柱后衍生法分析8種氨基甲酸酯農(nóng)藥

潘媛媛　劉曉達(dá)　金燕

氨基甲酸酯類農(nóng)藥的結(jié)構(gòu)特性是分子中含有一個N-甲基基團(tuán)，是一類以甲酸酯為前體化合物發(fā)展而來的農(nóng)藥，具有分解快、殘留低、低毒、高效、選擇性強(qiáng)等特點(diǎn)，代表品種有甲萘威（西維因）、涕滅威、呋喃丹（克百威）等。20世紀(jì)70年代以來，由于有機(jī)氯農(nóng)藥品種相繼被不同國家禁用或者限制使用，以及抗有機(jī)磷農(nóng)藥的昆蟲品種的日益增多，氨基甲酸酯類農(nóng)藥的使用量逐年增加。

大多數(shù)氨基甲酸酯類農(nóng)藥的半衰期較短，在堿性和高溫條件下容易分解，施用后短時間內(nèi)就會被降解為相應(yīng)的代謝產(chǎn)物。其代謝產(chǎn)物通常具有與母體氨基甲酸酯類農(nóng)藥相同或更強(qiáng)的生物活性，例如涕滅威亞砜（涕滅威的代謝產(chǎn)物）與涕滅威相比，具有更強(qiáng)的抗膽堿酯酶的作用。因此，在測定氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留時，必須考慮如何有效地對代謝產(chǎn)物進(jìn)行測定。

分光光度法是較早用于氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留測定的方法之一，由于操作繁瑣，易受其他物質(zhì)干擾，現(xiàn)已很少使用。從1977年第一次采用HPLC柱后衍生測定氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留以來，采用HPLC柱后水解或柱后衍生方法對復(fù)雜介質(zhì)中氨基甲酸酯類農(nóng)藥的殘留量進(jìn)行檢測越來越普遍。

農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 761-2008第三部分蔬菜和水果中氨基甲酸酯類農(nóng)藥多殘留的測定中，規(guī)定了該類化合物采用液相色譜法分離，柱后在線水解生成甲胺進(jìn)行熒光衍生后檢測的方法。檢測原理如下：氨基基于氨基甲酸酯農(nóng)藥分析需要兩級衍生，本文欲通過雙三元液相色譜左泵分析，右泵和AXP泵分別輔助衍生化，建立氨基甲酸酯柱后衍生后檢測的方法。甲酸酯類化合物經(jīng)反相柱分離后，首先在100℃強(qiáng)堿性條件（NaOH）下水解生成甲胺；第二個柱后反應(yīng)中甲胺與熒光衍生試劑鄰苯二甲醛（OPA）和2-巰基乙醇反應(yīng)，生成有強(qiáng)熒光吸收的1-甲基-2-吲哚類化合物，進(jìn)行較高靈敏度的熒光檢測。

本方法參考NY/T 761-2008 方法，建立了采用雙三元液相色譜配合AXP泵輔助柱后衍生，實(shí)現(xiàn)了8種氨基甲酸酯農(nóng)藥的檢測，最低檢測限可達(dá)0.008～0.015mg/L，滿足NY/T 761-2008的要求。

儀器

Thermo ScientificTM DionexTM UltiMateTM 3000RS色譜系統(tǒng)，包括：DGP-3600RS色譜泵、WPS-3000TRS自動進(jìn)樣器（配置100μL定量環(huán)）、TCC-3000RS柱溫箱、TCC-3000SD柱溫箱、FLD-3400RS二極管陣列檢測器、AXP泵（P/N V10PFT03DX）、Thermo ScientificTM DionexTM ChromeleonTM 色譜工作站。

耗材

Thermo ScientificTM Target2TM Nylon Syring Filters（0.45μm，30mm，P/N F2500-1）；

一次性使用無菌注射器，1mL（上海治宇醫(yī)療器械有限公司）；

柱后衍生反應(yīng)管750μL（P/N 042631）；

柱后衍生反應(yīng)管375μL（P/N 043700）。

試劑與標(biāo)準(zhǔn)品

去離子水（18.2MΩ-cm，Thermo ScientificTM genPure ProTM UV-TOC，P/N 50131948）；

甲萘威、克百威、涕滅威、3-羥基呋喃丹、滅多威、殺線威、涕滅威砜、涕滅威亞砜混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，0.1mg/mL溶解在乙腈中（AccuStandard?.Inc.）、鄰苯二甲醛（98%，Alfa Aesar）硼酸、巰基乙醇、氫氧化鈉（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

衍生溶液的制備

衍生試劑1

50mM氫氧化鈉，稱取2g氫氧化鈉，用水（預(yù)先用氮?dú)獯祾?min）溶解并定容至1000mL量瓶中，搖勻備用。

衍生試劑2

0.4M硼酸緩沖液（pH=10.0）：稱取24.8g硼酸，14.1g氫氧化鈉，用水稀釋并定容至1000mL容量瓶中，搖勻備用。

鄰苯二甲醛溶液：稱取200mg鄰苯二甲醛，用甲醇溶解并定容至100mL容量瓶中，搖勻備用。

鄰苯二甲醛-巰基乙醇衍生試液：取100mL鄰苯二甲醛溶液轉(zhuǎn)移至棕色容器中，加入巰基乙醇（200μL），搖勻，氮?dú)獯祾?分鐘，避光密封備用。

設(shè)置硼酸緩沖液與衍生試液的混合比例為4∶1，并調(diào)節(jié)混合后的溶液流速為0.3mL/min。

色譜條件

淋洗液：A：水 B：甲醇

結(jié)果

本方法中色譜分離條件采用農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)NY/T 761-2008中的液相條件，雙三元液相色譜其中一個泵（左泵）作分析泵，色譜柱采用Acclaim 120 C18， 5μm4.6×250mm，在30min內(nèi)可實(shí)現(xiàn)8種氨基甲酸酯農(nóng)藥的分離。8種氨基甲酸酯在色譜柱分離后，進(jìn)入一級衍生，AXP泵做衍生泵，衍生溫度為100℃，衍生溫度由TCC-3000RS柱溫箱提供；二級衍生為OPA衍生，雙三元另一個泵（右泵）做衍生泵，衍生溫度為室溫。衍生后進(jìn)入熒光檢測器分析，結(jié)果如色譜圖1所示。

線性范圍考察

將不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液依次測定，取其峰面積值，以峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得到各化合物的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)，如表1所示，以信噪比S/N=3計(jì)算方法的檢出限，結(jié)果見表1。

與NY/T 761-2008方法的檢出限比較，該方法靈敏度符合或優(yōu)于農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)，如表2所示。

重復(fù)性試驗(yàn)

去對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5針，見圖2。

測試結(jié)果表明，連續(xù)進(jìn)樣5針，保留時間和峰面積重復(fù)性均符合要求，結(jié)果見表3，表明該方法重復(fù)性良好。

討論

本文探索了利用雙三元液相色譜結(jié)合AXP輔助泵，實(shí)現(xiàn)氨基甲酸酯柱后兩級衍生并熒光檢測的可行性。結(jié)果表明，該方法完全可以滿足NY/T 761-2008方法的靈敏度要求。本方法所分析的化合物中，殺線威并未包含在NY/T 761-2008方法中，但在色譜圖中，殺線威和涕滅威砜出峰時間相近，如果二者在色譜柱上分離度差，勢必會對實(shí)際樣品檢測有影響，因此對于色譜柱的選擇非常重要；本方法中，殺線威和涕滅威砜的分離度為1.62，可達(dá)到完全基線分離，因此該條件下Acclaim C18， 5μm4.6×250mm色譜柱完全可以用于氨基甲酸酯的分析，此外選用Acclaim PAII， 5μm4.6×250mm色譜柱，同樣可以達(dá)到很好的分析效果。

該柱后衍生系統(tǒng)為實(shí)驗(yàn)室自己搭建，在雙三元的基礎(chǔ)上，只需額外配置一臺AXP泵和常規(guī)柱溫箱即可實(shí)現(xiàn)氨基甲酸酯的檢測，與Pickering等柱后衍生儀相比，成本大大降低，且完全滿足NY/T 761-2008的靈敏度要求。如果用戶需要更高靈敏度的分腈中（AccuStandard?.Inc.）、鄰苯二甲醛（98%，Alfa Aesar）硼酸、巰基乙醇、氫氧化鈉（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

衍生溶液的制備

衍生試劑1

50mM氫氧化鈉，稱取2g氫氧化鈉，用水（預(yù)先用氮?dú)獯祾?min）溶解并定容至1000mL量瓶中，搖勻備用。

衍生試劑2

0.4M硼酸緩沖液（pH=10.0）：稱取24.8g硼酸，14.1g氫氧化鈉，用水稀釋并定容至1000mL容量瓶中，搖勻備用。

鄰苯二甲醛溶液：稱取200mg鄰苯二甲醛，用甲醇溶解并定容至100mL容量瓶中，搖勻備用。

鄰苯二甲醛-巰基乙醇衍生試液：取100mL鄰苯二甲醛溶液轉(zhuǎn)移至棕色容器中，加入巰基乙醇（200μL），搖勻，氮?dú)獯祾?分鐘，避光密封備用。

設(shè)置硼酸緩沖液與衍生試液的混合比例為4∶1，并調(diào)節(jié)混合后的溶液流速為0.3mL/min。

色譜條件

淋洗液：A：水 B：甲醇

結(jié)果

本方法中色譜分離條件采用農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)NY/T 761-2008中的液相條件，雙三元液相色譜其中一個泵（左泵）作分析泵，色譜柱采用Acclaim 120 C18， 5μm4.6×250mm，在30min內(nèi)可實(shí)現(xiàn)8種氨基甲酸酯農(nóng)藥的分離。8種氨基甲酸酯在色譜柱分離后，進(jìn)入一級衍生，AXP泵做衍生泵，衍生溫度為100℃，衍生溫度由TCC-3000RS柱溫箱提供；二級衍生為OPA衍生，雙三元另一個泵（右泵）做衍生泵，衍生溫度為室溫。衍生后進(jìn)入熒光檢測器分析，結(jié)果如色譜圖1所示。

線性范圍考察

將不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液依次測定，取其峰面積值，以峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得到各化合物的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)，如表1所示，以信噪比S/N=3計(jì)算方法的檢出限，結(jié)果見表1。

與NY/T 761-2008方法的檢出限比較，該方法靈敏度符合或優(yōu)于農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)，如表2所示。

重復(fù)性試驗(yàn)

去對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5針，見圖2。

表2 方法檢出限與NY/T 761-2008對比

測試結(jié)果表明，連續(xù)進(jìn)樣5針，保留時間和峰面積重復(fù)性均符合要求，結(jié)果見表3，表明該方法重復(fù)性良好。

討論

本文探索了利用雙三元液相色譜結(jié)合AXP輔助泵，實(shí)現(xiàn)氨基甲酸酯柱后兩級衍生并熒光檢測的可行性。結(jié)果表明，該方法完全可以滿足NY/T 761-2008方法的靈敏度要求。本方法所分析的化合物中，殺線威并未包含在NY/T 761-2008方法中，但在色譜圖中，殺線威和涕滅威砜出峰時間相近，如果二者在色譜柱上分離度差，勢必會對實(shí)際樣品檢測有影響，因此對于色譜柱的選擇非常重要；本方法中，殺線威和涕滅威砜的分離度為1.62，可達(dá)到完全基線分離，因此該條件下Acclaim C18， 5μm4.6×250mm色譜柱完全可以用于氨基甲酸酯的分析，此外選用Acclaim PAII， 5μm4.6×250mm色譜柱，同樣可以達(dá)到很好的分析效果。

該柱后衍生系統(tǒng)為實(shí)驗(yàn)室自己搭建，在雙三元的基礎(chǔ)上，只需額外配置一臺AXP泵和常規(guī)柱溫箱即可實(shí)現(xiàn)氨基甲酸酯的檢測，與Pickering等柱后衍生儀相比，成本大大降低，且完全滿足NY/T 761-2008的靈敏度要求。如果用戶需要更高靈敏度的分析，如環(huán)境方向，建議配置Pickering等柱后衍生儀。

附注1：

雙三元流路連接圖

附注2：

在實(shí)驗(yàn)過程中，有幾個方面需要注意：

（1）為保證AXP泵和雙三元衍生泵穩(wěn)定的性能，需要在衍生管前連接反壓管。

（2）衍生液和色譜柱流出液進(jìn)入三通管時，建議兩者以 90°方向接入，混合后流入衍生反應(yīng)管。

（3）衍生管后的管路需用灰色或綠色PEEK管，或其他內(nèi)徑相當(dāng)管路，避免反壓過高，造成衍生管接頭漏液。

（4）第二步OPA衍生溫度為室溫，但環(huán)境溫度變化會影響基線噪音，建議可將第二路衍生管浸入燒杯中室溫水浴，可以避免溫度的劇烈變化。

（5）實(shí)驗(yàn)開始后，需要按照流路從后往前的順序，關(guān)閉雙三元衍生泵、AXP泵、雙三元衍生泵；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，需要按照流路從后往前的順序，關(guān)閉雙三元衍生泵、AXP泵、雙三元分析泵。這樣可以避免衍生流路中強(qiáng)堿反流進(jìn)入色譜柱，造成色譜柱損傷；編輯方法關(guān)機(jī)程序時，也按照該停泵順序進(jìn)行編輯。

（6）實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，需要用水徹底沖洗衍生管，避免長時間放置造成堵塞。