羅格列酮通過抑制RANKL及p-ERK活化抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎破骨細(xì)胞的分化及功能*

韋秀寧，鄭東輝，莫穎倩，馬劍達(dá)，戴冽(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，廣東廣州510120)

羅格列酮通過抑制RANKL及p-ERK活化抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎破骨細(xì)胞的分化及功能*

韋秀寧，鄭東輝，莫穎倩，馬劍達(dá)，戴冽△
(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，廣東廣州510120)

目的:探討羅格列酮(RSG)對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)成纖維樣滑膜細(xì)胞(FLS)介導(dǎo)的破骨細(xì)胞(Oc)分化及功能的影響及其可能機(jī)制。方法:活動(dòng)期RA患者滑膜體外分離培養(yǎng)FLS，與健康人外周血單核細(xì)胞(MNC)共培養(yǎng)，不同濃度RSG(0、5、10和15μmol/L)干預(yù)，抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色鑒定Oc并計(jì)數(shù);甲苯胺藍(lán)染色和圖像分析系統(tǒng)計(jì)算骨吸收陷窩面積;Real-time PCR檢測(cè)共培養(yǎng)體系RANKL和OPG的mRNA表達(dá)，Western blot檢測(cè)RANKL、OPG、p-ERK、p-p38和p-JNK的蛋白含量。結(jié)果:與不加RSG組比較，15μmol/L RSG干預(yù)后Oc的數(shù)量明顯減少(P＜0.01)，骨吸收陷窩面積也減少(P＜0.05);共培養(yǎng)體系RANKL的mRNA及蛋白表達(dá)明顯降低，OPG的mRNA及蛋白表達(dá)明顯升高(P＜0.01);p-ERK的蛋白含量明顯降低(P＜0.05)，p-p38及p-JNK的蛋白含量則不受影響。結(jié)論:RSG通過抑制RANKL及p-ERK活化影響RA關(guān)節(jié)微環(huán)境中組織細(xì)胞與免疫細(xì)胞的相互作用，從而抑制Oc分化及骨吸收功能。

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎;成纖維樣滑膜細(xì)胞;破骨細(xì)胞;核因子κB受體活化因子配體;過氧化物酶體增殖物活化受體γ

［ABSTRACT］AIM:To investigate the effects of rosiglitazone on fibroblast-like synoviocyte(FLS)-induced osteoclastogenesis in rheumatoid arthritis(RA)and the related mechanism.METHODS:RA-FLSwere cocultured with peripheral blood monocytes from healthy volunteers in the presence ofmacrophage colony-stimulating factor(M-CSF)and rosiglitazone.Osteoclasts were assayed by tartrate-resistant acid phosphatase(TRAP)staining.Resorption lacunae area was identified by toluidine blue staining and quantified by image analysis software.ThemRNA expression of RANKL and OPG was evaluated by real-time PCR，and the protein levels of RANKL，OPG，p-ERK，p-p38 and p-JNK weremeasured by Western blot.RESULTS:Compared with controlgroup(without rosiglitazone treatment)，rosiglitazone at concentration of15μmol/L significantly decreased the number of osteoclasts(P＜0.01)and resorption lacunae area(P＜0.05).The expression of RANKL atmRNA and protein levels was significantly down-regulated by rosiglitazone at concentration of 15 μmol/L，while themRNA and protein expression of OPG was up-regulated(P＜0.01).Rosiglitazone(15μmol/L)significantly decreased the protein level of p-ERK(P＜0.05)，but not the protein level of p-p38 or p-JNK(P＞0.05).CONCLUSION:Rosiglitazone inhibits RA-FLS-induced osteoclast formation and its resorption activity by down-regulating RANKL expression and ERK phosphorylation，suggesting that rosiglitazonemay inhibit RA osteoclastogenesis and bone resorption.

［KEY WORDS］Rheumatoid arthritis;Fibroblast-like synoviocytes;Osteoclast;Receptor activator of nuclear factor-κB ligand;Peroxisome proliferator-activated receptorsγ

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種常見的以關(guān)節(jié)破壞為特征的慢性炎癥性自身免疫病?？刂蒲装Y、阻斷關(guān)節(jié)骨破壞是治療RA的目標(biāo)。過氧化物酶體增殖物活化受體(peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR)γ是一類配體依賴性核轉(zhuǎn)錄因子，具有抗炎、抗腫瘤及胰島素增敏等多種功能，在炎癥和免疫反應(yīng)中起重要作用［1］。最新研究發(fā)現(xiàn)巴基斯坦人群中RA患者PPAR基因型Pro12Ala GG表達(dá)率顯著高于健康人群，提示PPARγ基因變異可能與RA發(fā)病相關(guān)［2］?；A(chǔ)及臨床研究已證實(shí)PPARγ活化在RA中具有抗炎作用［3-4］。然而PPARγ對(duì)破骨細(xì)胞(osteoclast，Oc)分化及骨吸收功能的調(diào)控作用尚不明確。國(guó)內(nèi)一項(xiàng)對(duì)198例糖尿病患者的回顧性研究發(fā)現(xiàn)，使用具有上調(diào)PPARγ作用的噻唑烷二酮類藥物2年以上的女性患者骨密度下降幅度顯著高于未用該類藥物的女性患者，而在男性患者中卻出現(xiàn)相反的結(jié)果［5］。因此，本文擬采用共培養(yǎng)體系觀察羅格列酮(rosiglitazone，RSG)對(duì)模擬RA關(guān)節(jié)組織細(xì)胞與免疫細(xì)胞相互作用下成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS)誘導(dǎo)Oc分化及骨吸收過程的影響，探討其對(duì)RA患者Oc分化及骨吸收功能的調(diào)控作用及可能機(jī)制。

材料和方法

1研究對(duì)象及材料

滑膜標(biāo)本來源及對(duì)象:確診活動(dòng)期RA患者細(xì)針滑膜活檢獲取膝關(guān)節(jié)滑膜，RA診斷符合1987年美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)(ACR)修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)或2009年ACR與歐洲風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(EULAR)聯(lián)合修訂的RA分類標(biāo)準(zhǔn)。所有患者均簽署知情同意書，并經(jīng)過我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

鼠抗人波形蛋白(vimentin)單抗和鼠抗人肌酸激酶(creatine kinase，CK)單抗(北京中杉金橋公司);鼠抗人CD3、CD14和CD55單抗(BD);重組人巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)和鼠抗人核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)單抗(R＆D);鼠抗人骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)單抗(Imgenex);兔抗人p-ERK、p-p38及p-JNK單抗(CST);Quant SYBR Green PCR kit(TaKa-Ra);抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)染色試劑盒(Sigma);骨片(Nordic Bioscience);羅格列酮(Biovision)。

2方法

2.2外周血單核細(xì)胞(monocyte，MNC)的分離、純化及鑒定淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法分離健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞，貼壁純化后流式細(xì)胞術(shù)CD14、CD3雙色熒光標(biāo)記抗體檢測(cè)MNC的純度［7］。

2.3CCK-8比色法檢測(cè)RSG對(duì)共培養(yǎng)體系細(xì)胞活性的影響RA-FLS(1×103cells/well)與MNC(3× 105cells/well)在含25μg/L M-CSF、20%胎牛血清及不同濃度RSG(0、5、10和15μmol/L)的α-MEM培養(yǎng)液中共培養(yǎng)，分別于0、1、3、5、7、14和21 d終止培養(yǎng)，加入CCK-8孵育3 h，酶標(biāo)分析儀492 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(A)值，根據(jù)每組各孔測(cè)得的A值計(jì)算出平均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4TRAP染色檢測(cè)RSG對(duì)Oc分化的影響RAFLS與MNC在含25μg/LM-CSF、20%胎牛血清及不同濃度RSG(0、5、10和15μmol/L)的α-MEM培養(yǎng)液中共培養(yǎng)，14 d時(shí)行TRAP染色，按說明書操作，光鏡下觀察結(jié)果并計(jì)數(shù)，TRAP染色陽(yáng)性(胞質(zhì)內(nèi)有均勻的酒紅色顆粒沉積)且細(xì)胞核≥3個(gè)的細(xì)胞為Oc。

2.5骨圓盤法檢測(cè)RSG對(duì)Oc骨吸收功能的影響RA-FLS與MNC在預(yù)置了骨片的96孔板中加入含25μg/L M-CSF、20%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液共培養(yǎng)14 d，第15天始加入不同濃度RSG(0和15 μmol/L)干預(yù)，第21天取出骨片，沖洗干凈后梯度乙醇脫水，1%甲苯胺藍(lán)染色3 min，相差顯微鏡觀察骨吸收陷窩情況，骨吸收陷窩被染為藍(lán)色，呈蟲噬樣，形態(tài)不規(guī)則，邊界清晰。圖像分析系統(tǒng)計(jì)算骨吸收陷窩面積。

2.6Real-time PCR檢測(cè)RSG對(duì)共培養(yǎng)體系RANKL和OPGmRNA的影響RA-FLS與MNC在含25μg/ L M-CSF、20%胎牛血清及不同濃度RSG(0和15 μmol/L)的α-MEM培養(yǎng)液中共培養(yǎng)14 d，提取總RNA，合成cDNA。RANKL的上游引物序列為5’-ACCAGCATCAAAATCCCAAG-3’，下游引物序列為5’-CCCCAAAGTATGTTGCATCC-3’;OPG的上游引物序列為5’-TGCTGTTCCTACAAAGTTTACC-3’，下游引物序列為5’-CTTTGAGTGCTTTAGTGCGTG-3’;β-actin的上游引物序列為5’-GGACTTCGAGCAAGAGATGG-3’，下游引物序列為5’-TGTGTTGGCGTACAGGTCTTTG-3’。PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性95℃30 s;95℃5 s、60℃30 s，擴(kuò)增40～50個(gè)循環(huán)。2－ΔΔCt法計(jì)算RANKL和OPGmRNA相對(duì)表達(dá)量。

2.7Western blot檢測(cè)RSG對(duì)共培養(yǎng)體系RANKL、OPG、p-ERK、p-p38、p-JNK蛋白含量的變化RAFLS與MNC共培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同real-time PCR，14 d后提取總蛋白，10%SDS-PAGE、電轉(zhuǎn)、封閉，分別孵育RANKL(1 mg/L)、OPG(1 mg/L)、β-actin(1∶500稀釋)、p-ERK(1∶2 000稀釋)、p-p38及p-JNK(均為1∶1 000稀釋)I抗和II抗后ECL發(fā)光液化學(xué)發(fā)光，X光顯影。采用Quantity One軟件進(jìn)行掃描定量，取目的蛋白條帶吸光度值(A/mm2)與內(nèi)參照蛋白吸光度值(A/mm2)的比值來表示蛋白的相對(duì)定量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

近些年來，玉米種植區(qū)玉米粗縮病發(fā)病面積一直上升，危害逐年加重，成為玉米生產(chǎn)的主要病害之一。通過近些年對(duì)玉米粗縮病發(fā)生的影響因素做了分析，了解了玉米粗縮病的發(fā)生原因，并找到了防治該病的有效措施。

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。正態(tài)分布資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示;兩組間均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn);多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)或Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，多組間均數(shù)的兩兩比較采用Bonferroni法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1RA-FLS的原代培養(yǎng)及鑒定

光鏡下可見所培養(yǎng)的細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞核呈卵圓形，位于細(xì)胞中央，核仁清晰，電鏡下可見核染色質(zhì)較疏松，呈細(xì)顆粒狀分布在核周圍，核仁明顯，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，胞漿突起長(zhǎng)而粗，胞漿中往往缺乏高爾基復(fù)合體，可見少量小泡和囊泡。呈vimentin+/ CK+/CD68－，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD55+細(xì)胞百分率約(95.34±2.47)%，純度＞95%。

2MNC鑒定

分離的健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞貼壁純化后，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MNC的純度，結(jié)果顯示貼壁細(xì)胞表面CD14+CD3－細(xì)胞比率為93.71%，表明MNC純度＞90%。

3RSG對(duì)共培養(yǎng)體系細(xì)胞活性的影響

不同濃度RSG(0、5、10和15μmol/L)分別干預(yù)RA-FLS與單核細(xì)胞共培養(yǎng)體系0、1、3、5、7、14、21 d，CCK-8法檢測(cè)各組不同時(shí)點(diǎn)的A值，結(jié)果顯示在同一時(shí)點(diǎn)，不同濃度RSG(5、10和15μmol/L)組分別與對(duì)照組相比，A值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示本研究使用的RSG濃度(5、10和15μmol/L)對(duì)共培養(yǎng)體系細(xì)胞無毒性作用，不影響細(xì)胞活性。

4RSG對(duì)RA-FLS誘導(dǎo)的Oc分化的影響

RA-FLS與MNC共培養(yǎng)14 d時(shí)行TRAP染色，0 μmol/LRSG組可見大量TRAP+且核≥3個(gè)的Oc，5、10μmol/L RSG組與0μmol/L RSG組相比Oc數(shù)量無明顯變化，15μmol/L RSG組Oc數(shù)量較0μmol/L RSG組明顯減少(P＜0.01)，見圖1。

Figure 1.The effect of rosiglitazone(RSG)on RA-FLS-induced osteoclastogenesis(TRAP staining，×200).Mean±SD.n=3.△△P＜0.01 vs0μmol/L RSG.圖1　RSG對(duì)RA-FLS誘導(dǎo)的Oc分化的影響

5RSG對(duì)RA-FLS誘導(dǎo)的Oc功能的影響

甲苯胺藍(lán)染色示0、15μmol/L RSG組均見清晰的骨吸收陷窩形成，圖像分析結(jié)果示15μmol/L RSG組骨吸收陷窩面積較0μmol/L RSG組明顯減少(P＜0.05)，見圖2。

6RSG對(duì)共培養(yǎng)體系RANKL和OPG m RNA及蛋白表達(dá)的影響

15μmol/L RSG干預(yù)RA-FLS與MNC共培養(yǎng)體系14 d后，RANKL的mRNA及蛋白表達(dá)較0μmol/ L RSG組明顯降低(P＜0.01)，而OPG的mRNA及蛋白表達(dá)則明顯上調(diào)(P＜0.01)，RANKL/OPG的mRNA及蛋白比率明顯降低(P＜0.01)，見圖3、4。

Figure 2.The effect of rosiglitazone(RSG)on RA-FLS-induced osteoclast function(toluidine blue staining，×200).Mean±SD.n=3.△P＜0.05 vs0μmol/L RSG.圖2　RSG對(duì)RA-FLS誘導(dǎo)的Oc功能的影響

Figure 3.The effect of rosiglitazone(RSG)on RANKL and OPG mRNA expression in RA-FLS and monocyte coculture system.Mean±SD.n=3.△△P＜0.01 vs 0μmol/L RSG.圖3　RSG對(duì)共培養(yǎng)體系RANKL及OPG mRNA表達(dá)的影響

7RSG對(duì)共培養(yǎng)體系絲裂原活化蛋白激酶(m itogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路的影響

RA-FLS與MNC共培養(yǎng)，15μmol/L RSG干預(yù)14 d后，Western blot結(jié)果顯示p-ERK的蛋白含量較0μmol/L RSG組明顯降低(P＜0.05)，p-p38和p-JNK的蛋白含量與0μmol/L RSG組相比無明顯差異(P＞0.05)，見圖5。

討論

RA的本質(zhì)是滑膜炎導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨/骨破壞。在RA關(guān)節(jié)局部組織細(xì)胞和免疫細(xì)胞的相互作用下，滑膜炎增生的滑膜細(xì)胞(如FLS)釋放大量的炎癥介質(zhì)如TNF-α、IL-1及IL-6等，趨化、募集單核/巨噬細(xì)胞至病變關(guān)節(jié)部位，同時(shí)形成局部的炎癥環(huán)境。FLS還可以大量分泌RANKL，與單核/巨噬細(xì)胞表面RANK結(jié)合，經(jīng)受體銜接蛋白腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6介導(dǎo)，激活多條激酶通路，誘導(dǎo)單核/巨噬細(xì)胞活化、增生并最終分化為Oc［7］。其中MARKs在Oc分化及活化中起重要作用，MAPKs(包括ERK、JNK和p38)是調(diào)控RA炎癥與骨破壞重要的信號(hào)通路［8］。抑制MAPKs可明顯降低佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠及膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎小鼠滑膜炎、骨及軟骨破壞［9］。

我們前期的研究發(fā)現(xiàn)RSG可抑制體外分離培養(yǎng)的RA-FLS表達(dá)RANKL，同時(shí)上調(diào)OPG表達(dá)，并且RA-FLS可通過高表達(dá)RANKL、低表達(dá)OPG誘導(dǎo)健康人外周血MNC分化為Oc［7，10］。本研究進(jìn)一步模擬RA關(guān)節(jié)局部組織細(xì)胞與免疫細(xì)胞相互作用的微環(huán)境，將RA-FLS與健康人外周血MNC共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RSG(15μmol/L)能明顯抑制RA-FLS誘導(dǎo)的MNC向Oc分化及骨吸收功能，提示PPARγ配體通過RANKL/OPG系統(tǒng)參與調(diào)控RA關(guān)節(jié)局部Oc分化及骨吸收功能，可能在RA骨破壞機(jī)制中起抑制作用。Cho等［11］報(bào)道RSG可抑制TNF-α、M-CSF及RANKL誘導(dǎo)的小鼠骨髓細(xì)胞向Oc分化及骨吸收功能。Yang等［12］也報(bào)道了RSG和吡格列酮可抑制TNF-α介導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞和小鼠骨髓細(xì)胞分化為Oc。然而，也有相反的報(bào)道。Wan等［13］發(fā)現(xiàn)RSG可促進(jìn)RANKL及M-CSF誘導(dǎo)的小鼠骨髓細(xì)胞或脾細(xì)胞分化為Oc，從而促進(jìn)骨吸收。Stunes等［14］發(fā)現(xiàn)吡格列酮處理4個(gè)月后的卵巢切除大鼠全身及股骨的骨密度及骨質(zhì)量顯著低于未經(jīng)藥物處理的對(duì)照組卵巢切除大鼠。綜合上述不同代謝或免疫微環(huán)境中PPARγ活化對(duì)Oc分化及骨吸收功能的不同作用，我們認(rèn)為免疫微環(huán)境對(duì)PPARγ調(diào)控Oc分化及骨吸收功能具有重要的影響，即在穩(wěn)態(tài)或非炎癥狀態(tài)的微環(huán)境下，PPARγ活化促進(jìn)Oc形成，而在炎癥狀態(tài)下PPARγ活化通過抑制促Oc分化因子(如RANKL、TNF-α及IL-1等)表達(dá)從而抑制Oc分化及骨吸收功能。

Figure 4.The effectof rosiglitazone(RSG)on the protein expression of RANKL and OPG in RA-FLSandmonocyte coculture system.Mean±SD.n=3.△P＜0.05 vs0μmol/L RSG.圖4　RSG對(duì)共培養(yǎng)體系RANKL及OPG蛋白表達(dá)的影響

Figure 5.The effectof rosiglitazone(RSG)on the MAPK pathway in the RA-FLSandmonocyte coculture system.Mean±SD.n=3.△P＜0.05 vs0μmol/L RSG.圖5　RSG對(duì)共培養(yǎng)體系MAPK信號(hào)通路的影響

我們進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在MAPKs信號(hào)通路中，RSG(15μmol/L)能明顯抑制RA-FLS與健康人外周血MNC共培養(yǎng)體系RANKL表達(dá)及p-ERK活化，而對(duì)p-p38及p-JNK無抑制作用，提示RSG可能通過抑制ERK磷酸化抑制RA-FLS誘導(dǎo)的Oc分化及功能。在MAPKs家族中，ERK主要通過影響下游c-Fos以及NFATc1的表達(dá)調(diào)控Oc的分化［15］。最新研究發(fā)現(xiàn)在Oc前體細(xì)胞(骨髓巨噬細(xì)胞)中ERK磷酸化可以促進(jìn)微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)-Ⅰ酯化形成LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ結(jié)合到分泌性溶酶體小體上并促進(jìn)溶酶體往細(xì)胞外釋放組織蛋白酶K，降解骨細(xì)胞外基質(zhì)，破壞骨膠原［16］。結(jié)合本研究中RSG (15μmol/L)組RA-FLS誘導(dǎo)的Oc形成骨吸收陷窩面積較對(duì)照組明顯減少，提示在RA關(guān)節(jié)局部微環(huán)境中PPARγ激動(dòng)劑可能主要通過ERK介導(dǎo)的信號(hào)通路調(diào)控Oc分化及骨吸收功能，這為RA關(guān)節(jié)破壞機(jī)制的研究提供了重要的實(shí)驗(yàn)支持。

總之，我們的研究結(jié)果表明RSG可通過抑制RANKL及p-ERK活化抑制RA-FLS誘導(dǎo)的Oc分化及骨吸收功能，提示RSG可能通過影響RA關(guān)節(jié)微環(huán)境中組織細(xì)胞與免疫細(xì)胞相互作用從而抑制Oc分化及骨吸收功能，最終抑制RA骨破壞，為開發(fā)新的抑制RA關(guān)節(jié)骨破壞藥物提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

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Rosiglitazone inhibits osteoclastogenesis in rheumatoid arthritis by downregulating RANKL expression and suppressing ERK phosphorylation

WEIXiu-ning，ZHENG Dong-hui，MO Ying-qian，MA Jian-da，DAILie
(Department of Rheumatology，Sun Yat-sen Memorial Hospital，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510120，China.E-mail:liedai2004@163.com)

R363.2;R593.22

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2015.05.025

1000-4718(2015)05-0911-06

2014-11-18［修回日期］2015-01-09

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81471597);高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金資助項(xiàng)目(No.20130171110075);廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.2014A030313074)

Tel:020-81332572;E-mail:liedai2004@163.com