石斑魚肉肽的酶法制備工藝及其抗氧化性

段宙位，謝輝，竇志浩*，何艾，萬祝寧

（海南省農業(yè)科學院農產品加工設計研究所，海南海口571100）

石斑魚肉肽的酶法制備工藝及其抗氧化性

段宙位，謝輝，竇志浩*，何艾，萬祝寧

（海南省農業(yè)科學院農產品加工設計研究所，海南?？?71100）

以冰鮮石斑魚肉為原料，采用堿性蛋白酶酶解的方法制備蛋白肽。以水解度和1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率為評價指標，在單因素試驗的基礎上，運用正交試驗設計優(yōu)化肽的制備工藝；利用DPPH自由基法、2，2’-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2，2’-azinobis（3-ethylbenzothi azoline-6-sulfonic acid）ammonium salt，ABTS）自由基法、羥自由基（·OH）法和鐵氰化鉀還原法評價酶解物的抗氧化性。結果表明：石斑魚肉肽的最佳制備條件為：酶解溫度55℃、酶解pH9、酶用量5000U/g、底物質量濃度8g/100mL、酶解時間5h；石斑魚肉肽酶解物具有較強的抗氧化性，清除DPPH自由基能力、ABTS+·能力、·OH能力和總還原力均隨酶解物質量濃度的增加而增強；酶解物清除DPPH自由基、ABTS+·、·OH的半抑制濃度（IC50）值分別為（1.18±0.26）、（0.89±0.05）mg/mL和（0.35±0.02）mg/mL。關鍵詞：冰鮮石斑魚肉；肽；水解度；清除率；抗氧化

石斑魚屬硬骨魚綱（Osteichthyes）、鱸形目（Perciformes）、鮨科（Serranidae）、石斑魚屬（Epinephelus），為肉食性珊瑚礁魚類［1］。在我國，石斑魚主要分布在海南、廣東、福建等沿海地區(qū)［2］，其肉質細嫩潔白、脂肪含量低、蛋白質含量高，營養(yǎng)價值豐富，有“海雞肉”之稱［3］。近年來由于市場需求量大，石斑魚養(yǎng)殖量迅速增加。據(jù)統(tǒng)計，2013年，海南全省石斑魚產量約為6萬t，約占全國石斑魚養(yǎng)殖產量的60%，居全國第一位。目前，我國對石斑魚的研究多以養(yǎng)殖［4-7］、防治病害［8］、遺傳變異［9］等方面為主，尚未開展對其進行深加工研究，不利于石斑魚經濟價值的提升。石斑魚在養(yǎng)殖、銷售過程中死亡率較高，這些死亡的石斑魚常以冰凍的形式銷售或者丟棄，經濟價值低。研究開發(fā)分子質量小、易吸收的蛋白肽，應用于功能性食品、保健品、化妝品、生物醫(yī)藥領域，具有廣闊的市場前景。

目前，國內外對多肽的研究，按其來源主要分為植物肽與動物肽兩類。植物肽的研究主要集中在豆類、谷類、油料類中蛋白肽的制備及其抗氧化，降血壓、抗疾病、抗衰老等活性［10-12］的評價上。動物肽的研究相對較少，關于魚肉肽的酶法制備及其活性研究更少，主要表現(xiàn)在鰱魚、鳙魚、鯉魚、鱈魚肉肽的制備及其活性的研究上［13-15］。然而，關于石斑魚肉肽的制備及其抗氧化性研究尚未見相關報道。本實驗以冰鮮石斑魚肉為原料，采用酶法制備蛋白肽，同時測定其抗氧化性，以期為石斑魚高值化利用提供理論依據(jù)，促進石斑魚加工業(yè)的發(fā)展。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

冰鮮石斑魚，購于?？谑写鬂櫚l(fā)超市。

堿性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶北京索萊寶科技有限公司；胃蛋白酶、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）美國Sigma公司；2，2’-聯(lián)氮雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2，2’-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS）生工生物工程（上海）股份有限公司；鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、水楊酸、鹽酸、硫酸亞鐵、雙氧水廣州化學試劑廠；其他試劑均為國產分析純。

1.2儀器與設備

CPA225D電子天平德國Sartorius公司；恒溫搖床上海世平實驗設備有限公司；循環(huán)水式真空泵鞏義市予華儀器有限責任公司；TU-1810紫外-可見分光光度計北京普析通用儀器有限責任公司；RE-52AA式旋轉蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器廠。

1.3方法

1.3.1原料預處理

將石斑魚洗凈，去頭、去尾、去皮、去骨、去內臟，搗碎，依次用丙酮、乙醇脫脂，得到石斑魚肉實驗原料（含水率約為81.36%），4℃冷藏，備用。

1.3.2工藝流程

石斑魚→預處理→勻漿→酶解→滅酶→冷卻→離心→取上清液→測定水解度與DPPH自由基清除率→優(yōu)化酶解工藝→制備蛋白肽→測定肽含量→濃縮→干燥→評價抗氧化活性→成品

1.3.3水解度（degree of hydrolysis，DH）的測定

水解后生成的游離—NH2量按甲醛滴定法［8］測定，樣品總氮含量由凱氏定氮法測定。水解度按照下式計算。

式中：N1為水解后生成的氨基氮含量/（mmol/L）；N2為樣品總氮含量/（mmol/L）。

1.3.4DPPH自由基清除能力的測定

［16-17］，略有修改，將石斑魚肉酶解液稀釋1倍，取2mL稀釋溶液，加入2mL6.5×10-5mol/L DPPH溶液，混合后避光反應30min，以95%乙醇調零，在517nm波長處測其吸光度（Ai）；同時測定2mL95%乙醇與2mL樣品稀釋溶液混合后的吸光度（Aj）以及2mL DPPH溶液與2mL95%乙醇混合后的吸光度（A0），DPPH自由基清除率按下式計算。

1.3.5多肽含量的測定

參考魯偉等［18］的方法測定石斑魚肉酶解液多肽含量。

1.3.6最適作用酶的選擇

選擇堿性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶，分別在各酶最適pH值與溫度條件下，酶解石斑魚肉，測定酶解液的水解度及DPPH自由基清除率，確定其最適作用酶。

1.3.7石斑魚肉蛋白肽制備的單因素試驗

1.3.7.1酶解溫度對水解度與DPPH自由基清除率的影響

將石斑魚肉分別置于不同溫度（40、45、50、55、60℃）下，在底物質量濃度10g/100mL、酶用量4000U/g、pH8的條件下酶解5h，考察酶解溫度對水解度與DPPH自由基清除率的影響。

1.3.7.2pH值對水解度與DPPH自由基清除率的影響

將石斑魚肉分別置于不同pH值（7、8、9、10、11）下，在溫度55℃，底物質量濃度10g/100mL、酶用量4000U/g條件下酶解5h，考察酶解pH值對水解度與DPPH自由基清除率的影響。

1.3.7.3酶用量對水解度與DPPH自由基清除率的影響

將石斑魚肉分別置于不同酶用量（2000、3000、4000、5000、6000U/g）反應體系中，在pH9，溫度55℃，底物質量濃度10g/100mL條件下酶解5h，考察酶用量對水解度與DPPH自由基清除率的影響。

1.3.7.4底物質量濃度對水解度與DPPH自由基清除率的影響

將石斑魚肉分別置于不同底物質量濃度（4、6、8、10、12g/100mL）反應體系中，在酶用量4000U/g，pH9，溫度55℃條件下酶解5h，考察底物質量濃度對水解度與DPPH自由基清除率的影響。

1.3.7.5酶解時間對水解度與DPPH自由基清除率的影響

將石斑魚肉置于溫度55℃、pH9、酶用量4000U/g、底物質量濃度8g/100mL條件下，分別酶解3、4、5、6、7h，考察酶解時間對水解度與DPPH自由基清除率的影響。

1.3.8石斑魚肉蛋白肽制備的正交試驗

在單因素試驗的基礎上，運用L9（34）正交表，以水解度與DPPH自由基清除率為評價指標，選擇酶解溫度、pH值、底物質量濃度、酶解時間做四因素三水平試驗，確定石斑魚肉蛋白肽最佳制備工藝。

1.3.9蛋白肽的活性評價

將石斑魚肉肽酶解液濃縮干燥，稀釋成不同質量濃度的樣液，按照DPPH自由基法、ABTS+·法［19］、·OH法［20］與總還原力法［21］評價其抗氧化活性。

2　結果與分析

2.1最適作用酶的選擇由表1可知，不同蛋白酶對石斑魚肉的水解能力、酶解產物的抗氧化活性有著較為明顯的差異。堿性蛋白酶對石斑魚肉的水解能力最強，所得酶解產物清除DPPH自由基的效果最好。這是因為酶具有專一性，不同蛋白酶的作用位點不同，其與底物作用時具有一定的特異性。在不同蛋白酶的作用下，同一蛋白質的水解度、水解產物中多肽長度及結構存在差異，進而影響酶解產物的抗氧化性。因此，選用堿性蛋白酶進行后續(xù)試驗。

表1　不同蛋白酶對水解度與DPPH自由基清除率的影響Table1Effect of different proteases on DH and DPPH radical scavenging rate of hydrolysatessates

2.2單因素試驗

2.2.1酶解溫度對水解度與DPPH自由基清除率的影響

圖1　酶解溫度對石斑魚肉肽水解度與DPPH自由基清除率的影響Fig.1Effect of hydrolysis temperature on DH and DPPH radical scavenging rate of hydrolysates

由圖1可知，當溫度小于55℃時，石斑魚肉蛋白的水解度、DPPH自由基清除率均隨溫度的升高而增加；此后反而下降。這是因為溫度是影響蛋白酶活性的主要因素，每種酶都有其最適溫度，當溫度小于55℃時，低于堿性蛋白酶的最適溫度，隨著溫度的升高，反應速率加快，酶解物還原能力增強，水解度增大，酶解產物中抗氧化肽含量增加，DPPH自由基清除率增大；當溫度高于55℃時，高于堿性蛋白酶的最適溫度，酶活性降低，水解反應速率減慢，水解度減小，酶解產物抗氧化肽含量減少，DPPH自由基清除率減小。因此，酶解溫度選擇55℃左右為宜。

2.2.2pH值對水解度與DPPH自由基清除率的影響

圖2酶解pH值對石斑魚肉肽水解度與DPPH自由基清除率的影響Fig.2Effect of hydrolysis pH on DH and DPPH radical scavenging rate of hydrolysates

由圖2可知，當pH值小于9時，石斑魚肉蛋白的水解度、DPPH自由基清除率均隨pH值升高而增大；此后反而下降。這是因為pH值的變化影響酶與底物結合、酶穩(wěn)定性及產物轉化，進而影響酶的催化效果。pH9的弱堿性環(huán)境有利于堿性蛋白酶與魚肉的反應，pH值過低或過高均會抑制酶的活性，進而影響水解度及肽的抗氧化性。因此，酶解pH值選擇9左右為宜。

2.2.3酶用量對水解度與DPPH自由基清除率的影響

圖3酶用量對石斑魚肉肽水解度與DPPH自由基清除率的影響Fig.3Effect of enzyme dosage on DH and DPPH radical scavenging rate of hydrolysates

由圖3可知，隨著酶用量的增加，水解度、DPPH自由基清除率均先增加后趨于平緩。這主要是因為在底物充足的條件下，增加酶用量可提高底物與酶結合的效率，加快反應速率，使水解度、DPPH自由基清除率增加；當酶用量大于4000U/g時，底物與酶分子結合基本飽和時，使得反應趨于平緩，水解度變化不大，但多余的酶分子可能會降解酶解的長肽鏈，使得短鏈含量增加（一般短鏈肽的活性較長鏈肽的活性高），抗氧化活性增強，清除率增加?？紤]到水解度、DPPH自由基清除率、經濟效益。酶用量選擇4000U/g左右為宜。

2.2.4底物質量濃度對水解度與DPPH自由基清除率的影響

圖4底物質量濃度對石斑魚肉肽水解度與DPPH自由基清除率的影響Fig.4Effect of substrate concentration on DH and DPPH radical scavenging rate of hydrolysates

由圖4可知，隨著底物質量濃度的增加，水解度先緩慢增加后減小，DPPH自由基清除率先快速增加后緩慢增加。這可能是因為底物質量濃度較低時，酶相對過量，酶與底物結合的機率增加，酶能充分發(fā)揮作用，水解度、清除率增加；底物質量濃度較高時，底物分子基本上占據(jù)酶的全部活性部位，酶促反應趨于極限，水解能力降低，水解度減?。坏捎诘孜镔|量濃度較高，水解度的減小，并未影響同體積下抗氧化肽的含量，相反在較大的底物質量濃度下，酶解產物中抗氧化肽的含量略有增加，清除DPPH自由基能力增強，清除率增大。綜合考慮水解度、DPPH自由基清除率及經濟效益，底物質量濃度選擇8g/100mL左右為宜。

2.2.5酶解時間對水解度與DPPH自由基清除率的影響

圖5酶解時間對石斑魚肉肽水解度與DPPH自由基清除率的影響Fig.5Effect of hydrolysis time on DH and DPPH radical scavenging rate of hydrolysates

由圖5可知，當酶解時間小于5h時，隨著酶解時間的延長，水解度、DPPH自由基清除率增加，這主要是因為在水解初始，底物質量濃度較高，水解較快，水解度和DPPH自由基清除率增加；當酶解時間大于5h時，隨著時間的延長，水解度、DPPH自由基清除率趨于平緩，這是因為5h時，酶解反應基本完成，增加酶解時間對水解度與DPPH自由基清除率影響不大。因此酶解時間選擇5h為宜。

2.3正交試驗優(yōu)化結果

在單因素試驗基礎上，選取酶解溫度、酶解pH值、酶用量、底物質量濃度四因素進行正交試驗。由表2可知，各因素對堿性蛋白酶解石斑魚肉蛋白水解效果的影響順序為A＞B＞C＞D，即酶解溫度＞酶解pH值＞酶用量＞底物質量濃度，最優(yōu)水平為A2B2C3D3。各因素對DPPH自由基清除率的影響順序為A＞B＞D＞C，即酶解溫度＞酶解pH值＞底物質量濃度＞酶用量，最優(yōu)水平為A2B2C3D3。由于水解度、DPPH自由基清除率的最優(yōu)水平均為A2B2C3D3，初步確定石斑魚肉蛋白肽的制備工藝為A2B2C3D3。對照正交表，正交試驗9組試驗中沒有A2B2C3D3，按A2B2C3D3條件補加試驗，重復3次取平均值，得石斑魚肉的水解度為12.26%，蛋白肽酶解液（稀釋1倍）對DPPH自由基的清除率為63.35%，優(yōu)于正交表中最好條件A2B2C3D1的結果，最終確定石斑魚肉蛋白肽的制備工藝為A2B2C3D3，即酶解溫度55℃、酶解pH9、酶用量5000U/g、底物質量濃度8g/100mL、酶解時間5h。同時，測得A2B2C3D3條件下石斑魚肉酶解液中多肽含量為10.32mg/mL。

表2正交試驗優(yōu)化設計方案及結果Table2Orthogonal array design and resultssults

2.4石斑魚肉肽酶解物抗氧化活性的測定結果

2.4.1DPPH自由基清除作用

DPPH分子溶液具有典型紫色，在517nm波長處有強吸收，當它與抗氧化物質作用時，生成無色產物，溶液的典型紫色變淺。由圖6可知，石斑魚肉肽酶解物對DPPH自由基具有一定的清除能力，且隨其質量濃度的增加而增強，在低質量濃度實驗范圍內（1.0～2.5mg/mL）服從線性分布y=12.074x+35.708（R2=0.9964）。根據(jù)方程求出石斑魚的半抑制濃度（the half inhibitory concentration，IC50）為（1.18±0.26）mg/mL，抗壞血酸的IC50為（0.0057±0.0004）mg/mL，說明石斑魚肉肽酶解物清除DPPH自由基能力弱于抗壞血酸，這可能是因為石斑魚肉的水解產物是混合物，有些多肽產物的抗氧化性較弱，拮抗作用抑制了其活性。一般認為某種物質的IC50值低于10mg/mL，表明其具有較好的抗氧化性［22］，況且石斑魚肉肽酶解物清除DPPH自由基的能力明顯優(yōu)于馬井喜等［14］制備的鯉魚肽，可見石斑魚肉肽酶解物仍表現(xiàn)出較強清除DPPH自由基能力。

圖6石斑魚肉肽酶解物質量濃度對DPPH自由基清除率的影響Fig.6Effect of hydrolysate concentration on DPPH radical scavenging rate

2.4.2ABTS+·清除作用

ABTS經活性氧氧化后生成穩(wěn)定的藍綠色陽離子自由基ABTS+·，當有抗氧化物質作用時，則會與ABTS+·發(fā)生反應而使反應體系顏色變淺。由圖7可知，隨著其質量濃度的增加，石斑魚肉肽酶解物對ABTS+·的清除率也隨之增大，在實驗質量濃度范圍內服從線性分布y=37.907x+16.254（R2=0.9954），求得其IC50為（0.89±0.05）mg/mL。同樣根據(jù)線性方程，求得抗壞血酸的IC50為（0.0067±0.0004）mg/mL。可見，石斑魚肉肽酶解物具有較強的清除ABTS+·能力，但仍弱于抗壞血酸。2.4.3·OH清除作用

圖7石斑魚肉肽酶解物質量濃度對ABTSABTS+·清除率的影響Fig.7Effect of hydrolysate concentration on ABTS radical scavenging rate

H2O2與Fe2+反應產生·OH，在體系中加入水楊酸捕捉并產生有色物質，該物質在510nm波長處有最大吸收，當它與抗氧化物質作用時，反應體系溶液顏色變淺。由圖8可知，隨著其質量濃度的增加，石斑魚肉肽酶解物對·OH的清除率也隨之增大，在實驗質量濃度范圍內服從線性分布y=40.407x+36.000（R2=0.9852），其IC50值為（0.35±0.02）mg/mL。同樣根據(jù)線性方程，求得抗壞血酸的IC50為（0.15±0.01）mg/mL。可見，石斑魚肉肽酶解物具有較強的清除·OH能力，但仍略弱于抗壞血酸。

圖8石斑魚肉肽酶解物質量濃度對·OH清除率的影響Fig.8Effect of hydrolysate concentration on hydroxyl radical scavenging rate

2.4.4總還原力的測定結果

據(jù)研究報道［23］，可通過測定總還原力來表示抗氧化活性的強弱，吸光度（A700nm）越高，總還原能力越強，抗氧化性越強。由圖9可知，石斑魚肉肽酶解物具有一定的還原能力，隨酶解物質量濃度的增加而增強，在實驗質量濃度范圍內服從線性分布y=0.182x+0.097（R2=0.9886）?？箟难岬目傔€原能力明顯強于石斑魚肽酶解物，但酶解物仍表現(xiàn)出較強的還原力，這與清除DPPH自由基、ABTS+·與·OH表現(xiàn)的抗氧化效果類似。

圖9石斑魚肉肽酶解物質量濃度對總還原力的影響Fig.9Effect of hydrolysate concentration on total reducing power

3　結論

在單因素試驗的基礎上，選擇酶解溫度、pH值、酶用量、底物質量濃度四因素，運用正交試驗設計優(yōu)化石斑魚肉肽的制備工藝。結果表明，堿性蛋白酶制備石斑魚肉肽的最優(yōu)條件為：酶解溫度55℃、酶解pH9、酶用量5000U/g、底物質量濃度8g/100mL、酶解時間5h，此條件下，石斑魚肉的水解度為12.26%，蛋白肽酶解液（稀釋1倍）對DPPH自由基的清除率為63.35%，酶解液中多肽含量為10.32mg/mL。

抗氧化性實驗表明，石斑魚肉肽酶解物具有較強的抗氧化性，清除DPPH自由基、ABTS+·、·OH能力和總還原力均隨酶解物質量濃度增加而增強；酶解物清除DPPH自由基、ABTS+·、·OH的IC50值分別為（1.18±0.26）、（0.89±0.05）、（0.35±0.02）mg/mL。參考文獻：

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Enzymatic Preparation and Antioxidant Activities of Bioactive Peptides from Epinephelus Meat

DUAN Zhouwei，XIE Hui，DOU Zhihao*，HE Ai，WAN Zhuning
（Institute of Processing and Design of Agro-products，Hainan Academy of Agricultural Sciences，Haikou571100，China）

The fresh meat of Epinephelus was hydrolyzed with alkaline protease to prepare peptides.Based on degree of hydrolysis and1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl（DPPH）radical scavenging activity，an orthogonal design combined with single facto experiments was applied to optimize enzymatic hydrolysis conditions for peptide preparation.Antioxidant activities of peptides were evaluated by four different methods，DPPH，2，2’-azinobis（3-ethylbenzothi azoline-6-sulfonic acid）ammonium salt（ABTS）and hydroxyl radical scavenging assays，and potassium ferricyanide reduction method.The results showed that the optimum hydrolysis conditions were55℃，9，5000U/g，8g/100mL and5h for temperature，initial pH，enzyme dosage，substrate concentration and hydrolysis duration，respectively.The antioxidant activity assays showed that the hydrolysates presented strong antioxidant activity.DPPH radical scavenging activity，ABTS radical cavenging activity，hydroxyl radical scavenging activity and potassium ferricyanide reducing power of hydrolyzates from Epinephelus meat were concentration dependent.The half inhibitory concentration（IC50）for DPPH radical scavenging activity，ABTS radical scavenging activity and hydroxyl radical scavenging activity were（1.18±0.26），（0.89±0.05）and（0.35±0.02）mg/mL，respectively.

ice-stored Epinephelus meat；peptides；degree of hydrolysis；scavenging rate；antioxidation

TS218

A

1002-6630（2015）05-0142-06

10.7506/spkx1002-6630-201505027

2014-10-10

2013年海南省農業(yè)科學院農業(yè)科技創(chuàng)新專項；海南省自然科學基金項目（314155）

段宙位（1985—），男，實習研究員，碩士，研究方向為農產品加工。E-mail：universeduan@163.com

竇志浩（1961—），男，研究員，學士，研究方向為農產品加工與保鮮。E-mail：513408658@qq.com