人細(xì)小病毒B19的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)方法的建立

張彥東，鄔 巍，馬 寧，劉 濤，王 凱，姜振寧

（吉林大學(xué)第一醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科，吉林 長(zhǎng)春130021）

人微小病毒B19（Human Parvovirus B19，HPV B19）是一種DNA病毒，也是與人類最密切相關(guān)的微小病毒［1］。本病毒是由Yvonne Cossart等于1975年在標(biāo)記B19號(hào)HBsAg對(duì)照的血清中首次鑒定出一種微病毒顆粒。在實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中最早利用特異性血清學(xué)檢測(cè)，后又建立了PCR、熒光定量PCR［2］和基因芯片［3］等靈敏度較高的方法。

1 材料與方法

1.1 試劑 病毒基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自TIANGEN公司，DNA回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自Axygen公司、限制性內(nèi)切酶Hinf I、Dpn I和T4DNA連接酶均為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品，dNTPs、DL2000DNA Marker、甜菜堿（betaine）為Sigma公司產(chǎn)品；Bst DNA聚合酶大片段為NEB公司產(chǎn)品。

1.2 病毒DNA的抽提 參照DNA提取試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行病毒DNA的抽提。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成 利用LAMP引物在線設(shè)計(jì)軟件Primer explorer，根據(jù)登陸在GenBank中B19的VP2進(jìn)行比較，選擇基因保守區(qū)域，設(shè)計(jì)引物，篩選后選擇2對(duì)引物，F(xiàn)3/B3為外游引物，F(xiàn)IP/BIP為內(nèi)游引物。同時(shí)利用oligo軟件設(shè)計(jì)1對(duì)PCR引物，上游為upper，下游為lower。各引物序列為：

所有序列由深圳華大生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 PCR方法 按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行常規(guī)PCR方法對(duì)病毒DNA鑒定。

1.5 LAMP檢測(cè)方法 對(duì)25μl反應(yīng)體系中的MgSO4（25mmol/L）以及反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。調(diào)整試驗(yàn)中 MgSO4（25mmol/L）的用量，MgSO4（25 mmol/L）則為6μl，7μl，8μl；并且優(yōu)化 LAMP的反應(yīng)時(shí)間，分別調(diào)整為60min，90min，120min。反應(yīng)體系中其他用量為：2μl的DNA樣品、2.5μl的Bst DNA 聚合酶緩沖液（10×）、2μl dNTPs（10 mmol/L），1μl的 Bst DNA 聚合酶8U、Betaine（5 mol/L）、對(duì)應(yīng)于VP2基因的4條引物各濃度F3/B3為pmol/μl、BIP/FIP為40pmol/μl，加 H2O 補(bǔ)足至25μl?；靹?，65℃，1－2h后80℃，2min，水浴。1.0%瓊脂糖凝膠電泳，觀察試驗(yàn)結(jié)果。

1.6 LAMP產(chǎn)物的酶切鑒定和序列測(cè)定 將LAMP產(chǎn)物采用限制性內(nèi)切酶BanII進(jìn)行酶切鑒定，并以此為模板進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)回收、連接、轉(zhuǎn)化，得到陽(yáng)性克隆，并且送深圳華大公司基因測(cè)序。方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.7 LAMP的靈敏性與特異性評(píng)價(jià) 將抽提所得的總DNA 10倍稀釋至10－5.并使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定稀釋后各個(gè)梯度的DNA濃度，分別為100 ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg。對(duì)上述各濃度DNA用LAMP方法進(jìn)行檢測(cè)，并用PCR方法同時(shí)擴(kuò)增進(jìn)行靈敏性的比較。

按照與B19病毒相同的條件對(duì)乙型肝炎病毒（HBV），巨細(xì)胞病毒（HCMV）進(jìn)行DNA的提取，以及優(yōu)化后的LAMP檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 B19病毒的PCR結(jié)果 PCR結(jié)果可見(jiàn)在100 bp與250bp之間有一條陽(yáng)性條帶（圖1），與設(shè)計(jì)的198bp產(chǎn)物片段符合。

2.2 MgSO4以及反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化結(jié)果 根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明 MgSO4（25mmol/L）為6μl（圖2），最適反應(yīng)時(shí)間為60min（圖3）。

2.3 酶切鑒定及測(cè)序結(jié)果 用Hinf I和Dpn I限制性內(nèi)切酶對(duì)LAMP產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)中的LAMP產(chǎn)物片段大小與理論值相符。

2.4 LAMP的靈敏性和特異性結(jié)果 常規(guī)PCR產(chǎn)物稀釋至10pg時(shí)，PCR無(wú)結(jié)果，LAMP結(jié)果為陽(yáng)性（圖4），證明其靈敏性高于普通PCR。對(duì)HBV和HCMV進(jìn)行特異性判斷，LAMP檢測(cè)結(jié)果HBV和HCMV是陰性（圖4），B19病毒為陽(yáng)性，證明LAMP檢測(cè)方法具有特異性。

圖1 b19病毒PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

圖2 不同濃度Mg2＋離子的LAMP檢測(cè)結(jié)果

圖3 不同反應(yīng)時(shí)間的LAMP檢測(cè)結(jié)果

圖4 b19病毒的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

3 討論

3.1 人類細(xì)小病毒B19是一種DNA病毒，體積最小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，有報(bào)道該病毒與感染致過(guò)敏性紫癜、川崎?。?］、系統(tǒng)性紅斑狼瘡［5］、結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎、韋格納肉芽腫病和關(guān)節(jié)炎等均相關(guān)。但由于人類細(xì)小病毒B19很難在常規(guī)細(xì)胞系中繁殖，也無(wú)法在建立動(dòng)物模型中復(fù)制，因此對(duì)該病毒的研究有一定的限制。臨床上通常根據(jù)其抗體的檢測(cè)來(lái)判斷患者是否感染過(guò)B19病毒，對(duì)于抗原的檢測(cè)最常見(jiàn)的方法就是聚合酶鏈反應(yīng)（PCR），但該方法需要特殊的儀器、摸索適合PCR條件以及較長(zhǎng)的循環(huán)時(shí)間，并不適用于臨床檢測(cè)。近年來(lái)，各種等溫檢測(cè)技術(shù)被廣泛應(yīng)用［6］。本實(shí)驗(yàn)利用2000年日本Notomi博士發(fā)明的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP），在國(guó)內(nèi)首次建立人B19病毒LAMP檢測(cè)方法，實(shí)驗(yàn)僅需要一臺(tái)恒溫水浴鍋就可以在60min內(nèi)完成整個(gè)檢測(cè)過(guò)程，并且實(shí)驗(yàn)證明其敏感性高于普通PCR方法。真正達(dá)到了簡(jiǎn)單、高效的診斷檢測(cè)。

3.2 LAMP檢測(cè)方法中引物設(shè)計(jì)是其核心部分，也是技術(shù)關(guān)鍵 此方法是用4種不同的特異性引物識(shí)別靶基因的6個(gè)特定區(qū)域。實(shí)驗(yàn)的條件是60－65℃，此溫度是雙鏈DNA復(fù)性及延伸的中間溫度，DNA在65℃左右處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，依靠一種高活性鏈置換DNA聚合酶，使得鏈置換DNA合成在不停地自我循環(huán)。另外，很多文獻(xiàn)報(bào)道因?yàn)長(zhǎng)AMP檢測(cè)方法的靈敏度過(guò)高，實(shí)驗(yàn)中很容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。本實(shí)驗(yàn)中為避免此狀況，將進(jìn)行擴(kuò)增的空間與進(jìn)行電泳的空間嚴(yán)格隔離，并酶切鑒定結(jié)果的特異性。如果在臨床上應(yīng)用，則可以添置濁度儀或加入熒光染料就可避免此問(wèn)題。

［1］Torok TJ.Parvovlru8B19and Human disease［J］.Adv Intern Med，1992，37：431.

［2］趙國(guó)強(qiáng)，胡 軍，冷 弘，等.熒光定量PCR檢測(cè)B19病毒方法的建立［J］.鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，5：380.

［3］Lu liang，MA Wen－li，WANG Hong－min，et al.Quick preparations of human parvovirus B19micro array probes using PCR［J］.第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，23（11）：1121.

［4］鄭 巖.40例川崎病患兒微小病毒B19感染的近期分析［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2008，6：789.

［5］魯智勇，沈小雁，薛 峰，等.細(xì)小病毒B19感染與系統(tǒng)性紅斑狼瘡相關(guān)性研究［J］.中華風(fēng)濕病學(xué)雜志，2006，10（7）：430.

［6］張福明，李 凡，張淑芹.網(wǎng)狀分枝擴(kuò)增法檢測(cè)EB病毒基因及臨床應(yīng)用研究［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2006，3：221.