不同質(zhì)地土壤煙株根際微生物菌群變化分析

王淑玉，李小龍，李紅麗，曾 強(qiáng)，王 巖，林 卿，田 甜，孫 妍

（1. 鄭州大學(xué)化工與能源學(xué)院，河南 鄭州450000；2. 福建省煙草公司南平市公司邵武分公司，福建 邵武354000）

良好的土壤生態(tài)環(huán)境是農(nóng)業(yè)健康、可持續(xù)發(fā)展的基礎(chǔ)[1]。土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要參與者，具有以下功能：促進(jìn)植物營(yíng)養(yǎng)元素的轉(zhuǎn)化和土壤肥力形成[2]；分解土壤有機(jī)質(zhì)，形成腐殖質(zhì)[3-4]；與植物共生，促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，防治作物土傳病害的發(fā)生[5-6]；降解農(nóng)藥殘留等有機(jī)污染物[7]。因此，許多研究把土壤中的真菌、細(xì)菌和放線菌3 大類(lèi)微生物的數(shù)量作為評(píng)價(jià)土壤肥力高低的重要生物學(xué)指標(biāo)[8]。

由于土壤類(lèi)型和氣候條件不同，各種植區(qū)土壤微生物的區(qū)系和豐度各異。研究表明，作物病害的發(fā)生，尤其是土傳病害的發(fā)生，與根際微生物的數(shù)量和區(qū)系組成以及群落結(jié)構(gòu)等均關(guān)系密切[9-12]。因此，以福建省邵武市不同植煙區(qū)的土壤為研究對(duì)象，在分析土壤基本性質(zhì)和土壤微生物數(shù)量變化的基礎(chǔ)上，通過(guò)16 S rDNA 建立克隆文庫(kù)進(jìn)行土壤細(xì)菌多樣性分析，旨在探討土壤性質(zhì)與煙葉青枯病發(fā)生之間的關(guān)系，為制定有效防控?zé)熑~青枯病措施提供理論與技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況及供試品種

試驗(yàn)于2014年在邵武市沿山鎮(zhèn)徐溪村、城郊鎮(zhèn)高南村和水北鎮(zhèn)故縣村3個(gè)地方進(jìn)行，選擇往年青枯病發(fā)病嚴(yán)重的地塊作為試驗(yàn)田，供試烤煙品種為K326。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 每個(gè)試驗(yàn)地點(diǎn)為1個(gè)處理，分別為：T1，沿山鎮(zhèn)徐溪村；T2，城郊鎮(zhèn)高南村；T3，水北鎮(zhèn)故縣村。每個(gè)處理選擇3個(gè)性質(zhì)相似的田塊作重復(fù)，共占地667 m2。植煙密度為1 100 株/667m2，株行距為50 cm×120 cm，純氮用量為9.09 kg/667m2，N︰P︰K 比例為1.0︰0.8︰2.7。

1.2.2 測(cè)定項(xiàng)目及方法 （1）土樣采集。分別于煙苗移栽前、旺長(zhǎng)期、采摘期（健康煙株和發(fā)病煙株）和采摘后期采集土壤樣品，具體方法為：各小區(qū)隨機(jī)選取3株烤煙，將整棵煙株連根拔出，取粘接在細(xì)根上的土壤混勻，即為根際土壤，將3 株烤煙的根際土壤混合成1個(gè)樣品，采用四分法保留1 kg，于4℃冰箱內(nèi)存放待測(cè)。（2）土壤機(jī)械組成測(cè)定。土壤機(jī)械組成依照《農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》（NY/T 1121-2006）中的測(cè)定方法進(jìn)行。（3）土壤基本性質(zhì)測(cè)定。取部分根際土壤風(fēng)干，用木槌研磨后過(guò)60 目篩，用電位法測(cè)定土壤pH 值；土壤有機(jī)質(zhì)、速效鉀、速效磷、堿解氮分別采用重鉻酸鉀容量法、火焰分光光度計(jì)法、碳酸氫鈉法、堿解擴(kuò)散法測(cè)定[13]。（4）土壤微生物數(shù)量測(cè)定。采用稀釋平板計(jì)數(shù)法測(cè)定土壤微生物數(shù)量[14]，細(xì)菌培養(yǎng)采用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，放線菌培養(yǎng)采用高氏合成1 號(hào)瓊脂培養(yǎng)基，真菌培養(yǎng)采用馬丁孟加拉紅鏈霉素瓊脂培養(yǎng)基。（5）宏基因組16S rDNA 測(cè)序。按OMEGA 試劑盒的步驟提取土壤DNA，對(duì)提取到的基因組DNA 進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè)，查看基因組DNA 的完整性與濃度。利用Qubit2.0 DNA 檢測(cè)試劑盒對(duì)基因組DNA 精確定量，以確定PCR 反應(yīng)應(yīng)加入的DNA 量，按照配置好的PCR 體系進(jìn)行擴(kuò)增，采用瓊脂糖回收試劑盒（cat：SK8131）對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行回收?；厥债a(chǎn)物用Qubit2.0定量，根據(jù)測(cè)得的DNA 濃度，將所有樣品按照1︰1的比例進(jìn)行混合；混合后充分震蕩均勻。該混合樣品用于后續(xù)的樣品建庫(kù)（加測(cè)序標(biāo)簽）與測(cè)序。去除序列中非擴(kuò)增區(qū)域序列，然后用mothur 中的pre.cluster 軟件進(jìn)行測(cè)序錯(cuò)誤校正，最后采用uchime 去除序列中的嵌合體。采用RDP classifier 軟件對(duì)處理后序列進(jìn)行物種分類(lèi)，采用Na觙ve Bayesian assignment 算法對(duì)每條序列在genus 水平上計(jì)算其分配到的概率值。（6）煙株發(fā)病率調(diào)查。在煙株發(fā)病期，對(duì)每個(gè)小區(qū)中發(fā)病植株進(jìn)行計(jì)數(shù)，發(fā)病率用發(fā)病個(gè)體占群體總數(shù)的百分?jǐn)?shù)來(lái)表示。發(fā)病率（%）=（發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)）×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤機(jī)械組成與基本性質(zhì)

如表1 所示，沿山鎮(zhèn)徐溪村（T1）和城郊鎮(zhèn)高南村（T2）的試驗(yàn)田土壤均屬棕色輕壤土，而水北鎮(zhèn)故縣村（T3）的試驗(yàn)田土壤屬灰色砂壤土；其中，城郊鎮(zhèn)高南村和水北鎮(zhèn)故縣村的土壤pH 值相近，均在5.1 左右，而沿山鎮(zhèn)徐溪村的土壤偏酸性，pH 值為4.60；沿山鎮(zhèn)徐溪村的土壤有機(jī)質(zhì)含量最高，其次為水北鎮(zhèn)故縣村，城郊鎮(zhèn)高南村的土壤有機(jī)質(zhì)含量最少，且前者與后兩者之間的差異顯著；不同試驗(yàn)地的氮磷鉀養(yǎng)分差異也較大。

表1 各試驗(yàn)點(diǎn)土壤的機(jī)械組成和理化性質(zhì)

2.2 煙草根際土壤微生物數(shù)量的變化

通常情況下，農(nóng)業(yè)土壤中微生物的種類(lèi)、數(shù)量與當(dāng)?shù)刈匀簧鷳B(tài)如土壤種類(lèi)、氣候條件等密切相關(guān)。當(dāng)這些生態(tài)條件發(fā)生改變時(shí)，土壤微生物的種類(lèi)和數(shù)量也會(huì)隨之發(fā)生較大變化[15]。也正是由于微生物種類(lèi)和數(shù)量的這些變化，反映出生態(tài)條件的改變以及對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)產(chǎn)生的效應(yīng)。例如土壤有機(jī)質(zhì)的礦化與合成、肥料養(yǎng)分的礦化與生物固持、土壤中病原菌數(shù)量比例的消減或增長(zhǎng)等[16]。

由于3個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的土壤類(lèi)型及理化性狀有較大差異，所以土壤微生物的種類(lèi)和數(shù)量也明顯不同。從表2 中可以看出，T1～T3 試驗(yàn)點(diǎn)煙株根際土微生物總量分別為84.98×105、49.89×105、36.20×105cfu/g，處理間差異顯著；其中，除T3 試驗(yàn)點(diǎn)外，其他兩個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)各類(lèi)微生物數(shù)量由多到少排列依次為細(xì)菌＞真菌＞放線菌。就不同性質(zhì)土壤來(lái)看，輕壤土中煙草根際微生物的總量以及細(xì)菌、真菌和放線菌各類(lèi)型微生物的數(shù)量均多于砂壤土中的。

從表2 中還可看出，在移栽前土壤中微生物數(shù)量較低，移栽煙苗后土壤中微生物含量均增高，這是因?yàn)樽魑锓N植施加肥料后，微生物有了充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，含量迅速增加。在煙株生育期間，根際土微生物總量和細(xì)菌數(shù)量變化趨勢(shì)較為一致，表現(xiàn)出先增后減的趨勢(shì)，其峰值出現(xiàn)在煙草生長(zhǎng)發(fā)育較快的旺長(zhǎng)期或采摘初期。進(jìn)入采摘期之后，根系分泌物逐漸減少，根際微生物數(shù)量又有一定幅度地減少。

2.3 不同生育期煙株根際土壤中細(xì)菌類(lèi)群的變化

表2 各試驗(yàn)點(diǎn)在烤煙不同生育期土壤微生物的數(shù)量 （cfu/g）

從表3 中可以看出，不同試驗(yàn)田土壤中的優(yōu)勢(shì)菌群不同，同一試驗(yàn)田在不同時(shí)期土壤中優(yōu)勢(shì)菌群也有差別。其中，移栽前各處理根際土壤中的優(yōu)勢(shì)菌群為Massilia、Gp1 和Gp3（T1），Clostridium、Massilia 和Gp1（T2），Gp1、Sphingomonas 和Massilia（T3）；旺長(zhǎng)期各處理根際土壤中的微生物數(shù)量明顯增多，優(yōu)勢(shì)菌群也隨之發(fā)生改變，T1 土壤中優(yōu)勢(shì)菌群為Sphingomonas、Gp1 和Ferruginibacter，T2 土 壤 中 的 優(yōu) 勢(shì) 菌 群 為Sphingomonas、TM 7 和Massilia，T3 土壤中的優(yōu)勢(shì)菌群為Gp1、Sphingomonas 和Gp3；采摘期健康煙株各處理根際土壤中的優(yōu)勢(shì)菌群為Sphingomonas、Gp1 和Gp3（T1），Sphingomonas、Gp1 和Gp3（T2），Gp1、Gp3 和Subdivision3（T3）；采摘期發(fā)病煙株各處理根際土壤中優(yōu)勢(shì)菌群為Gp1、Gp3 和Sphingomonas（T1），Gp1、Gp3 和Subdivision3（T2），Gp1、Gp3 和Spartobacteria（T3）。

從表4 中可以看出，在烤煙生育期內(nèi)各試驗(yàn)點(diǎn)土壤中細(xì)菌文庫(kù)的覆蓋率達(dá)到70%以上，說(shuō)明所建文庫(kù)能真實(shí)反應(yīng)出該環(huán)境細(xì)菌多樣性特征；香農(nóng)指數(shù)是衡量群落的異質(zhì)性，而細(xì)菌文庫(kù)的香濃指數(shù)均達(dá)到7.00以上，表明根際的細(xì)菌群落多樣性已達(dá)較高水平。

ACE 指數(shù)和Chao1 指數(shù)是預(yù)測(cè)環(huán)境中細(xì)菌總數(shù)的指標(biāo)，值越高則物種越多。由表4 可知，采摘期，3個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的根際土壤中ACE 指數(shù)與Chao1 指數(shù)均表現(xiàn)為T(mén)2＞T1＞T3，即輕壤土中細(xì)菌總量較砂壤土多。從表4 中還可以看出，在煙葉采摘期，健康植株的根際土壤中的這兩個(gè)指標(biāo)均顯著高于發(fā)病植株的根際土壤的。這說(shuō)明在健康狀態(tài)下，煙株根際土壤細(xì)菌多樣性程度較高，并且健康植株根際土壤中的細(xì)菌多樣性和豐度遠(yuǎn)高于發(fā)病植株根際土壤中的。有研究表明，病原物在侵入寄主的過(guò)程中以及侵入后，會(huì)在一定程度上干擾植物的正常代謝，引起根系分泌物的改變。由此推測(cè)，發(fā)病植株根際中烤煙青枯病菌可能誘導(dǎo)根際環(huán)境發(fā)生了相應(yīng)變化。

在T1 和T2 土壤中，健康植株根際的Sphingomonas數(shù)量高于發(fā)病植株根際的數(shù)量。Sphingomonas，即鞘氨醇單胞菌，屬變形細(xì)菌的4 亞類(lèi)，該類(lèi)菌株均為革蘭氏陰性菌，無(wú)孢子，以單側(cè)生極性鞭毛運(yùn)動(dòng)，多呈黃色，專(zhuān)性需氧且能產(chǎn)生過(guò)氧化氫酶；除此之外，鞘氨醇單胞菌還可將戊糖、己糖及二糖轉(zhuǎn)變成酸。由于鞘氨醇單胞菌對(duì)芳香化合物有極為廣泛的代謝能力，并且該菌屬某些菌種能夠合成有價(jià)值的胞外生物高聚物，從而形成疏水表面，有利于這些細(xì)菌在生態(tài)環(huán)境中存活并方便其攝取芳香化物，具有一定的生防作用。

2.4 試驗(yàn)點(diǎn)煙株青枯病發(fā)生情況

從表5 中可以看出，第一次調(diào)查時(shí)（6月24日）煙株青枯病發(fā)病率以T3 最高，T1 的發(fā)病率最低；到后兩次調(diào)查時(shí)，T3 的發(fā)病率仍居高不下，發(fā)病率由高到低均表現(xiàn)為T(mén)3＞T2＞T1。采摘結(jié)束時(shí)T3 發(fā)病率分別比T1、T2 高出20.79、9.02個(gè)百分點(diǎn)，病情指數(shù)分別比T1、T2 高19.52、12.29。由此可見(jiàn)，不同土壤類(lèi)型對(duì)煙株青枯病的發(fā)生有一定影響。T1 和T2 土壤中微生物總量最高且種類(lèi)豐富，且土壤中優(yōu)勢(shì)菌群較為分散，微生物結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定，病原微生物較難打破原有菌群結(jié)構(gòu)，故發(fā)病較輕；而T3 土壤中菌落數(shù)量相對(duì)較少，且微生物種類(lèi)不如T1、T2 豐富，因此其土壤菌群結(jié)構(gòu)易受外界因素影響而發(fā)生改變。另外，T3 試驗(yàn)點(diǎn)土質(zhì)偏砂質(zhì)化，在煙葉青枯病發(fā)病高峰期恰逢邵武市雨季，青枯病病原菌隨雨水?dāng)U散，蔓延迅速，從而造成青枯病大面積爆發(fā)。

表3 各試驗(yàn)點(diǎn)在烤煙不同生育期土壤微生物組成及占比 （%）

表4 試驗(yàn)點(diǎn)土壤根際細(xì)菌群落多樣性指數(shù)

3 結(jié)論與討論

隨著人們對(duì)微生物在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中重要作用的認(rèn)識(shí)不斷加深，用土壤微生物學(xué)特性來(lái)評(píng)價(jià)土壤的健康程度和質(zhì)量日漸被認(rèn)可[17]。微生物學(xué)特性包括土壤微生物數(shù)量、活性、種群多樣性等，其中土壤微生物數(shù)量可以作為指示土壤肥力和監(jiān)控土壤生態(tài)環(huán)境的一個(gè)重要指標(biāo)。一般來(lái)說(shuō)，土壤微生物尤其是土壤細(xì)菌數(shù)量越多，則土壤肥力越高，對(duì)作物越有利。而真菌型或放線菌型土壤則不利于作物生長(zhǎng)，是土壤肥力下降的標(biāo)志[18]。試驗(yàn)的3個(gè)點(diǎn)，土壤微生物中細(xì)菌數(shù)量均占絕對(duì)多數(shù)，達(dá)90%以上，均為細(xì)菌型土壤。

群落多樣性、均勻度和優(yōu)勢(shì)種群集中度是從不同角度衡量生物群落結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性的重要指標(biāo)。群落多樣性參數(shù)值與均勻度越大，優(yōu)勢(shì)集中度越小，則群落的結(jié)構(gòu)越復(fù)雜，其反饋系統(tǒng)也就越強(qiáng)大，對(duì)于環(huán)境的變化或來(lái)自群落內(nèi)部種群波動(dòng)的緩沖作用越強(qiáng)，群落也就越穩(wěn)定[19]。試驗(yàn)結(jié)果表明，輕壤土中的微生物總量大于砂壤土，且輕壤土中的細(xì)菌數(shù)量及其在土壤微生物中的占比也大于砂壤土，其豐度均較砂壤土高，因此輕壤土中煙草青枯病發(fā)病率顯著低于砂壤土。

表5 2014年各試驗(yàn)點(diǎn)煙株青枯病發(fā)生情況

植物根系、土壤與微生物共同構(gòu)成根際生態(tài)系統(tǒng)。在健康的根際生態(tài)系統(tǒng)中，微生物豐度較高，物種間物質(zhì)交換和轉(zhuǎn)化途徑呈現(xiàn)出多樣化，協(xié)調(diào)性增強(qiáng)，土壤中有機(jī)質(zhì)和養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化速度加快，有利于保持土壤生態(tài)平衡。宏基因測(cè)序結(jié)果表明，土壤微生物結(jié)構(gòu)和數(shù)量隨煙株的移栽以及肥料的施加發(fā)生改變。在煙葉采摘期，同一試驗(yàn)點(diǎn)健康煙株根際土壤細(xì)菌多樣性程度較高，且健康根際土壤中細(xì)菌豐度遠(yuǎn)高于發(fā)病根際土壤。而且這一時(shí)期輕壤土中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)較砂壤土穩(wěn)定。如此，烤煙植株可通過(guò)細(xì)菌與細(xì)菌之間、細(xì)菌與真菌之間的相互作用，抑制病原微生物的生長(zhǎng)，維持生態(tài)平衡，提高煙株的抗病性。綜上所述，在以后的病害防治過(guò)程中，可大力研發(fā)土壤菌群調(diào)節(jié)劑或微生物制劑，加強(qiáng)微生物菌群的構(gòu)建，充分發(fā)揮拮抗菌的作用，提高土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化的協(xié)調(diào)性。

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