不同提取方法的寧神方鎮(zhèn)靜催眠作用及化學(xué)成分比較研究△

張艷紅，姚譞，葉玉妹

(1.上海市第七人民醫(yī)院，上海 200137；2.國家中藥制藥工程技術(shù)研究中心，上海 201203；3.上海中藥制藥技術(shù)有限公司，上海 201203)

·基礎(chǔ)研究·

不同提取方法的寧神方鎮(zhèn)靜催眠作用及化學(xué)成分比較研究△

張艷紅2，3，姚譞2，3，葉玉妹1*

(1.上海市第七人民醫(yī)院，上海 200137；2.國家中藥制藥工程技術(shù)研究中心，上海 201203；3.上海中藥制藥技術(shù)有限公司，上海 201203)

目的：通過考察不同工藝(原工藝、水提合煎、水提醇沉)所得寧神提取物對小鼠鎮(zhèn)靜、催眠作用及有效成分的影響，對院內(nèi)制劑寧神方制備工藝方法進(jìn)行優(yōu)化。方法：用戊巴比妥鈉閾上劑量睡眠實(shí)驗(yàn)和閾下劑量睡眠誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，觀察三種工藝寧神提取物的催眠作用，用地西泮、復(fù)方五味子糖漿進(jìn)行平行對照實(shí)驗(yàn)。并對不同工藝得到的提取物的出膏率、特女貞苷、丹酚酸B和二苯乙烯苷含量進(jìn)行測定。結(jié)果：三種工藝提取物的戊巴比妥鈉閾下和閾上劑量實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)變化趨勢一致，都反映了寧神提取物可延長小鼠的睡眠持續(xù)時間，增加小鼠的入睡數(shù)量。結(jié)論： 證明了寧神方具有鎮(zhèn)靜、催眠作用。相比于原院內(nèi)制劑工藝，水提合煎(NS2)提取物具有更優(yōu)藥效，為更優(yōu)工藝。且為寧神方新藥開發(fā)工藝優(yōu)化提供了藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

寧神方；有效成分；鎮(zhèn)靜催眠

寧神方是上海市名老中醫(yī)葉景華主任據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)制成的協(xié)定處方，早在1978年便批準(zhǔn)為院內(nèi)制劑，已有30 余年臨床使用歷史。方藥組成：女貞子(9 g)、桑椹子(9 g)、丹參(13.5 g)、景天三七(22.5 g)、首烏藤(27 g)、制香附(9 g)、香櫞(9 g)。寧神方組方藥味簡練，藥性平和，長期反復(fù)運(yùn)用于臨床；使用于失眠癥的病人，臨床效果明顯，無明顯副作用[1-3]。

為進(jìn)一步優(yōu)化寧神方的制備工藝，使其適合新藥開發(fā)和工業(yè)大生產(chǎn)，本文擬在寧神方院內(nèi)制劑的基礎(chǔ)上，根據(jù)失眠癥的病理病因特征，采用以生物活性為導(dǎo)向的藥效學(xué)篩選模式對比考察水提(合煎)、水提(香附分煎)、水提醇沉三種工藝條件下提取物的鎮(zhèn)靜催眠作用，優(yōu)化原院內(nèi)制劑工藝。去除提取物中的無效雜質(zhì)，最大限度地篩選并保留其藥效成分，為寧神方的中藥新藥開發(fā)做好前期基礎(chǔ)。

1 材料

1.1藥品和試劑

戊巴比妥鈉(Merck)；復(fù)方五味子糖漿(上海美優(yōu)制藥有限公司，批號：120501)。特女貞苷對照品、丹酚酸B對照品和二苯乙烯苷對照品購自中國食品藥品檢定研究院。實(shí)驗(yàn)用藥材女貞子、桑椹子、丹參、景天三七、首烏藤、制香附、香櫞(香圓)購自上海華宇藥業(yè)有限公司。

1.2試驗(yàn)動物

健康KM小鼠，雄性，分成6組，每組15只，體重18～20g。由上海中科院實(shí)驗(yàn)動物中心供應(yīng)。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器

Agilent1100高效液相色譜儀。

2 方法

2.1供試提取物制備

NS1(院內(nèi)制劑工藝制備)：香附加7倍量水浸泡30min，充分浸潤后，煎煮15min，濾過，備用。其余六味藥第一次加水8倍量浸泡45min，充分浸潤后，與香附藥渣合并，煎煮1.5h，第二次加4倍量的水，煎煮0.5h。煎液濾過，合并濾液，放置12h以上。分取上清液，減壓濃縮至相對密度為1.20～1.25(80℃)的稠膏，加入香附提取液，減壓干燥，得提取物NS1。

NS2(水提合煎)：7味藥第一次加8倍量水浸泡45min，煎煮1.5h，第二次加4倍量的水，煎煮0.5h。煎液濾過，合并濾液，放置12h以上。分取上清液，減壓濃縮至相對密度為1.20～1.25(80℃)的稠膏，減壓干燥，得提取物NS2。

NS3(水提醇沉)：7味藥第一次加8倍量水浸泡45min，煎煮1.5h，第二次加4倍量的水，煎煮0.5h。煎液濾過，合并濾液，放置12h以上。分取上清液，提取液減壓濃縮至密度約1.20(60℃)冷卻后加入乙醇至濃度60%，靜置過夜，離心，上清液濃縮，減壓干燥，得提取物NS3。

按照20倍日服量，即女貞子180g、桑椹子180g、丹參270g、景天三七450g、首烏藤540g、制香附180g、香櫞180g進(jìn)行三個工藝進(jìn)行提取，得到各工藝提取物。

2.2致小鼠閾下催眠戊巴比妥鈉劑量預(yù)實(shí)驗(yàn)[4]

分別設(shè)置不同劑量戊巴比妥鈉腹腔注射，觀察小鼠的翻正反射，實(shí)驗(yàn)使得80%～100%小鼠翻正反射不消失為最佳實(shí)驗(yàn)劑量。

2.3致小鼠100%睡眠戊巴比妥鈉劑量預(yù)實(shí)驗(yàn)[5-6]

逐漸增加戊巴比妥鈉腹腔注射劑量，實(shí)驗(yàn)得到某個劑量正好能夠使得動物100%進(jìn)入睡眠，但又不使睡眠時將過長的戊巴比妥鈉劑量為實(shí)驗(yàn)劑量。

睡眠的判斷：觀察戊巴比妥鈉腹腔注射后30min內(nèi)動物翻正反射消失達(dá)1分鐘以上者，表明已發(fā)生了睡眠。

2.4不同工藝寧神提取物對小鼠戊巴比妥鈉閾上劑量睡眠時間的影響

雄性小鼠90只，隨機(jī)分成6組，每組15只，分別為空白組，地西泮片對照組、五味子對照組、給藥組NS1，NS2和NS3。五味子對照組及各給藥組動物于正式試驗(yàn)前連續(xù)10d灌胃給予以上藥物試劑。地西泮片對照組于正式試驗(yàn)前連續(xù)3天灌胃給予以上對照藥物。正式試驗(yàn)閾上試驗(yàn)灌胃給藥一次后30min腹腔注射戊巴比妥鈉閾上劑量54mg·kg-1(由之前預(yù)試得到使100%小鼠翻正反射消失的劑量)，觀察記錄各組小鼠的睡眠持續(xù)時間。

2.5不同工藝寧神提取物對小鼠戊巴比妥鈉閾下劑量睡眠數(shù)的影響

完成致小鼠閾下催眠戊巴比妥鈉劑量預(yù)實(shí)驗(yàn)后的小鼠，經(jīng)過戊巴比妥鈉3d的洗凈期后，按預(yù)實(shí)驗(yàn)的方法灌胃給藥后30min腹腔注射戊巴比妥鈉閾下劑量42mg·kg-1(由之前預(yù)試得到使80%小鼠翻正反射不消失的劑量)，以戊巴比妥鈉腹腔注射后30min內(nèi)動物翻正反射消失達(dá)1min以上為睡眠標(biāo)準(zhǔn)，觀察各組睡眠小鼠的個數(shù)。

2.6不同工藝提取物中標(biāo)示成分含量的測定

在前期藥效學(xué)研究的基礎(chǔ)上，參照《中華人民共和國》2010版[7]中含量測定條件，采用高效液相法對寧神方中君藥女貞子標(biāo)識成分特女貞苷、臣藥丹參中的水溶性成分丹酚酸B和首烏藤中標(biāo)示成分二苯乙烯苷進(jìn)行含量測試，其中每個提取物平行制備三個樣品，含量結(jié)果取三次測定的平均值。

2.6.1供試品溶液制備 取提取物約100mg，加入超純水10mL，使得溶液濃度約為10mg·mL-1。在超聲波清洗器中超聲20min，過45μm微孔濾膜，得供試品溶液。

2.6.2特女貞苷檢測色譜條件 色譜柱：SHISEIDO-C18柱，(4.6×250mm，5μm)；流動相：甲醇-水(40∶60)；流速：0.8mL·min-1；檢測溫度：25℃；檢測波長：224nm。

2.6.3丹酚酸B檢測色譜條件 色譜柱：SHISEIDO-C18柱，(4.6×250mm，5μm)；流動相：甲醇-乙腈-甲酸-水(30∶10∶1∶59)；流速：1.0mL·min-1；檢測溫度：25℃；檢測波長：286nm。

2.6.4二苯乙烯苷檢測色譜條件 色譜柱：SHISEIDO-C18柱，(4.6×250mm，5μm)；流動相：乙腈-水(24∶76)；流速：1mL·min-1；檢測溫度：25℃；檢測波長：320nm。

3 結(jié)果

3.1不同提取工藝制得的寧神提取物對小鼠戊巴比妥鈉閾下劑量睡眠數(shù)的影響

通過與空白對照組相比，地西泮、五味子糖漿、NS1、NS2和NS3組的睡眠小鼠數(shù)量均有一定增加，入睡百分率也有所提高。其中NS1和NS2組可明顯增加小鼠戊巴比妥鈉閾下劑量的睡眠動物數(shù)，與空白對照組相比具有顯著性差異(P<0.05)；而NS3組與空白組無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。研究說明，NS1和NS2兩種提取工藝得到的寧神提取物能夠顯著提高小鼠戊巴比妥鈉閾下劑量睡眠數(shù)，且NS2效果最優(yōu)。結(jié)果見表1。

表1 寧神提取物對小鼠戊巴比妥鈉閾下劑量睡眠數(shù)的影響

注：與空白對照相比，**P<0.01，*P<0.05。

3.2不同提取工藝制得的寧神提取物對小鼠戊巴比妥鈉閾上劑量睡眠時間的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：三組提取物組與空白對照組相比，均能一定程度延長小鼠睡眠持續(xù)時間。其中NS1和NS2組能夠顯著延長小鼠睡眠的持續(xù)時間，與空白對照組相比具有顯著性差異(P<0.05)；而NS3組雖有延長睡眠時間的趨勢，但與空白對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。研究表明，NS1和NS2提取工藝得到的寧神提取物具有對小鼠戊巴比妥鈉閾上劑量睡眠時間的影響較明顯的鎮(zhèn)靜安神作用。結(jié)果見表2。

表2 寧神提取物對小鼠戊巴比妥鈉閾上劑量睡眠時間的影響

注：與空白對照相比，**P<0.01，*P<0.05。

3.3不同提取工藝制得的寧神提取物標(biāo)示成分含量的測定結(jié)果

通過HPLC色譜分析法對特女貞苷、丹酚酸B和二苯乙烯苷標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了譜峰確認(rèn)(圖1、圖2、圖3)，通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在該液相條件下，測試峰得到了較好的分離。

通過對不同工藝提取物進(jìn)行含量測定發(fā)現(xiàn)(表3)，香附與其他藥材同煎工藝(NS2)較原提取工藝(NS1)在出膏率、特女貞苷、丹酚酸B和二苯乙烯苷含量上較原工藝有所增加。進(jìn)一步通過醇沉工藝純化后，出膏率從原工藝的24%左右降低為12%左右，提取物中特女貞苷和丹酚酸B的含量有所增加，說明丹特女貞苷和丹酚酸B在純化過程中得到了富集。但二苯乙烯苷的含量較未醇沉工藝有所降低，說明在醇沉過程中部分二苯乙烯苷與多糖、蛋白等雜質(zhì)共沉淀，水提醇沉法不適用于二苯乙烯苷的富集。

表3 寧神提取物中標(biāo)示成分含量 (%)

圖1 各工藝提取物的特女貞苷含量測定HPLC圖

圖2 各工藝提取物的丹酚酸B含量測定HPLC圖

圖3 各工藝提取物的二苯乙烯苷含量測定HPLC圖

4 討論

通過戊巴比妥鈉閾上劑量睡眠實(shí)驗(yàn)和閾下劑量睡眠誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)說明寧神方三種工藝提取物的戊巴比妥鈉閾下和閾上劑量實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)變化趨勢一致，反映了寧神提取物可延長小鼠的睡眠持續(xù)時間，增加小鼠的入睡數(shù)量，證明了寧神提取物具有鎮(zhèn)靜、催眠作用。不同提取工藝得到的寧神提取物的鎮(zhèn)靜、催眠療效顯著性存在一定的差異，NS2在延長小鼠睡眠持續(xù)時間及增加小鼠入睡數(shù)量兩方面均具有明顯的效果。戊巴比妥鈉閾上劑量睡眠實(shí)驗(yàn)和閾下劑量睡眠誘導(dǎo)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)為寧神提取物的工藝篩選提供了一定的藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

NS2在原院內(nèi)制劑制備方法(NS1)的基礎(chǔ)上，將方中香附合煎，減少了工藝流程，且更適合工業(yè)化生產(chǎn)，通過藥效篩選，其鎮(zhèn)靜安神效果稍好或類似于原院內(nèi)制劑(NS1)，且指標(biāo)性成分特女貞苷、丹酚酸B和二苯乙烯苷含量均有所提高。而經(jīng)過醇沉工藝純化后，NS3雖然出膏率降低，能為后續(xù)制劑帶來了便利，但藥效大大降低。同時，醇沉工藝對特女貞苷、丹酚酸B和二苯乙烯苷的富集效率較低。因此，醇沉工藝不適用于寧神方的制備。

通過以藥效學(xué)指導(dǎo)和指標(biāo)性成分含量分析，對院內(nèi)制劑寧神方的制備工藝方法進(jìn)行了初步評價，為后續(xù)新藥開發(fā)的工藝研究奠定了基礎(chǔ)。

[1] 葉玉妹，張曉丹，劉大慶，等.寧神方治療失眠癥臨床觀察[J].遼寧中醫(yī)雜志，2003，40(7)：1396-1398.

[2] 葉玉妹.寧神方治療更年期婦女失眠癥36例[J].中醫(yī)藥臨床雜志，2009，21(3)：232-233.

[3] 葉玉妹，楊慰，吳文雯，等.寧神方對更年期婦女失眠療效及安全性臨床觀察[C].第三屆中國睡眠醫(yī)學(xué)論壇論文匯編，中醫(yī)與中西醫(yī)結(jié)合研究：22-27.

[4] 于峰.鎮(zhèn)靜安神中藥鎮(zhèn)靜催眠作用的研究[J].中醫(yī)雜志，2009，50(9)：243-244.

[5] 朱小寧.復(fù)方安神液的鎮(zhèn)靜催眠作用[J].藥學(xué)與臨床研究，2007，15(2)：127-128.

[6] 徐叔云，卞如濂，陳修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].第三版.北京：北京人民衛(wèi)生出版社，2005：801-806.

[7] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社：2010：43，70，248.

ComparisonofSedativeandHypnoticEffectsandChemicalComponentsofNingshenExtractwithDifferentExtractionTechnologies

ZHANGYanhong2，3，YAOXuan2，3，YEYumei1*

(1.ShanghaiSeventhPeople’sHospital，Shanghai200137，China；2.NationalEngineeringandResearchCenterforTCM，Shanghai201203，China；3.ShanghaiPharmaceuticalTechnologyforTCMCo.，Ltd.，Shanghai201203，China)

Objective：To compare the sedative and hypnotic effects and chemical components of Ningshen extract with different extraction technologies.Methods：The sleeping time and delitescence included by above threshold dose of pentobarbital sodium and sleeping number induced by below threshold dose of pentobarbital sodium were utilized to observe the hypnotic effect of different extracts in mice.Diazepam and extracts ofSchisandrachinensiswas applied as positive control drugs.Results：All the three extracts could obviously reduce spontaneous activity，increase sleeping time and sleeping number in mice，while thesleeping delitescence was shortened.Extracts of all the herbs decocted together (NS2) showed more effective.Conclusion：All the three extracts could induce sedative and hypnotic effects.The sleeping time and delitescence included by above threshold dose of pentobarbital sodium and sleeping number induced by below threshold dose of pentobarbital sodium can be introduced to guide the screening of extraction process.

Ningshen extract；chemical components；sedative and hypnotic effects.

上海市衛(wèi)生計劃生育委員會中醫(yī)藥發(fā)展辦公室(2011x010)；國家科技支撐計劃課題(2012BAI29B00)；上海市科學(xué)技術(shù)委員會科技支撐 項(xiàng)目(12401900202)

*

葉玉妹，主任醫(yī)師，研究方向：中醫(yī)內(nèi)、婦科；Tel：(021)50805522-4007，E-mail：yeyumei0206@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.12.009

2015-04-16)