耐受乙醇乳酸菌誘變的研究

王曉雯，蔣彩虹，盧士玲，蘆文娟，杜紫萱，黎　旭，李寶坤*

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832000）

耐受乙醇乳酸菌誘變的研究

王曉雯，蔣彩虹，盧士玲，蘆文娟，杜紫萱，黎旭，李寶坤*

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832000）

以面包乳桿菌（Lactobacillus crustorumD2-5）和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarumD5-5）為研究對(duì)象，分別選取不同濃度乙醇脅迫處理后，進(jìn)行誘變育種，探究經(jīng)乙醇脅迫后乳酸菌誘變育種的耐受性；根據(jù)最佳誘變劑量的條件，確定最佳誘變方法；以乙醇脅迫處理后乳酸桿菌的生長(zhǎng)曲線，驗(yàn)證乙醇脅迫后乳酸菌誘變菌株的耐受性。結(jié)果表明：添加與乳酸菌懸浮液等體積的1%硫酸二乙酯（DES）化學(xué)誘變效果最佳，最適誘變時(shí)間為40 min，乙醇脅迫過(guò)程中誘變菌株的生長(zhǎng)速率有所提高，以體積分?jǐn)?shù)8%乙醇脅迫為例，24 h時(shí)，D2-5菌落總數(shù)的對(duì)數(shù)值由6.2提高至7.3，D5-5菌落總數(shù)的對(duì)數(shù)值由6.9提高至7.1。說(shuō)明誘變育種有助于乳酸桿菌乙醇脅迫耐受性的提高，并獲得乙醇耐受特性較好的菌株D2-5。

乳酸菌；乙醇脅迫；誘變育種；耐受性

乳酸菌是革蘭氏染色陽(yáng)性的桿菌或球菌，對(duì)葡萄糖發(fā)酵能產(chǎn)生50%以上乳酸的一類微生物的總稱［1］。這些微生物類群有著一些共同的特征，如不產(chǎn)孢子、厭氧或兼性厭氧、接觸酶為陰性、沒(méi)有細(xì)胞色素、革蘭氏陽(yáng)性桿菌或球菌等。人類自古就利用乳酸菌來(lái)保存食物，提高食品的風(fēng)味和改善食品的品質(zhì)［2］。由于這些細(xì)菌可以耐受較低的pH值，直到19世紀(jì)中葉，才在食品微生物發(fā)酵的過(guò)程中被發(fā)現(xiàn)［3］。許多乳酸菌被公認(rèn)為安全的食品成分［4］。優(yōu)良乳酸菌應(yīng)該具有良好的發(fā)酵性能和較強(qiáng)的耐受性，從而確保發(fā)酵制品被食用后能在胃腸道中定植，這是益生乳酸菌發(fā)揮作用的關(guān)鍵［5］。

由于外界各種不良環(huán)境的脅迫及不利因素的影響，嚴(yán)重地限制了乳酸桿菌的生長(zhǎng)及代謝能力，進(jìn)而影響了益生功能的發(fā)揮，抑制了高效活性的利用［6］。發(fā)酵制品通常都由乳酸菌與酵母菌共同發(fā)酵而成［7］，其發(fā)酵過(guò)程中所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，造成生存環(huán)境不斷改變，菌體不可避免的受到各種脅迫條件的影響，如溫度、pH值、乙醇、滲透壓等，其中乙醇是最常見的脅迫因子之一［8］。乙醇濃度過(guò)高就會(huì)影響菌體的新陳代謝、生理活性等［9］。利用物理或化學(xué)誘變劑對(duì)均勻分散的微生物細(xì)胞群進(jìn)行處理的育種方式被稱為誘變育種，它可以促進(jìn)菌株的遺傳特性產(chǎn)生突變，突變頻率比其自發(fā)突變高出幾百甚至上千倍，突變幾率一般在10-6～10-9范圍內(nèi)［10］。當(dāng)前發(fā)酵工業(yè)和其他微生物生產(chǎn)部門所使用的高產(chǎn)菌株，幾乎毫無(wú)例外地都是通過(guò)誘變育種來(lái)明顯提高其生產(chǎn)性能，且具有變異范圍廣泛、類型多樣等優(yōu)秀特點(diǎn)，所以仍是目前廣泛使用的一種育種手段［11］。

本試驗(yàn)以面包乳桿菌（Lactobacillus crustorumD2-5）和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarumD5-5）為研究對(duì)象，分別選取不同濃度乙醇脅迫處理后，進(jìn)行誘變育種，探究經(jīng)乙醇脅迫后乳酸菌誘變育種的耐受性；根據(jù)最佳誘變劑量的條件，確定最佳誘變方法，以期獲得耐受特性較好的菌株，為乳酸菌選育技術(shù)的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌種

面包乳桿菌（Lactobacillus crustorumD2-5）和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarumD5-5）均來(lái)自石河子大學(xué)食品學(xué)院實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2培養(yǎng)基及其制備

MRS液體培養(yǎng)基［12］：蛋白胨10.0 g，牛肉膏5.0 g，酵母粉5.0 g，葡萄糖20.0 g，吐溫80 1.0 mL，磷酸氫二鉀2.0 g，乙酸鈉5.0 g，檸檬酸三銨2.0 g，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，蒸餾水1 000 mL，調(diào)pH 6.2～6.4，115℃滅菌20 min。

MRS固體培養(yǎng)基：MRS液體培養(yǎng)基中加瓊脂粉20 g，調(diào)pH 6.2～6.4，115℃滅菌20 min。

1.1.3化學(xué)試劑

硫酸二乙酯（diethyl sulfate，DES）、無(wú)水乙醇：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉：天津市永晟精細(xì)化工有限公司；硫代硫酸鈉（Na2S2O3）：天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司；所有試驗(yàn)試劑均為分析純。

1.2儀器及設(shè)備

Neofuge型高速冷凍離心機(jī)：力康發(fā)展（香港）有限公司；SW-CJ型無(wú)菌操作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；LDZX-40型滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；HI8424NEW型酸度計(jì)：北京哈納科儀科技有限公司；DNP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；BS2000S型電子天平：北京賽多利斯天平有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1細(xì)胞懸浮液制備

將二次活化的菌種分別接種于含體積分?jǐn)?shù)分別為0、5%、6%和8%乙醇的MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期，4℃離心（4 000 r/min、5 min）收集沉淀得菌體。用0.85%無(wú)菌生理鹽水將菌體洗滌2次，配制成乳酸菌懸浮液，備用［13］。

1.3.2誘變

（1）紫外（ultra violet，UV）誘變

將配制好的乳酸菌懸浮液以10倍稀釋法稀釋得到10-5、10-6、10-7三個(gè)梯度。分別從這三個(gè)梯度中吸取菌液置于MRS固體培養(yǎng)基平板上，打開平板蓋，用紫外燈照射0.5～3.5 min（按每1 min遞增），照射后立即蓋上平板蓋，均勻涂布后用黑色塑料袋包好，每個(gè)稀釋度涂布2個(gè)平板，于37℃恒溫培養(yǎng)24 h［14］。致死率計(jì)算公式如下：

以紫外照射時(shí)間為橫坐標(biāo)，乳酸菌的致死率為縱坐標(biāo)，繪制乳酸菌的致死率曲線。

（2）DES誘變

將配制好的乳酸菌懸浮液，加入等體積1%硫酸二乙酯，37℃水浴振蕩鍋中誘變培養(yǎng)10～50 min（按每10 min遞增），加入l mL 2%Na2S2O3終止反應(yīng)。各取誘變后的菌液涂布MRS固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h。計(jì)算不同誘變時(shí)間的致死率，以誘變時(shí)間為橫坐標(biāo)，致死率為縱坐標(biāo)，繪制兩種乳酸菌的致死率曲線［14］。

（3）復(fù)合誘變

仍然用原始出發(fā)菌株，先用紫外誘變得到的最佳誘變劑量（方法同上），篩選得到兩種優(yōu)良突變株，挑取優(yōu)良突變株，在MRS固體培養(yǎng)基上劃線，37℃培養(yǎng)24 h，挑取單菌落，配制成乳酸菌懸浮液，加入等體積1%硫酸二乙酯，37℃水浴振蕩鍋中誘變培養(yǎng)10～50 min（按每10 min遞增），加入l mL 2%Na2S2O3終止反應(yīng)。各取誘變后的菌液涂布MRS固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h，計(jì)算不同誘變時(shí)間的致死率。

1.3.3乙醇脅迫乳酸桿菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

研究表明，一般體積分?jǐn)?shù)5%的乙醇溶液就可抑制菌體的生長(zhǎng)速率［15］，秦偉帥等［16］研究發(fā)現(xiàn)乙醇濃度過(guò)高就會(huì)影響菌體的新陳代謝、生理活性等。DA SILVEIRA M G等［17］研究認(rèn)為，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為8%～10%的條件下，細(xì)菌的生長(zhǎng)會(huì)受到明顯抑制，體積分?jǐn)?shù)為12.5%以上的乙醇不僅抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，甚至?xí)斐删w的大量死亡［18］。因此選擇體積分?jǐn)?shù)分別為0、5%、8%的乙醇測(cè)定其生長(zhǎng)曲線。將活化后的種子液接入含0、5%、8%的乙醇的MRS培養(yǎng)基中，靜置培養(yǎng)至對(duì)數(shù)末期每隔2 h取樣進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，分別做3個(gè)平行，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，菌落總數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制菌株生長(zhǎng)曲線。

2　結(jié)果與分析

2.1不同紫外照射時(shí)間對(duì)致死率的影響

由圖1可知，兩株菌種致死率變化規(guī)律基本一致，隨著紫外照射時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株的致死率逐漸上升；紫外照射時(shí)間為0.5 min時(shí)菌種致死率達(dá)到50%以上；當(dāng)照射1.5 min時(shí)兩菌株致死率達(dá)到70%以上；當(dāng)照射2.5 min時(shí)兩菌種致死率均達(dá)到80%～90%，當(dāng)照射3.5min時(shí)致死率接近100%。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［19］，近年來(lái)一般認(rèn)為，誘變后菌株的致死率在80%～90%時(shí)誘變效果較好，更容易篩選到變異幅度大的突變菌株，以下試驗(yàn)均以此為依據(jù)確定最佳誘變劑量。

因此，選擇紫外線照射2.5 min為菌株D2-5和D5-5的紫外誘變的劑量最佳照射時(shí)間。

圖1　不同紫外線（UV）照射時(shí)間對(duì)致死率的影響Fig.1 Effect of different irradiated time by UV mutation on fatality rate

2.2不同DES化學(xué)誘變時(shí)間對(duì)致死率的影響

由圖2可知，接入乙醇體積分?jǐn)?shù)越高，致死率相對(duì)較高。隨著DES化學(xué)誘變時(shí)間的延長(zhǎng)，乳酸菌的致死率增加；當(dāng)DES化學(xué)誘變時(shí)間為20min時(shí)，兩菌株致死率均基本達(dá)到60%以上；當(dāng)誘變時(shí)間為40min時(shí)兩株菌致死率達(dá)到80%～90%，當(dāng)誘變時(shí)間為50 min時(shí)致死率接近100%。

圖2　不同DES化學(xué)誘變時(shí)間對(duì)乳酸菌致死率的影響Fig.2 Effect of chemical mutagenesis time by DES mutation on fatality rate

結(jié)果表明，兩菌株在不同乙醇體積分?jǐn)?shù)下硫酸二乙酯化學(xué)誘變的致死率在誘變時(shí)間為40 min時(shí)都達(dá)到了80%～90%，故硫酸二乙酯化學(xué)誘變40 min的效果最佳。

2.3復(fù)合誘變?cè)囼?yàn)結(jié)果

由表1可知，復(fù)合誘變的誘變條件為紫外照射2.5 min+硫酸二乙酯誘變20 min時(shí)兩株菌致死率達(dá)到80%～90%，故在此條件下復(fù)合誘變的效果最佳。

表1　接種不同體積分?jǐn)?shù)乙醇的復(fù)合誘變對(duì)致死率的影響Table 1 Effect of compound mutation with different ethanol concentration on fatality rate%

2.4不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)乳酸菌誘變pH值的變化

不同體積分?jǐn)?shù)乙醇對(duì)菌株D2-5和D5-5不同誘變過(guò)程中的pH值變化，結(jié)果見圖3。

圖3　不同體積分?jǐn)?shù)乙醇條件下對(duì)菌株D2-5（A）及D5-5（B）誘變pH值的變化曲線Fig.3 The curve of pH for strains D2-5（A）and D5-5（B）by different mutation under different ethanol concentration

由圖3可知，原菌、紫外誘變、硫酸二乙酯化學(xué)誘變和復(fù)合誘變過(guò)程中乙醇脅迫濃度越大，pH值越高，菌株酸性越弱；通過(guò)不同的誘變處理，菌種D2-5和D5-5的pH變化趨勢(shì)基本一致，在硫酸二乙酯化學(xué)誘變過(guò)程中pH達(dá)到最低，分別為3.15和3.11；由于pH值越低產(chǎn)酸能力越強(qiáng)，所以硫酸二乙酯化學(xué)誘變的效果最佳。

2.5乙醇脅迫處理乳酸桿菌的生長(zhǎng)曲線

硫酸二乙酯化學(xué)誘變，誘變時(shí)間40 min，在此條件下測(cè)定乙醇脅迫處理后乳酸桿菌的生長(zhǎng)曲線，結(jié)果見圖4。

圖4　不同乙醇濃度脅迫后原始菌株與DES化學(xué)誘變菌株的生長(zhǎng)曲線Fig.4 The growth curve of the original and DES mutation strains after different ethanol concentrations stress

相對(duì)于原始菌株來(lái)說(shuō)，乙醇脅迫過(guò)程中誘變菌株的生長(zhǎng)速率有所提高，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的逐步增加，生長(zhǎng)速率有所下降。以未經(jīng)乙醇脅迫處理的菌體為對(duì)照，經(jīng)過(guò)體積分?jǐn)?shù)5%乙醇脅迫處理的誘變菌株生長(zhǎng)曲線與對(duì)照菌株部分重合，而體積分?jǐn)?shù)8%乙醇脅迫菌體生長(zhǎng)速率有所提高。在經(jīng)體積分?jǐn)?shù)8%乙醇脅迫24 h時(shí)，D2-5原始菌株菌落總數(shù)的對(duì)數(shù)值為6.2，誘變菌株菌落總數(shù)的對(duì)數(shù)值為7.3，D5-5原始菌株菌落總數(shù)的對(duì)數(shù)值為6.9，誘變菌株菌落總數(shù)的對(duì)數(shù)值為7.1，這一結(jié)果說(shuō)明誘變有助于乳酸桿菌乙醇脅迫耐受性的提高，且D2-5比D5-5效果顯著。不同菌體同一乙醇濃度脅迫耐受性不同，D5-5原始菌株生長(zhǎng)速率高于D2-5，雖然D5-5誘變菌株在受到體積分?jǐn)?shù)8%乙醇脅迫初期生長(zhǎng)速率明顯高于D2-5，呈上升趨勢(shì)，但24 h后兩菌菌落總數(shù)的對(duì)數(shù)值基本相同，分別為7.1和7.3；同一菌體不同乙醇濃度脅迫耐受性也有所不同，兩株菌不同時(shí)間受體積分?jǐn)?shù)為5%乙醇脅迫生長(zhǎng)速率較高。

3　結(jié)論

本研究以面包乳桿菌（Lactobacillus crustorumD2-5）和植物乳桿菌（Latobacillus plantarumD5-5）為研究對(duì)象，經(jīng)乙醇脅迫處理后進(jìn)行誘變育種，探究乳酸菌誘變育種乙醇耐受菌株，確定最佳誘變方法。結(jié)果表明，硫酸二乙酯化學(xué)誘變的效果最佳，且兩株菌誘變后產(chǎn)酸能力相差不大。乙醇脅迫過(guò)程中誘變菌株的生長(zhǎng)速率有所提高，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的逐步增加，生長(zhǎng)速率有所下降，在經(jīng)體積分?jǐn)?shù)8%乙醇脅迫24 h時(shí)，D2-5原始菌株菌落總數(shù)的對(duì)數(shù)值為6.2，誘變菌株菌落總數(shù)的對(duì)數(shù)值為7.3，D5-5原始菌株菌落總數(shù)的對(duì)數(shù)值為6.9，誘變菌株菌落總數(shù)的對(duì)數(shù)值為7.1，說(shuō)明誘變育種有助于乳酸桿菌乙醇脅迫耐受性的提高，且D2-5比D5-5效果顯著，因此獲得乙醇耐受特性較好的菌株D2-5，本研究結(jié)果擴(kuò)大了能夠耐受乙醇的微生物資源，為利用高耐受菌株提高乙醇產(chǎn)量奠定基礎(chǔ)。

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Research on mutagenesis of ethanol tolerance lactic acid bacteria

WANG Xiaowen，JIANG Caihong，LU Shiling，LU Wenjuan，DU Zixuan，LI Xu，LI Baokun*
（Food College，Shihezi University，Shihezi 832003，China）

UsingLactobacillus crustorumD2-5 andLactobacillus plantarumD5-5 as the research object，they were selected by mutation after different concentrations of ethanol stress processing.The tolerance of lactic acid bacteria mutation breeding after ethanol stress processing was investigated. According to the optimum mutation dose，the optimum mutation method was determined.The tolerance of lactic acid bacteria mutant strain was verified by growth curve of lactic acid bacteria after different ethanol concentrations stress processing.The results shown that the optimum chemical mutagenesis was 1%diethyl sulfate added equal volume with lactic acid bacteria suspensions，the optimal mutagenesis time was 40 min，the growth rate of mutant strain was increased during ethanol stress processing.Taking 8%ethanol for an example，the Log value of strain D2-5 total bacterial count increased from 6.2 to 7.3，the value of strain D5-5 increased from 6.9 to 7.1 after 24 h.The study indicated that mutation breeding could improve the ethanol stress tolerance of lactic acid bacteria，and the strain D2-5 with high ethanol tolerance was obtained.

Lactobacillus；ethanol stress；mutagenesis breeding；tolerance

TQ923

A

0254-5071（2015）10-0032-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.10.008

2015-09-17

國(guó)家自然基金地區(qū)項(xiàng)目（31560444）；國(guó)家自然基金青年項(xiàng)目（31201395）；兵團(tuán)博士基金專項(xiàng)（2014BB005）；石河子大學(xué)重大科技攻關(guān)項(xiàng)目（gxjs2014-zdgg07）；石河子大學(xué)高層次人才啟動(dòng)項(xiàng)目（RCZX201223）；國(guó)家自然基金地區(qū)項(xiàng)目（31460007）；國(guó)家自然基金青年項(xiàng)目（31301523）

王曉雯（1992-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樾螽a(chǎn)品加工與安全。

李寶坤（1979-），男，副教授，博士，研究方向?yàn)樾螽a(chǎn)品加工與質(zhì)量安全。