紫球藻發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化

陳曉倩，吳桂君*（銀川能源學(xué)院生物工程學(xué)院，寧夏銀川750105）

紫球藻發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化

陳曉倩，吳桂君*
（銀川能源學(xué)院生物工程學(xué)院，寧夏銀川750105）

以普通攪拌式發(fā)酵罐為培養(yǎng)裝置，采用單因素試驗對生產(chǎn)紫球藻藻體的發(fā)酵條件進行優(yōu)化。利用吸光度值測定紫球藻細胞密度，反映其在不同的攪拌速率、光照強度、氮濃度以及NaCl含量條件下的生長趨勢。從而摸索出發(fā)酵罐培養(yǎng)生產(chǎn)紫球藻藻體的最佳條件。結(jié)果表明，紫球藻發(fā)酵培養(yǎng)的最佳攪拌速率、光照強度、氮濃度以及NaCl含量分別為200 r/min、5 000 lx、8 mmol/L、20‰。

紫球藻；生長趨勢；發(fā)酵培養(yǎng)；條件優(yōu)化

紫球藻（Porphyridium cruentum），低等真核光合生物，紅藻門中的單細胞藻類，是微藻中的“明星”［1-2］。它渾身是寶，富含多種營養(yǎng)物質(zhì)，例如藻紅蛋白、多不飽和脂肪酸以及獨特的細胞壁含硫酸多糖等［3-4］?，F(xiàn)今，螺旋藻、小球藻、鹽藻等多種微藻被開發(fā)為保健產(chǎn)品，紫球藻也因其巨大的營養(yǎng)價值而被關(guān)注。另外，它還被認為是一種良好的漁類飼養(yǎng)餌料［5-6］。

紫球藻分布廣、適應(yīng)力強，但是如果工業(yè)大規(guī)模培養(yǎng)，還需對它的最適生長條件進行摸索。所以，為了最大程度地對紫球藻所富含的多種活性物質(zhì)進行收集和開發(fā)，優(yōu)化并改良它的培養(yǎng)工藝仍是當前的研究熱點［7-8］。目前，對于微藻這種低等光合生物的大規(guī)模培養(yǎng)，一般使用管道狀循環(huán)光生物反應(yīng)器。而在實驗室，多采用普通瓶裝充氣式培養(yǎng)模式，培養(yǎng)量較少，且生長條件不易控制，平行培養(yǎng)條件往往差異較大，這就影響了研究結(jié)果的準確性。本實驗選用了較方便操作的普通攪拌式發(fā)酵罐（容量為10 L）作為紫球藻的培養(yǎng)裝置，提高了培養(yǎng)量，也解決了培養(yǎng)條件不易控制的問題，利于平行實驗的進行，從而提高了實驗結(jié)果的準確性。本研究分別以攪拌速率、光照強度、氮濃度、NaCl含量為單一變量因子，采用單因素試驗法［9］，對生產(chǎn)紫球藻藻體的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，從而摸索出發(fā)酵罐培養(yǎng)生產(chǎn)紫球藻藻體的最佳條件，以期為今后紫球藻的大量培養(yǎng)提供參考數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

紫球藻（Porphyridium cruentum）：由山東大學(xué)（威海）海洋學(xué)院應(yīng)用微生物研究所提供。

微量元素營養(yǎng)液配方：FeCl3·6H2O 2 mmol/L，MnCl27 mmol/L，ZnCl21mmol/L，CoCl2·6H2O1mmol/L，CuSO4·5H2O 1 mmol/L，（NH4）6MO7O21 mmol/L，乙二胺四乙酸二鈉鹽（ethylenediaminetetraaceticacid-2Na，EDTA-2Na）2mmol/L。

人工海水（artificial seawater，ASW）培養(yǎng)基：CaSO40.74g/L，KCl0.80g/L，MgCl2·6H2O2.60g/L，MgSO41.90g/L，維生素溶液1 mL，微量元素營養(yǎng)液1 mL。

所有試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

723PC可見分光光度計：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；YXQ-LS-50SII立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SYY1-I光學(xué)折射鹽度計：中國濟南光學(xué)儀器廠；ZDS-10F-2D照度計：上海市嘉定學(xué)聯(lián)儀表廠；RTG-APJ-10L發(fā)酵系統(tǒng)：江蘇科海生物工程設(shè)備有限公司。

1.3試驗方法

1.3.1紫球藻培養(yǎng)

以人工海水（ASW）［10-11］作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入適量微量元素，并根據(jù)不同的培養(yǎng)條件設(shè)置合適濃度的氮源硝酸鈉（NaNO3）及氯化鈉（NaCl）。

攪拌速率組：設(shè)置50 r/min、100 r/min、150 r/min、200 r/min、250 r/min的攪拌速率梯度，接種初始吸光度值為0.317的紫球藻藻種，于25℃、5 000 lx、30‰的NaCl含量、5 mmol/L氮濃度條件下培養(yǎng)。光強組：設(shè)置2 000 lx、4 000 lx、5 000 lx、6 000 lx、8 000 lx的光照強度梯度，接種初始吸光度值為0.300的紫球藻藻種，于25℃、200 r/min的攪拌速率、30‰的NaCl含量、5 mmol/L氮濃度條件下培養(yǎng)。氮濃度組：設(shè)置2mmol/L、4mmol/L、6mmol/L、8mmol/L、10 mmol/L的氮濃度梯度，接種初始吸光度值為0.255的紫球藻藻種，于25℃、200 r/min的攪拌速率、5 000 lx、30‰的NaCl含量條件下培養(yǎng)。NaCl含量組：設(shè)置10‰、20‰、30‰、40‰、50‰的NaCl含量梯度，接種初始吸光度值為0.285的紫球藻藻種，于25℃、200 r/min的攪拌速率、5 000 lx、5 mmol/L氮濃度條件下培養(yǎng)。以上各組的通氣量均設(shè)置為120 L/h。

1.3.2紫球藻生長速率的測定

通過測定604 nm波長條件下相應(yīng)藻液的吸光度值（OD604nm值）反映其細胞密度［2］，從而可以反映紫球藻在某一時刻的生物量。本研究通過比較不同時間段的生物量的變化趨勢來反映紫球藻的生長速率。

2　結(jié)果與分析

2.1攪拌速率對紫球藻生物量的影響

圖1　攪拌速率對紫球藻生長的影響Fig.1 Effect of agitation rate onP.cruentumgrowth

由圖1可知，攪拌速率為50 r/min條件下，紫球藻易沉積，生長速度緩慢；而在高速攪拌（250 r/min）條件下，由于對細胞產(chǎn)生的機械損傷，藻的生長也會受到一定抑制；在攪拌速率為50～200 r/min條件下，培養(yǎng)過程中各組紫球藻的生長速率隨著攪拌速率的增加而增大。在培養(yǎng)到第13天收獲時，200 r/min組生長最佳，OD604nm值為1.541。在利用攪拌式發(fā)酵罐培養(yǎng)紫球藻時，攪拌速率建議使用200 r/min。

2.2光照強度對紫球藻生物量的影響

圖2　光照強度對紫球藻生長的影響Fig.2 Effect of light intensity onP.cruentumgrowth

由圖2可知，紫球藻藻的生長需要合適的光照強度，過低或過高光強則不利于它的生長。在5 000 lx的光照強度下，紫球藻生長最快，在培養(yǎng)到第13天收獲時，OD604nm為1.701。在4 000 lx、6 000 lx條件下生長接近，在8 000 lx條件下生長量減少。因此，當用小型發(fā)酵罐培養(yǎng)紫球藻時，光強可選擇5 000 lx，但當培養(yǎng)規(guī)模增大時，可適當增大光強。

2.3氮濃度對紫球藻生物量的影響

圖3　氮濃度對紫球藻生長的影響Fig.3 Effect of nitrogen concentration onP.cruentumgrowth

由圖3可知，在培養(yǎng)初期，低氮組（2～4 mmol/L）生長較快，后隨著氮源的消耗生長速率逐漸降低。而高氮組（6～10 mmol/L），在培養(yǎng)初期，藻細胞生長受到了一定的抑制，生長速率低于低氮組；后隨著氮源的消耗，抑制情況減弱，生長速率逐漸增高。在培養(yǎng)到第13天收獲時，8 mmol/L組OD604nm為1.686。因此，在利用攪拌式發(fā)酵罐培養(yǎng)紫球藻時，以NaNO3為氮源的氮濃度建議使用8 mmol/L。

2.4 NaCl含量對紫球藻藻生物量的影響

圖4　NaCl含量對紫球藻生長的影響Fig.4 Effects of NaCl concentration onP.cruentumgrowth

由圖4可知，紫球藻生長需要適宜的鹽度，低鹽以及高鹽對紫球藻的生長都有一定程度的抑制。結(jié)果表明，在培養(yǎng)到第13天收獲時，紫球藻在20‰的NaCl含量下，細胞生長最快，OD604nm為1.552。50‰組細胞生長最慢。因此，在利用攪拌式發(fā)酵罐培養(yǎng)紫球藻時，以NaCl含量建議使用20‰。

3　結(jié)論

紫球藻生長分別需要適宜條件的攪拌速率、通氣量、光照強度以及營養(yǎng)鹽等。這些條件發(fā)生過高或者過低的改變都會影響到藻細胞的生長，使其受到一定的抑制［2］。本研究以藻生物量為評價指標，采用單因素試驗法，利用攪拌式發(fā)酵罐培養(yǎng)紫球藻，結(jié)果表明，其最佳攪拌速率、光照強度、氮濃度以及NaCl含量分別是200 r/min、5 000 lx、8 mmol/L、20‰。這些結(jié)果與王長海等［12］的研究報道基本相符合。陳必鏈等［13］認為攪拌速率在200 r/min左右最適宜紫球藻的生長，速率過低易導(dǎo)致藻細胞黏附或聚沉，不利于細胞生長；速率過高易對藻細胞造成機械損傷。他們還認為低于2 mmol/L的氮濃度不利于細胞生長；4 000 lx左右的光強為最適光強范圍；20‰～30‰為最適生長鹽度范圍［13-15］。今后可進行關(guān)于紫球藻發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化的正交試驗，確定培養(yǎng)紫球藻的最適發(fā)酵條件，從而為紫球藻的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

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Optimization ofPorphyridium cruentumfermentation conditions

CHEN Xiaoqian，WU Guijun*
（College of Biological Engineering，Yinchuan Energy Institute，Yinchuan 750105，China）

Using the ordinary stirred-tank fermentor as cultivation apparatus，the fermentation conditions ofPorphyridium cruentumwas optimized by single factor experiments.The cell density ofP.cruentumwas determined by spectrophotometry.The effects of agitation rate，light intensity，nitrogen concentration，NaCl content on growth tendency ofP.cruentumwere investigated，and the optimum fermentation conditions ofP.cruentumwere determined.The results showed that the optimum fermentation conditions were agitation rate 200 r/min，light intensity 5 000 lx，nitrogen concentration 8 mmol/L，NaCl content 20‰.

Porphyridium cruentum；growth tendency；fermentation cultivation；conditions optimization

TQ920.6

A

0254-5071（2015）11-0084-03

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.11.019

2015-09-21

銀川能源學(xué)院校級課題資助項目（2014-KY-Y-16）

陳曉倩（1986-），女，助教，碩士，主要從事微生物發(fā)酵研究工作。

吳桂君（1980-），男，講師，本科，主要從事食品工藝與開發(fā)研究工作。