟骨細(xì)胞層，鈣化軟骨細(xì)胞層。增殖層細(xì)胞具有增殖分化功能，是髁突生長發(fā)育的細(xì)胞來源；肥大軟骨細(xì)胞是軟骨內(nèi)成骨過程中最為活躍的細(xì)胞，是調(diào)節(jié)骨生長的重要細(xì)胞；它是終末軟骨細(xì)胞，可以誘導(dǎo)血管生成、調(diào)節(jié)軟骨基質(zhì)的鈣化、最終引導(dǎo)骨組織生成[9]。X型膠原(Col X)是肥大軟骨細(xì)胞特異性合成的膠原，是肥大軟骨細(xì)胞特有的標(biāo)志蛋白，在軟骨內(nèi)成骨過程中發(fā)揮著重要作用[11]。髁突軟骨細(xì)胞層對顳下頜關(guān)節(jié)的發(fā)育及咬合關(guān)系的建立有著重要影響。

圖3 突變型小鼠(MT(Fgfr2+/S252W))和同窩對照野生型小鼠(WT)髁突番紅固綠染色A,C,E：突變型小鼠髁突組織切片；B,D,F；野生型小鼠髁突組織切片。A,B：1周齡小鼠；C,D：3周齡小鼠；E,F：6周齡小鼠。放大倍數(shù)：×400；bar：20μm。

圖4 突變型小鼠(MT(Fgfr2+/S252W))和同窩對照野生型小鼠(WT)髁突Col X的表達(dá)A：3周齡突變型小鼠髁突Col X免疫細(xì)胞化學(xué)染色；B：3周齡野生型小鼠髁突Col X免疫細(xì)胞化學(xué)染色；C：3周齡突變型和野生型小鼠髁突Col X陽性細(xì)胞的積分光密度值(IOD)統(tǒng)計(n=5)；D：3周齡突變型和野生型小鼠髁突Col X mRNA的表達(dá)(n=3)。放大倍數(shù)：×400；bar：20μm；***：P<0.001。

近年來大量研究發(fā)現(xiàn)FGF信號與骨骼發(fā)育及疾病有密切關(guān)系，其中FGFR1-3突變可導(dǎo)致顱縫早閉、顱頜面畸形、軟骨發(fā)育不良等人類骨骼發(fā)育疾病[12]。Yasuda等[13]報道Fgfr3 P244R點突變可導(dǎo)致顳下頜關(guān)節(jié)髁突發(fā)育缺陷。Fgfr2不同位點突變可導(dǎo)致各種遺傳疾病，如Apert綜合征(AS)[4]、Crouzon綜合征(CS)[14]和Pfeiffer綜合征(PS)[15]等，患者頜面部均表現(xiàn)出明顯的反牙合畸形。因此FGFR2/FGFs信號通路在調(diào)控下頜骨髁突發(fā)育中有著至關(guān)重要的作用。本文分別對Fgfr2+/S252W小鼠和野生型小鼠3個不同生長階段的下頜骨髁突進(jìn)行組織學(xué)研究，F(xiàn)gfr2+/S252W小鼠髁突軟骨細(xì)胞層厚度窄于野生型小鼠，表明FGFR2功能增強(qiáng)可使小鼠髁突軟骨細(xì)胞生長受到抑制。Fgfr2+/S252W小鼠髁突鈣化軟骨細(xì)胞層較同發(fā)育時期的野生型小鼠更早退化，髁突骨小梁較野生型小鼠更早形成，由此可見，F(xiàn)GFR2功能增強(qiáng)可導(dǎo)致小鼠髁突生長發(fā)育周期變短。同時Fgfr2+/S252W小鼠髁突Col X的表達(dá)高于野生型小鼠，表明FGFR2功能增強(qiáng)型小鼠的肥大軟骨細(xì)胞活性強(qiáng)于野生型小鼠，髁突軟骨組織更快骨化。

綜上所述，F(xiàn)GFR2功能增強(qiáng)可抑制髁突各層軟骨細(xì)胞增生，并活化肥大軟骨細(xì)胞，導(dǎo)致髁突軟骨下骨化中心的骨小梁提早骨化，較野生型小鼠更早停止生長發(fā)育，從而使Fgfr2+/S252W小鼠的下頜骨髁突發(fā)育異常，呈現(xiàn)出反畸形。有關(guān)FGFR2/FGFs信號通路對下頜骨髁突發(fā)育影響的具體調(diào)控機(jī)制將在后續(xù)實驗中進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編委:吳強(qiáng))

Again-of-function mutation in FGFR2 influences mandibular condylar development on mice

Xin Liang1,Bo Zhang2,Ping Liu2,Tujun Weng2,Li Zhang2,Longzhu He1,Fangfei Li2, Chen Qu1,Ping Wang1

1.Department of Stomatology,First Affiliated Hospital,Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China;
2.Department 4,Daping Hospital,Research Institute of Surgery,Third Military Medical University,Chongqing 400042,China

The development of the skeleton is regulated by numerous signaling molecules expressed in epiphyseal cartilage controlling both chondrogenesis and osteogenesis such as fibroblast growth factor receptors (FGFRs).In order to explore the important effect of fibroblast growth factor receptor 2(FGFR2)in the process of mandibular condylar growth,we introduced gain-of-function Fgfr2+/S252Wmice,and investigated mandibular condylar morphology by means of safranin-o/fast green staining at the stage of 1 week,3 weeks and 6 weeks.The mutant mice displayed narrower width of the mandibular condylar growth plate,stronger stainings of trabecular bone at the stage of 1 week,3 weeks and 6 weeks and faster degradation of the calcified cartilage cell layer at the stage of 6 weeks.We also assessed the expression of type X collagen(Col X)in mandibular condyle at the stage of 3 weeks by immunohistochemical staining and real-time PCR.The results showed that Col X was increased in the mutant mice. In conclusion,the gain-of-function mutation in FGFR2 resulted in histopathological abnormalities and development deformity of mandibular condyle cartilage in mice,which inhibited endochondral bone formation.

mandibular;condyle;fibroblast growth factor receptor 2

2014-10-28;

2015-01-20

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展規(guī)劃項目(973計劃)(編號：2011CB964701)資助

梁鑫，碩士，專業(yè)方向：口腔內(nèi)科學(xué)。E-mail:654066262@qq.com

王萍，博士，教授，研究方向：牙髓根尖周病、口腔顱頜面組織生長發(fā)育研究。E-mail:cqcnwp@sina.com

10.16288/j.yczz.14-370

時間:2015-3-11 9:18:41

URL:http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20150311.0918.002.html