大長(zhǎng)山島蝦夷扇貝養(yǎng)殖海區(qū)及其體內(nèi)細(xì)菌數(shù)量周年變化

趙曉美，?！⊙?，張公亮，侯紅漫

（大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧大連　116034）

大長(zhǎng)山島蝦夷扇貝養(yǎng)殖海區(qū)及其體內(nèi)細(xì)菌數(shù)量周年變化

趙曉美，桑雪，張公亮，侯紅漫

（大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧大連116034）

采用平板涂布法（PC法）對(duì)大連長(zhǎng)?？h大長(zhǎng)山島蝦夷扇貝（Mizuhopectenyessoensis）養(yǎng)殖海區(qū)的表層海水、10m層海水、成年蝦夷扇貝鰓中的異養(yǎng)菌和致病性弧菌數(shù)量的周年變化進(jìn)行了調(diào)查研究。結(jié)果表明，表層海水、10m層海水和蝦夷扇貝鰓中，異養(yǎng)菌和致病性弧菌數(shù)量最高值均出現(xiàn)于5～7月，異養(yǎng)菌數(shù)量最高值分別為7.9×105、5.9×105cfu／mL和1.2×105cfu／g，致病性弧菌數(shù)量最高值分別為1.6×102、1.7×102cfu／mL和87cfu／g；最低值均出現(xiàn)于11月至次年1月，異養(yǎng)菌數(shù)量最低值分別為1.7×105、8.0×104cfu／mL和2.7×104cfu／g，致病性弧菌數(shù)量最低值分別為60、67cfu／mL和28cfu／g。蝦夷扇貝的鰓中致病性弧菌數(shù)量于春季呈現(xiàn)最高值87cfu／g。

蝦夷扇貝；異養(yǎng)菌；致病性弧菌；養(yǎng)殖海域

0　引　言

蝦夷扇貝（Mizuhopectenyessoensis）主產(chǎn)于日本北部及俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)沿海水域，屬于冷水性雙殼貝類［1］。20世紀(jì)80年代初引入中國(guó)后，迅速開展增養(yǎng)殖研究和實(shí)踐。該扇貝生長(zhǎng)快、肉味鮮美、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，深受廣大養(yǎng)殖戶和消費(fèi)者的歡迎，現(xiàn)已成為中國(guó)北方重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖貝類之一。蝦夷扇貝的養(yǎng)殖目前主要集中在遼東半島和山東長(zhǎng)島等海區(qū)，其中以大連長(zhǎng)?？h養(yǎng)殖規(guī)模最大。

目前對(duì)其研究主要集中在增養(yǎng)殖技術(shù)［2－3］、家系選育技術(shù)［4］、遺傳多樣性分析［5］、食用深加工［6］、副產(chǎn)品高值化利用［7－8］等方面，關(guān)于蝦夷扇貝養(yǎng)殖海域中細(xì)菌數(shù)量及其變化的研究報(bào)道較少。水中細(xì)菌是養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境中的重要組成部分，與養(yǎng)殖用的水質(zhì)和生物疾病的發(fā)生有著密切的關(guān)系，養(yǎng)殖水體中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，細(xì)菌的數(shù)量大大高于正常生態(tài)環(huán)境，而大部分異養(yǎng)細(xì)菌依然是分解者，消耗水體中的富營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，維持物質(zhì)循環(huán)；但部分細(xì)菌的大量繁殖會(huì)威脅到養(yǎng)殖生物的健康，從而引起生物體的疾病。對(duì)養(yǎng)殖生物而言，環(huán)境細(xì)菌生態(tài)平衡出現(xiàn)異常往往會(huì)引起細(xì)菌性疾病的暴發(fā)，環(huán)境一旦失衡，病原菌大量繁殖，加之養(yǎng)殖生物體免疫力下降，就可引發(fā)疾?。?－11］，因而養(yǎng)殖環(huán)境和養(yǎng)殖生物體內(nèi)細(xì)菌的數(shù)量、種群變動(dòng)對(duì)于細(xì)菌性疾病預(yù)警有著重要的意義。蝦夷扇貝為濾食性動(dòng)物，鰓作為濾食的主要器官，其內(nèi)部細(xì)菌數(shù)量與養(yǎng)殖水域中細(xì)菌數(shù)量密切相關(guān)，因此檢測(cè)蝦夷扇貝鰓中的細(xì)菌數(shù)量對(duì)評(píng)價(jià)其生存海域的細(xì)菌環(huán)境和其在養(yǎng)殖過(guò)程中的患病情況也具有一定意義。本研究中，作者對(duì)蝦夷扇貝養(yǎng)殖海域的海水以及蝦夷扇貝鰓中異養(yǎng)菌及致病性弧菌數(shù)量的周年變化進(jìn)行了研究，旨在為評(píng)價(jià)該海域水質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)狀況和環(huán)境條件以及防治扇貝養(yǎng)殖過(guò)程中由細(xì)菌引起的病害提供基礎(chǔ)的科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1樣品采集

于2012年8月～2013年7月在長(zhǎng)?？h大長(zhǎng)山島扇貝養(yǎng)殖區(qū)（122°32′55.50″～122°34′13.26″E，39°15′10.74″N～39°15′34.02″）采集水樣及蝦夷扇貝，使用經(jīng)過(guò)滅菌的潔凈純凈水瓶盛裝水樣，并在采樣前用所采水樣將采樣瓶反復(fù)沖洗，分別采集表層、10m層水樣；蝦夷扇貝樣品均為成年扇貝，貝殼直徑為75mm左右。每2個(gè)月采集一次。樣品采集完成后放入4℃恒溫箱保存，并迅速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2培養(yǎng)基的準(zhǔn)備

異養(yǎng)細(xì)菌的培養(yǎng)使用2216E海水培養(yǎng)基，主要成分為蛋白胨5.0g，酵母膏1.0g，磷酸高鐵0.10g，瓊脂20.0g，陳海水1000mL。121℃滅菌20min后倒制平板。

致病性弧菌的培養(yǎng)使用弧菌顯色培養(yǎng)基TCBS（硫代硫酸鈉枸櫞酸膽鹽蔗糖瓊脂），主要成分為酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g，硫代硫酸鈉10.0g，枸櫞酸鈉10.0g，牛膽粉5.0g，膽酸鈉3.0g，蔗糖20.0g，氯化鈉10.0g，檸檬酸鐵1.0g，百里酚蘭0.04g，瓊脂15.0g，pH（8.6±0.1）。使用時(shí)稱取89g，煮沸溶解于1000mL蒸餾水中，冷至60℃時(shí)，傾入無(wú)菌平皿，無(wú)須高壓滅菌。

1.3細(xì)菌的培養(yǎng)及菌落計(jì)數(shù)

在無(wú)菌條件下，使用75%無(wú)菌乙醇擦拭扇貝樣品體表并用無(wú)菌海水沖洗，將蝦夷扇貝鰓在無(wú)菌超凈臺(tái)上切下轉(zhuǎn)移至無(wú)菌離心管中，加入無(wú)菌PBS緩沖溶液（0.1mol／L，pH7.4）漩渦振蕩5min，然后在4℃下700g離心5min，取上清液作為菌液進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

按照《海洋調(diào)查規(guī)范》［12］中的平板涂布法（PC法）進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)及菌落計(jì)數(shù)，取所采水樣及上清液各1mL，用滅菌海水對(duì)其進(jìn)行10倍梯度稀釋，得到不同濃度梯度的菌液后各取100μL涂布平板，每個(gè)濃度梯度的菌液涂布3個(gè)平板，然后在恒溫培養(yǎng)箱中于（29±1）℃下培養(yǎng)2～5d，最后進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)。

1.4結(jié)果統(tǒng)計(jì)與分析

2216E培養(yǎng)基生成白色菌落，TCBS培養(yǎng)基生成黃色或綠色菌落，對(duì)各個(gè)平板生成的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，取菌落數(shù)30～300cfu／mL或30～300cfu／g為有效菌落數(shù)（海水樣品中細(xì)菌的計(jì)數(shù)單位為cfu／mL，蝦夷扇貝鰓中細(xì)菌的計(jì)數(shù)單位為cfu／g），并計(jì)算3次實(shí)驗(yàn)的平均值，得出異養(yǎng)菌和致病性弧菌數(shù)量的周年變化。

2　結(jié)果與討論

2.1菌落計(jì)數(shù)結(jié)果

菌落計(jì)數(shù)結(jié)果如表1、2所示。表層海水、10m層海水以及蝦夷扇貝鰓中的異養(yǎng)菌總數(shù)，1月最少，分別為1.7×105、8.0×104cfu／mL和2.7×104cfu／g；而7月均達(dá)到各自最大值7.9× 105、5.9×105cfu／mL和1.2×105cfu／g。表層海水中弧菌數(shù)量最低為60cfu／mL，出現(xiàn)在11月，最高達(dá)到160cfu／mL，出現(xiàn)于7月；10m層海水中弧菌數(shù)量為67～170cfu／mL，1月最低，7月最高；蝦夷扇貝鰓中弧菌數(shù)量為28～87cfu／g，11月最低，5月最高。

表1　海水中細(xì)菌數(shù)量Tab.1　Number　of　bacteria　in　the　seawater

表2　蝦夷扇貝體內(nèi)細(xì)菌數(shù)量Tab.2　Number　of　bacteria　in　scallop

2.2異養(yǎng)菌數(shù)量周年變化

異養(yǎng)細(xì)菌分解有機(jī)物是海洋生態(tài)系中能量流動(dòng)和物質(zhì)循環(huán)中諸多環(huán)節(jié)中的重要環(huán)節(jié)之一，異養(yǎng)菌的豐度、活性、水體環(huán)境有機(jī)物的濃度三者關(guān)系密切，因而可以作為海域受有機(jī)污染物污染程度指標(biāo)。此外，海洋中進(jìn)入溶解狀態(tài)的有機(jī)物質(zhì)主要靠海洋異養(yǎng)細(xì)菌來(lái)轉(zhuǎn)化，因此異養(yǎng)細(xì)菌在海洋生物生產(chǎn)和生源要素循環(huán)中起著十分重要的作用，是微食物環(huán)的核心部分。

2.2.1海水中異養(yǎng)菌數(shù)量變化

兩組海水樣品中異養(yǎng)菌數(shù)量的周年變化規(guī)律如圖1所示，從月份看，菌體數(shù)量由高到低順序?yàn)?月、5月、3月、9月、11月、1月；從季節(jié)上看，由高到低順序?yàn)橄募?、春季、秋季、冬季，均為夏季最高，冬季最少，春、秋兩季介于二者之間，這與細(xì)菌分布的一般規(guī)律相符，并且異養(yǎng)菌數(shù)處于同一數(shù)量級(jí)。從空間上來(lái)看，一年中各實(shí)驗(yàn)月，表層海水中異養(yǎng)菌數(shù)量大于10m層海水中異養(yǎng)菌數(shù)量，這可能是由于可供異養(yǎng)菌生存的水體有機(jī)物以及海洋污染物多存在于海水表層。

圖1　海水中異養(yǎng)菌數(shù)量的周年變化Fig.1　Annual　changes　of　heterotrophic　bacteria numbers　in　the　seawater

2.2.2蝦夷扇貝體內(nèi)異養(yǎng)菌數(shù)量

如圖2所示，蝦夷扇貝鰓中異養(yǎng)菌數(shù)量的周年變化趨勢(shì)，從月份看依次為7月、5月、3月、9月、11月、1月；從季節(jié)看依次為夏季、春季、秋季、冬季，夏季最高，冬季最少，春、秋兩季介于二者之間。與海水中異養(yǎng)菌數(shù)量相比較少，是由于蝦夷扇貝自身免疫系統(tǒng)的作用可以殺死部分異養(yǎng)菌。

圖2　蝦夷扇貝鰓中異養(yǎng)菌數(shù)量的周年變化Fig.2　Annual　changes　of　heterotrophic　bacteria numbers　in　the　gills　of　scallop

2.3弧菌數(shù)量周年變化

弧菌是自然海水中生存的正常菌群成員之一，是目前海水養(yǎng)殖業(yè)中最為常見(jiàn)的條件致病菌，廣泛存在于海水以及海產(chǎn)動(dòng)物如魚、蝦和貝類的消化道和體表上，當(dāng)環(huán)境條件適宜時(shí)引起其大量繁殖并表現(xiàn)致病性。一般情況下，自然海水中弧菌的數(shù)量較低，但在海水養(yǎng)殖環(huán)境中及排污口附近海區(qū)其數(shù)量明顯較高。弧菌喜好生長(zhǎng)于有機(jī)質(zhì)豐富的環(huán)境中，其數(shù)量的多寡可以指示環(huán)境的污染程度［10］。

2.3.1海水中致病性弧菌數(shù)量

海水中致病性弧菌數(shù)量變化如圖3所示。從月份看，菌體數(shù)量由高到低順序?yàn)?月、5月、9月、3月、1月、11月，10m層海水中菌體數(shù)量由高到低順序?yàn)?月、5月、9月、3月、11月、1月；從季節(jié)上來(lái)看，海水中為夏季最高，冬季最低，春秋兩季介于二者之間。

圖3　海水中致病性弧菌數(shù)量的周年變化Fig.3　Annual　changes　of　Vibrio　numbers　in　the　seawater

2.3.2蝦夷扇貝體內(nèi)致病性弧菌數(shù)量

在蝦夷扇貝鰓中的致病性弧菌數(shù)量變化如圖4所示。從月份看，菌體數(shù)量由高到低順序?yàn)?月、7月、3月、9月、1月、11月；從季節(jié)性來(lái)看，春夏秋三季均高于冬季，致病性弧菌春季數(shù)量的增大，可能是導(dǎo)致蝦夷扇貝在春季育苗期間大量死亡的原因之一。因此，加強(qiáng)春季該水域弧菌數(shù)量的監(jiān)測(cè)，并在其數(shù)量大幅度增加時(shí)，采取措施降低致病性弧菌數(shù)量，將會(huì)有效預(yù)防蝦夷扇貝細(xì)菌性疾病的發(fā)生。

圖4　蝦夷扇貝鰓中致病性弧菌數(shù)量的周年變化Fig.4　Annual　changes　of　Vibrio　numbers　in　the　gills of　scallop

3　結(jié)　論

細(xì)菌在海洋中既是生產(chǎn)者，又是分解者，它們是水域中食物鏈和微生物環(huán)的重要組成部分，所以通常通過(guò)統(tǒng)計(jì)它們的細(xì)胞數(shù)量和種群的組成來(lái)評(píng)價(jià)水質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)狀況、水域的環(huán)境條件，當(dāng)然水域環(huán)境條件的各種物理、化學(xué)和生物因素也會(huì)直接影響它們的生態(tài)分布，因此通過(guò)調(diào)查某一海域中細(xì)菌數(shù)量的變化和某些特殊生理類群的細(xì)菌的生態(tài)分布，可以為了解該海域的環(huán)境條件、生境的退化和修復(fù)提供基礎(chǔ)資料［13］。異養(yǎng)菌數(shù)是最常用來(lái)指示有機(jī)質(zhì)污染的一個(gè)指標(biāo)，我國(guó)國(guó)家海洋局在2002年4月頒布的《海水增養(yǎng)殖區(qū)監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)程》中加入了異養(yǎng)菌指標(biāo)，并以《異養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)評(píng)價(jià)等級(jí)表》作為參考標(biāo)準(zhǔn)。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)調(diào)查2012年8月—2013年7月大長(zhǎng)山島扇貝養(yǎng)殖海區(qū)表層海水、10m層海水與該海區(qū)養(yǎng)殖的成年蝦夷扇貝鰓中的異養(yǎng)菌、致病弧菌數(shù)量，分析了其周年變化趨勢(shì)，為評(píng)價(jià)該養(yǎng)殖海域的海水質(zhì)量、污染情況、水質(zhì)營(yíng)養(yǎng)狀況等指標(biāo)提供了基礎(chǔ)依據(jù)，并為防治扇貝養(yǎng)殖中由于細(xì)菌引起的病害起到積極作用。

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TheannualchangeofbacterianumbersinDachangshanIslandaquaculture farmanditscultivatedJapanesescallop（Mizuhopectenyessoensis）

ZHAOXiaomei，SANGXue，ZHANGGongliang，HOUHongman
（SchoolofFoodScienceandTechnology，DalianPolytechnicUniversity，Dalian116034，China）

TheannualchangeofheterotrophicbacteriaandpathogenicVibrionumbersinDachangshan Island，DalianChanghaiaquaculturefarmanditscultivatedJapanesescallop（Mizuhopecten yessoensis）wasstudiedbythedilutedplatemethod.whichwasobtainedfrom.Themaximum numbersofheterotrophicbacteriawere7.9×105，5.9×105cfu／mL，1.2×105cfu／gandVibriowere 1.6×102，1.7×102cfu／mL，87cfu／grespectivelyinthesurfaceseawater，10m－depthseawaterand adultscallops’gillsinMaytoJuly.Theminimumnumbersofheterotrophicbacteriawere1.7×105，8.0×104cfu／mL，2.7×104cfu／gandVibriowere60，67cfu／mL，28cfu／grespectivelyinNovember toJanuary.ThemaximumnumbersofVibrioinscallops’gillswere87cfu／ginspring.

Mizuhopectenyessoensis；heterotrophicbacteria；PathogenicVibrio；aquaculturefarm

TS254.1

A

1674－1404（2015）02－0084－04

2013－12－31.

遼寧省高等學(xué)校重大科技平臺(tái)項(xiàng)目（2011191）.

趙曉美（1989－），女，碩士研究生；通信作者：侯紅漫（1964－），女，教授.