維藥異常黑膽質(zhì)成熟劑對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的影響

朱瑞祥，李加輔，許言文，錢(qián)　璇，馬少林

（新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院燒傷整形科新疆烏魯木齊830054）

·基礎(chǔ)研究·

維藥異常黑膽質(zhì)成熟劑對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的影響

朱瑞祥，李加輔，許言文，錢(qián)璇，馬少林

（新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院燒傷整形科新疆烏魯木齊830054）

目的：研究維藥異常黑膽質(zhì)成熟劑（abnormal savda munziq，ASMq）對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的影響。方法：組織塊法體外培養(yǎng)人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞，將其分為6組：對(duì)照組：加入等體積的培養(yǎng)液；實(shí)驗(yàn)組：加或不加不同濃度ASMq（0.2mg/ml，0.4mg/ml，0.6mg/ml，1.0mg/ml）及濃度為5ng/ml的TGF-β1；CCK-8法檢測(cè)成纖維細(xì)胞增殖情況，應(yīng)用western blot，RT-PCR檢測(cè)CollagenⅠ及Smad7表達(dá)情況。結(jié)果：ASMq降低了TGF-β1誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞增殖（P＜0.05）；ASMq下調(diào)了TGF-β1誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞CollagenⅠmRNA及CollagenⅠ的表達(dá)（P＜0.05），同時(shí)，ASMq明顯增加了被TGF-β1抑制的Smad7mRNA和Smad7的表達(dá)（P＜0.05）。結(jié)論：研究結(jié)果表明ASMq通過(guò)促進(jìn)Smad7合成來(lái)阻斷增生性瘢痕成纖維細(xì)胞TGF-β/Smad通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而降低成纖維細(xì)胞增殖及CollagenⅠ合成。

異常黑膽質(zhì)成熟劑；增生性瘢痕；成纖維細(xì)胞；TGF-β

增生性瘢痕（Hypertrophic Scar，HS）是以膠原過(guò)度沉積為特征的一種病理現(xiàn)象，其誘發(fā)的具體機(jī)制是多樣的，組織學(xué)上以成纖維細(xì)胞的過(guò)度增生和細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度聚集為特征，常發(fā)生在外傷、外科手術(shù)或燒傷后，且臨床治療比較復(fù)雜和困難［1-3］，因此，HS的治療一直是研究的熱點(diǎn)。

筆者前期研究通過(guò)兔耳增生性瘢痕動(dòng)物模型，采用灌胃、外用以及聯(lián)合應(yīng)用ASMq，結(jié)果表明ASMq可以直接抑制成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，降低兔耳增生性瘢痕組織塊的發(fā)生率［4］。并且ASMq對(duì)于體外培養(yǎng)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖具有抑制做用（抑制于G0/G1期），這一作用隨濃度的變化而變化，同時(shí)發(fā)現(xiàn)它能促進(jìn)成纖維細(xì)胞的凋亡［5］。本研究通過(guò)采用不同濃度的ASMq與TGF-β1對(duì)人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的干預(yù)處理，檢測(cè)其對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖，CollagenⅠ及Smad7基因及蛋白表達(dá)的影響，為探索維藥抑制增生性瘢痕的作用機(jī)制及采用維醫(yī)維藥防治增生性瘢痕提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

1　材料和方法

1.1試劑及材料

異常黑膽質(zhì)成熟劑（國(guó)藥準(zhǔn)字：Z65020166）：新疆維吾爾藥業(yè)有限責(zé)任公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、胰酶、PBS緩沖液、青霉素和鏈霉素：美國(guó)Hyclone公司；人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）：美國(guó)Pepro Tech公司；羊抗人CollagenⅠ及Smad7抗體：美國(guó)Santa Cruz公司；CCK-8試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、羊抗人GAPDH抗體：武漢博士德公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒：美國(guó)Thermo公司；BCA蛋白分析試劑盒：美國(guó)Pierce公司；引物設(shè)計(jì)：上海生工公司；Western-Blot系統(tǒng)、PCR擴(kuò)增儀等：美國(guó)Bio-Rad公司，倒置顯微鏡：德國(guó)LEICA公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1ASMq的溶解配制：用DMEM培養(yǎng)基溶解（DMSO輔助溶解并且其在終濃度中的含量不大于0.1%））異常黑膽質(zhì)成熟劑，用含10%FBS的DMEM稀釋為0.2mg/ml、0.4mg/ml，0.6mg/ml、1.0mg/ml。

1.2.2標(biāo)本來(lái)源及鑒定：實(shí)驗(yàn)所用增生性瘢痕組織均來(lái)源于新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院燒傷整形外科，共8例，男5例、女3例，均為漢族，年齡20～39歲，平均28.75歲，均為燒傷愈合后創(chuàng)面瘢痕持續(xù)增生3～12個(gè)月，經(jīng)病理檢查確診為增生性瘢痕，所有患者均無(wú)嚴(yán)重系統(tǒng)性疾病及未經(jīng)過(guò)抗瘢痕藥物治療。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審議通過(guò)，所有提供標(biāo)本患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2.3成纖維細(xì)胞培養(yǎng)及處理：將術(shù)中切取的增生性瘢痕組織于無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)以PBS液漂洗3遍，去除殘留的血液及其他混雜異物，仔細(xì)切除表皮及與之相連的部分瘢痕組織，以防止表皮細(xì)胞混雜。將增生性瘢痕組織修剪成1mm×1mm×1mm的組織塊，均勻接種于培養(yǎng)皿內(nèi)，緩慢加入含體積分?jǐn)?shù)10% FBS及青霉素（100U/ml）和鏈霉素（100μg/ml）的DMEM培養(yǎng)液，于37℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2飽和濕度條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每周換液2次。待組織塊周圍細(xì)胞長(zhǎng)成致密單層后，胰酶消化并傳代培養(yǎng)，選擇3～6代的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。在筆者以下的實(shí)驗(yàn)中成纖維細(xì)胞在加藥干預(yù)前均經(jīng)過(guò)無(wú)血清DMEM 24小時(shí)均一化處理。以下實(shí)驗(yàn)中所涉及的成纖維細(xì)胞均經(jīng)過(guò)加或不加不同濃度ASMq（0.2mg/ml，0.4mg/ml，0.6mg/ml，1.0mg/ml）及濃度為5ng/ml的TGF-β1處理。

1.2.4細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：應(yīng)用CCK-8試劑盒檢測(cè)成纖維細(xì)胞增殖情況。增生性瘢痕來(lái)源成纖維細(xì)胞經(jīng)傳代后取對(duì)數(shù)期細(xì)胞以1×104個(gè)/孔細(xì)胞數(shù)接種于96孔板中，并加入200μl含10%FBS的DMEM培養(yǎng)過(guò)夜，而后經(jīng)過(guò)預(yù)設(shè)方法處理，每組4個(gè)復(fù)孔，連續(xù)檢測(cè)24h、48h、72h各組細(xì)胞增殖情況，在檢測(cè)前4h每孔各加入20μl的CCK-8工作液，于37℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4h后用酶標(biāo)儀讀取各孔在450nm處的吸光值（OD值），求平均值。

1.2.5RT-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)：將成纖維細(xì)胞以4× 105個(gè)接種在10cm培養(yǎng)皿中，經(jīng)預(yù)設(shè)方法干預(yù)24h后應(yīng)用Trizol液裂解細(xì)胞，后經(jīng)氯仿、異丙醇進(jìn)一步提取細(xì)胞的總mRNA，調(diào)整RNA的上樣量為1mg/L，以β-actin為內(nèi)參，進(jìn)行RT-PCR。相關(guān)引物設(shè)計(jì)如下（表1）：CollagenⅠ上游序列：5′-GTGAACCTGGCAAACAAGGT-3′，下游序列：5′-CTTGGTCGGTGGGTGACTCTG-3；Smad7上游序列：5′-TACCCGATGGATTTTCTCAA-3′，下游序列：5′-TCTTCTCCTCCCAGTATGCC-3′；β-actin上游序列：5′-CACCAACTGGGACGACA-3′，下游序列：5′-GTACTTGCGCTCAGGAGG-3′，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA的合成（按照說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行）：合成后的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，方法如下：95℃3min，接著32個(gè)擴(kuò)增循環(huán)：95℃30s、52℃30s、70℃30s，72℃3min；取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物6μL在2%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，而后對(duì)凝膠進(jìn)行圖像采集、分析，應(yīng)用Photoshop CS6讀取灰度值，與β-actin相比，數(shù)值為各組mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1　相關(guān)引物的設(shè)計(jì)

1.2.6Western blot檢測(cè)膠原及Smad7表達(dá)：將成纖維細(xì)胞以2×105個(gè)接種在10cm培養(yǎng)皿中，經(jīng)前述方法干預(yù)48h后收集細(xì)胞，應(yīng)用RIPA裂解液于冰上提取細(xì)胞總蛋白，離心并收集上清，用BCA法蛋白定量后調(diào)整蛋白上樣量并進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，其后應(yīng)用硝酸纖維素膜進(jìn)行濕法轉(zhuǎn)膜，而后用5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗（CollagenⅠ1:300稀釋，Smad7 1:200稀釋，GAPDH 1:400稀釋）4℃孵育過(guò)夜后，應(yīng)用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育2h。然后應(yīng)用BCA蛋白分析試劑盒進(jìn)行二抗顯影，以上每步之間均用TBST液洗5min/3次，利用Quantity One Version4.6.2圖像工作站進(jìn)行圖像采集，應(yīng)用Photoshop CS6讀取灰度值，與GAPDH相比后為各組蛋白表達(dá)相對(duì)值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，各組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)及單因素方法分析，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1ASMq對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞形態(tài)的影響

成纖維細(xì)胞的形態(tài)呈長(zhǎng)梭形有較大的細(xì)胞體，胞質(zhì)較豐富及呈現(xiàn)兩個(gè)或三個(gè)不同突觸長(zhǎng)度的多角度形狀（圖1A）。與對(duì)照組（圖1A）相比，在TGF-β1+ASMq（0.6mg/ml）組（圖1C）和TGF-β1+ASMq（1.0mg/ml）組（圖1D）細(xì)胞數(shù)量減少，形態(tài)逐漸變圓和突觸逐漸變短或消失；TGF-β1組（圖1B）與圖1A相比成纖維細(xì)胞數(shù)量增多，且有較長(zhǎng)的紡錘形結(jié)構(gòu)和最大的胞體。

圖1　ASMq對(duì)成纖維細(xì)胞形態(tài)的影響（DAB×100）

2.2ASMq抑制TGF-β1誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞增殖

通過(guò)CCK-8法檢測(cè)經(jīng)過(guò)ASMq（0.2mg/ml，0.4 mg/ml，0.6mg/ml，1.0mg/ml）與TGF-β1（5ng/ml）處理后24h、48h、72h的成纖維細(xì)胞增殖情況（表2）。與對(duì)照組相比，TGF-β1顯著刺激成纖維細(xì)胞增殖（P＜0.05）；與TGF-β1組相比，不同濃度的ASMq對(duì)于TGF-β1誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞增殖具有抑制作用，這一作用呈時(shí)間濃度依賴性（P＜0.05）；與對(duì)照組相比，ASMq濃度為0.6mg/ml及1.0mg/ml時(shí)顯著抑制成纖維細(xì)胞增殖（P＜0.05）。

2.3ASMq對(duì)成纖維細(xì)胞相關(guān)mRNA水平的影響

RT-PCR檢測(cè)ASMq對(duì)成纖維細(xì)胞CollagenⅠ及Smad7基因表達(dá)的影響。如圖2，TGF-β1能夠顯著刺激增生性瘢痕成纖維細(xì)胞CollagenⅠmRNA和抑制Smad7mRNA的表達(dá)（P＜0.05）。ASMq能夠降低TGF-β1誘導(dǎo)的CollagenⅠmRNA表達(dá)及促進(jìn)Smad7mRNA表達(dá)，且當(dāng)ASMq濃度為0.6mg/ml和1.0mg/ml時(shí)明顯（P＜0.05）。

2.4ASMq對(duì)成纖維細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響

Westernblot檢測(cè)ASMq對(duì)成纖維細(xì)胞CollagenⅠSmad7蛋白表達(dá)的影響。如圖3，TGF-β1能夠顯著刺激增生性瘢痕成纖維細(xì)胞CollagenⅠ表達(dá)和抑制Smad7蛋白表達(dá)（P＜0.05）。ASMq能夠降低TGF-β1誘導(dǎo)的CollagenⅠ表達(dá)及促進(jìn)Smad7表達(dá)，且當(dāng)ASMq濃度為0.6mg/ml和1.0mg/ml時(shí)明顯（P＜0.05）。

表2　ASMq對(duì)TGF-β誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞增殖的影響

圖2　ASMq對(duì)成纖維細(xì)胞膠原和Smad7 mRNA表達(dá)的影響

圖3　ASMq對(duì)成纖維細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響

3　討論

HS是皮膚纖維化過(guò)度的結(jié)果，這一過(guò)程有多種細(xì)胞因子參與其中，TGF-β1是目前已知與HS形成關(guān)系最密切的一種細(xì)胞因子，它的存在能顯著增加成纖維細(xì)胞的增殖及膠原的合成［6-8］。治療方法主要有：手術(shù)切除、放療、激光及藥物，中藥治療一直是研究的重點(diǎn)。維吾爾族醫(yī)藥作為祖國(guó)醫(yī)藥重要的組成部分，而ASMq是維吾爾醫(yī)預(yù)防和治療各種疾病，如腫瘤、肝病、糖尿病、高血壓以及心血管疾病的有效處方，其療效顯著，它由菊苣子、芹菜根、菊苣根、香青蘭子、黑種草子等十余味維藥調(diào)制而成。維醫(yī)實(shí)踐表明，ASMq可以減輕肝纖維化、肺纖維化疾病，而現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為增生性瘢痕為皮膚纖維化疾病，是全身纖維化疾病的一種，但其對(duì)瘢痕的作用機(jī)制一直以來(lái)都不清楚［9-11］。

TGF-β可分為T(mén)GF-β1、TGF-β2、TGF-β3三種亞型，并通過(guò)與受體結(jié)合而發(fā)揮作用.其中TGF-β1在增生性瘢痕形成過(guò)程中尤為重要，其參與了創(chuàng)傷愈合的所有過(guò)程，產(chǎn)生細(xì)胞的趨化性遷移、增生分化、細(xì)胞外基質(zhì)合成及分泌等重要的生物學(xué)效應(yīng)［12-14］。TGF-β1可直接作用于成纖維細(xì)胞，體外低濃度的TGF-β1即可刺激成纖維細(xì)胞合成大量CollagenⅠ和細(xì)胞外基質(zhì)。上述TGF-β1的作用可以通過(guò)激活由Smad介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑完成。然而TGF-β1分泌后必須經(jīng)過(guò)激活才能發(fā)揮效應(yīng)，即必須與其相應(yīng)的受體蛋白TGF-βR相結(jié)合才能發(fā)揮其作用，而目前已知的TGF-βR主要Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三種［15-16］。

Smads蛋白超家族是TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)通路的下游蛋白。它包括3類：①受體調(diào)節(jié)型Smads（receptor-associatedSmads，R-Smad），包括Smad1、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8；②共同通道型Smads（common-mediator Smads，Co-Smad），包括Smad4；③抑制型Smads（inhibitorySmads，ISmad），包括Smad6和Smad7。Smads是一種中介分子，它能夠把TGF-β與其各型受體結(jié)合后產(chǎn)生的信號(hào)從胞質(zhì)傳到細(xì)胞核內(nèi)［15］。TGF-β信號(hào)分子通過(guò)跨膜的、具有絲氨酸-蘇氨酸激酶活性的受體復(fù)合物進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。TGF-β與其受體TβRII結(jié)合后能夠激活TβRI受體，激活的TβRI受體使Smad2、Smad3蛋白磷酸化，磷酸化的Smad2、Smad3蛋白方能與Smad4形成具有生物活性的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)相應(yīng)靶基因的轉(zhuǎn)錄，I-Smads可與R-Smad競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合受體，阻止R-Smad活化或抑制Smads多聚體形成而阻斷TGF-β的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［16-17］。

在筆者的研究中觀察到，TGF-β1組與對(duì)照相比成纖維細(xì)胞的增殖明顯活躍，這一結(jié)果與眾所周知的TGF-β1是成纖維細(xì)胞細(xì)胞功能和增殖的主要調(diào)節(jié)因子相符。而ASMq組與TGF-β1相比較發(fā)現(xiàn)前者細(xì)胞增殖又被顯著抑制，這說(shuō)明ASMq對(duì)于TGF-β1誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖有抑制作用。而在RT-PCR及western blot實(shí)驗(yàn)中筆者看到：TGF-β1能促進(jìn)CollagenⅠ合成，抑制Smad7的表達(dá)；而ASMq降低了TGF-β1對(duì)Smad7合成的抑制作用，而在ASMq干預(yù)下CollagenⅠ合成表達(dá)是顯著降低；由此，筆者推測(cè)ASMq通過(guò)促進(jìn)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中Smad7表達(dá)來(lái)抑制細(xì)胞增殖及CollagenⅠ合成，即通過(guò)促進(jìn)Smad7合成來(lái)抑制TGF-β/Smad通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，降低了成纖維細(xì)胞增殖及CollagenⅠ合成，從而抑制增生性瘢痕的發(fā)生發(fā)展，本研究有助于明確ASMq對(duì)瘢痕作用機(jī)制，為筆者以后的實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)，為維藥開(kāi)展臨床預(yù)防及治療瘢痕提供充分的理論依據(jù)。

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編輯/張惠娟

Effect of uighur medicine abnormal savda munziq on the TGF-β1induced in hypertrophic scar fibroblasts

ZHU Rui-xiang，LI Jia-fu，XU Yan-wen，QIAN-Xuan，MA Shao-lin
（Department of Burns and Plastic Surgery，The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi 830054，Xinjiang，China）

Objective To investigate the effect of uighur medicine abnormal savda munziq on the TGF-β1induced in hypertrophic scar fibroblasts.Methods Using tissue explant cultures of human hypertrophic scar fibroblasts，divided into six group:control group:add an equal volume of culture medium；and experimental group:treated with TGF-β1with or without different concentration of ASMq（0.2 mg/ml，0.4 mg/ml，0.6 mg/ml，1.0mg/ml）.CCK-8 assay was adopted to detect the proliferation of fibroblasts.western blot and RT-PCR were performed to detect the expression of CollagenⅠand Smad7.ResultsASMq reduced the TGF-β1induced in fibroblasts proliferation（P＜0.05）；ASMq down-regulation the fibroblast expression of CollagenⅠmRNA and CollagenⅠinduced by TGF-β1（P＜0.05），In addition，ASMq significantly increased the expression of Smad7 mRNA and Smad7 which was suppressed by TGF-β1（P＜0.05）.Conclusions Our results demonstrate that ASMq blocks the TGF-β/Smad signalling pathway in hypertrophic scar fibroblast by up regulation of Smad7，thereby reducing the proliferation of fibroblasts and synthesis of CollagenⅠ.

abnormal savda munziq；Hyperplastic scar；fibroblasts；TGF-β1

R619+.6

A

1008-6455（2015）11-0042-05

國(guó)家自然科學(xué)基金，維藥異常黑膽質(zhì)成熟劑基于TGF-β/Smad通路防治增生性瘢痕機(jī)制研究（項(xiàng)目編號(hào)：81260291）

馬少林，主任，教授，博士、碩士研究生導(dǎo)師；研究方向：增生性瘢痕防治，組織器官缺損修復(fù)再造；通信地址：新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊市鯉魚(yú)山南路137號(hào)，新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院燒傷整形科，郵編：830054

2015-04-15

2015-06-08