燈盞花素對人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和糖尿病大鼠視網(wǎng)膜VEGF表達(dá)的影響*

王競男，楊立群，鄧宇斌△(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，廣東廣州50080;中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院高分子研究所，廣東廣州5075)

燈盞花素對人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和糖尿病大鼠視網(wǎng)膜VEGF表達(dá)的影響*

王競男1，楊立群2，鄧宇斌1△
(1中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，廣東廣州510080;2中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院高分子研究所，廣東廣州510275)

目的:觀察燈盞花素對高糖環(huán)境下人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞株ARPE-19中VEGF、VEGFR2和p-ERK蛋白的表達(dá)及對2型糖尿病大鼠視網(wǎng)膜VEGF表達(dá)的影響。方法:培養(yǎng)ARPE-19細(xì)胞，分為對照組、燈盞花素組、高糖組和高糖+燈盞花素組，ELISA檢測VEGF的分泌水平，Western blot檢測細(xì)胞VEGF、VEGFR2和p-ERK的蛋白水平;取正常大鼠，隨機分為正常對照組、燈盞花素組、糖尿病模型組和糖尿病燈盞花素治療組，16周后取各組大鼠眼球，觀察大鼠視網(wǎng)膜的病理變化并評分，免疫組化觀察VEGF的表達(dá)情況。結(jié)果:(1)細(xì)胞實驗結(jié)果顯示，燈盞花素組VEGF、VEGFR2和p-ERK的蛋白水平與正常對照組比較均減低(P＜0.05);高糖組細(xì)胞上述蛋白水平與正常對照組比較均增加(P＜0.05);高糖+燈盞花素組上述蛋白水平與高糖組比較表達(dá)均減少(P＜0.05); (2)大鼠視網(wǎng)膜病理學(xué)評分顯示糖尿病組與正常對照組、糖尿病燈盞花素治療組相比差異顯著，燈盞花素組與正常對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。糖尿病大鼠與正常對照組、燈盞花素組相比，視網(wǎng)膜VEGF的表達(dá)增加;糖尿病燈盞花素治療組中VEGF的表達(dá)較糖尿病組有所降低(P＜0.05)。結(jié)論:燈盞花素可以降低ARPE-19細(xì)胞VEGF、VEGFR2和p-ERK的蛋白表達(dá)水平，抑制糖尿病大鼠視網(wǎng)膜VEGF的表達(dá)，提示燈盞花素可能通過降低糖尿病大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞和組織中VEGF的表達(dá)，緩解其糖尿病視網(wǎng)膜病變進(jìn)程。

燈盞花素;糖尿病視網(wǎng)膜病;血管內(nèi)皮生長因子

［ABSTRACT］AIM:To evaluate the influence of scutellarin on the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF)in high glucose-treated human retinal pigmentepithelial cell line ARPE-19 and to observe the effects of scutellarin on the protein expression of VEGF，p-ERK and VEGFR2 in the retinas of type II diabetic rats.METHODS:Cultured ARPE-19 cells were divided into normal control group，scutellarin group，high glucose group and high glucose+scutellarin group.The protein levels of VEGF，p-ERK and VEGFR2 weremeasured by Western blot.The VEGF release in ARPE-19 cells was detected by ELISA.Normal ratswere randomly divided into normal control group and scutellarin group.Diabetic ratmodelwas established by feeding with high-fat diet and injecting with streptozocin，and randomly divided into diabetes group and diabetes treated with scutellarin group.After 16 weeks，the eyes were removed.The morphological changes of the retinas were observed under lightmicroscope with HE staining，and histopathological score was recorded.The expression of VEGF in the retinaswas observed by themethod of immunohistochemistry.RESULTS:Compared with normal control group，the protein levels of VEGF，p-ERK and VEGFR2 in the ARPE-19 cells decreased in scutellarin group，but increased in high glucose group.The histopathological score of the retinas showed significant difference among diabetes group，diabetes treated with scutellarin group and normal control group，and no significant difference between normal control group and scutellarin group was observed.The expression of VEGF increased in diabetic group and was significantly higher than that in scutellarin treatmentgroup(P＜0.05).CONCLUSION:Scutellarin inhibits the increased protein levels of VEGF，p-ERK and VEGFR2 in ARPE-19 cells，and decreases the expression of VEGF in the retinas of diabetic rats.The suppression of the diabetic retinopathy development by scutellarin may be partly involved in the ERK/MAPK pathway.

［KEY WORDS］Scutellarin;Diabetic retinopathy;Vascular endothelial growth factors

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabeticretinopathy，DR)是糖尿病引起的最嚴(yán)重的眼部并發(fā)癥，致盲性高［1-2］。多種病理機制參與DR的形成，其中以血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factors，VEGF)為主的促血管生長因子在視網(wǎng)膜中過度表達(dá)是導(dǎo)致DR發(fā)生、發(fā)展的重要因素。糖尿病病理過程中的高糖和缺氧可以誘導(dǎo)視網(wǎng)膜中的視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細(xì)胞異常分泌VEGF，導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，血管滲透性增加，毛細(xì)血管閉塞，從而促進(jìn)視網(wǎng)膜的缺血和新生血管的形成［3-4］。此外，異常分泌的VEGF與其受體(主要是VEGFR2受體)結(jié)合后，激活MAPK/ERK信號通路，參與調(diào)節(jié)血管新生，導(dǎo)致新生血管形成增加，這也被認(rèn)為是DR發(fā)病過程中的重要因素之一［5］。

燈盞花素(scutellarin)是從菊科屬植物短亭飛蓬全草燈盞細(xì)辛中提取的一類黃酮類成分，主要分為燈盞乙素(scutellarin-7-O-glucuronide)和燈盞甲素(apigenin-7-O-glucuronide)(分子結(jié)構(gòu)式見圖1)，具有降低血液黏度、擴張血管、改善微循環(huán)以及抗氧化作用，目前已廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病和腎臟病變等疾病的治療［6-8］。Luo等［9］在2008年發(fā)現(xiàn)燈盞花素可以通過NF-κB通路抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥; Chen等［10］在2006年發(fā)現(xiàn)燈盞花素可以通過抑制fractalkine來緩解缺氧性肺動脈高壓的發(fā)展，但其對VEGF、p-ERK和VEGFR2在RPE細(xì)胞上表達(dá)的影響還沒有報道。

Figure 1.Molecular structure of scutellarin.A:scutellarin-7-O-glucuronide;B:apigenin-7-O-glucuronide.圖1　燈盞花素的分子結(jié)構(gòu)式

在本研究中，我們首先檢測了燈盞花素在高糖環(huán)境下對RPE細(xì)胞株ARPE-19中VEGF、p-ERK和VEGFR2蛋白水平的影響，然后通過燈盞花素治療2型糖尿病模型大鼠，進(jìn)一步探討其在治療DR過程中的機制。

材料和方法

1實驗動物和材料

SPF級健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量200～250 g，由中山大學(xué)實驗動物中心生產(chǎn)供應(yīng)部提供，合格證號為SYXK(粵)2011-0029。

DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(Gibco);VEGF抗體(Abcam);ERK、p-ERK、小鼠抗兔IgG和GAPDH抗體(Cell Signaling);BCA蛋白定量試劑盒(碧云天); VEGF ELISA試劑盒(R＆D);免疫組化試劑盒(中衫金橋);鏈脲菌素(streptozotcin，STZ)購自Sigma;注射用燈盞花素購自四川杰象藥物有限公司。

2方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組人視網(wǎng)膜上皮色素細(xì)胞ARPE-19細(xì)胞株從ATCC購得。培養(yǎng)液為含有10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和1×105U/L鏈霉素的低糖DMEM培養(yǎng)液。細(xì)胞置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。ARPE-19細(xì)胞分為正常對照組、燈盞花素(5μmol/L)組、高糖(25.0 mmol/L葡萄糖)組和高糖+燈盞花素組，作用48 h后，收集細(xì)胞提取蛋白，收集上清，按照VEGF ELISA試劑盒的說明進(jìn)行操作，最后在450 nm處檢測吸光度(A)值。

2.2實驗動物造模、分組和取材SD大鼠購進(jìn)，適應(yīng)環(huán)境1周后，喂以高脂飲食，其中碳水化合物45%，蛋白質(zhì)15%，脂肪40%。高脂飲食喂養(yǎng)2個月后，隨機取20只大鼠，空腹12 h，以0.1%枸櫞酸鹽緩沖液配制2%的STZ溶液，一次性腹腔注射STZ 30 mg/kg，正常對照組和燈盞花素組腹腔注射等體積檸檬酸緩沖液，并繼續(xù)高脂喂養(yǎng)，72 h后尾靜脈取血測血糖，血糖≥16.7 mmol/L者確定為糖尿病。成模當(dāng)天作為實驗開始時間，將糖尿病大鼠隨機分為糖尿病組和糖尿病燈盞花素治療組。燈盞花素組和糖尿病燈盞花素治療組大鼠每日腹腔注射燈盞花素20 mg/kg，每天1次，處理16周，同期正常對照組和糖尿病組大鼠每日注射等量生理鹽水。各組大鼠處理16周后，過量麻醉處死大鼠，迅速摘除眼球，放入4%多聚甲醛溶液中固定，以備HE染色和免疫組化切片。

2.3免疫印跡法檢測細(xì)胞VEGF、VEGFR2和p-ERK的蛋白水平收集細(xì)胞，用冰PBS洗3次，加入細(xì)胞裂解液冰上裂解30 min，4℃15 000×g離心30 min，取上清;BCA法蛋白定量，電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%BSA室溫封閉1 h，I抗(VEGF和VEGFR2為1∶500;p-ERK、ERK和GAPDH為1∶1 000)，4℃孵育過夜，II抗(HRP結(jié)合抗體為1∶1 000)，室溫孵育1 h，暗室孵育發(fā)光液、顯影。

2.4免疫組化方法、結(jié)果判定及病理評分取經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定后的眼球，于鋸齒緣后0.5 mm處剪開眼球壁，去除眼前節(jié)和玻璃體，余下的眼杯行全層石蠟包埋，5μm連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟后和梯度乙醇水化后，進(jìn)行HE和免疫組化染色，VEGF抗體稀釋度為1∶200，DAB顯色時間為5 min，顯色后，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，中性樹膠封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠視網(wǎng)膜組織的病理變化及VEGF陽性細(xì)胞表達(dá)情況。每例標(biāo)本取6張切片，光鏡下每張切片任取5個高倍視野進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，至少計數(shù)100個細(xì)胞，鏡下觀察出細(xì)胞呈棕褐色著色即為陽性表達(dá)細(xì)胞，輸入計算機后用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測定視網(wǎng)膜VEGF陽性著色細(xì)胞個數(shù)，以陽性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比表示陽性表達(dá)程度。

參照Kohno等［11］評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理評分。每例標(biāo)本取6張切片，光鏡下每個切片任取5個高倍鏡視野對視網(wǎng)膜病理改變進(jìn)行評分，計量分析。視網(wǎng)膜病理評分標(biāo)準(zhǔn)為正常記0分;視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞的破壞記1～2分;外核層的破壞記3～4分;內(nèi)核層的破壞記5～6分;神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層破壞記7分。

3統(tǒng)計學(xué)處理

所有實驗均獨立重復(fù)3次，統(tǒng)計學(xué)處理用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，行正態(tài)性分析及方差齊性檢驗，方差齊則行單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1高糖、燈盞花素以及高糖聯(lián)合燈盞花素對ARPE-19細(xì)胞分泌VEGF的影響

與正常對照組相比，高糖引起ARPE-19細(xì)胞分泌VEGF顯著增多，燈盞花素引起ARPE-19細(xì)胞分泌VEGF減少，差異顯著(P＜0.05)。高糖+燈盞花素處理組的細(xì)胞分泌VEGF與單純高糖組相比有所減少，相對于單純高糖組差異都具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見圖2。

Figure 2.Scutellarin(SCU)inhibited the increased release of VEGF induced by high glucose.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs high glucose.圖2　高糖以及燈盞花素對ARPE-19細(xì)胞分泌VEGF的影響

2高糖、燈盞花素以及高糖聯(lián)合燈盞花素對ARPE-19細(xì)胞VEGF、p-ERK和VEGFR2蛋白水平的影響

Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，和正常對照組相比，燈盞花素組的VEGF、p-ERK和VEGFR2蛋白水平均降低;單純高糖組的VEGF、p-ERK和VEGFR2蛋白水平均增加，差異顯著(P＜0.05)。高糖+燈盞花素處理組相對于單純高糖組的VEGF、p-ERK和VEGFR2蛋白水平降低，差異顯著(P＜0.05)，見圖3。

3各組大鼠視網(wǎng)膜病理結(jié)構(gòu)觀察

正常對照組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)界膜完整，表面光滑，各層組織結(jié)構(gòu)清晰;燈盞花素組大鼠視網(wǎng)膜病理結(jié)構(gòu)和正常對照組大鼠無明顯差異;糖尿病組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)界膜增生、紊亂，表面失光滑，血管腔面不規(guī)則擴張，腔內(nèi)可見紅細(xì)胞分布，管壁變薄，可見未突出內(nèi)界膜的新生血管芽;糖尿病燈盞花素處理組視網(wǎng)膜組織病變較糖尿病組輕，但仍然可見擴張不明顯的小血管，見圖4。視網(wǎng)膜病理評分顯示:正常對照組和燈盞花素組病理評分差異不顯著，但正常對照組和糖尿病組、糖尿病燈盞花素處理組病理評分相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);糖尿病組和糖尿病燈盞花素處理組病理評分相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

4各組大鼠視網(wǎng)膜免疫組化檢測VEGF蛋白水平的變化

糖尿病組大鼠視網(wǎng)膜和正常對照組相比，VEGF表達(dá)明顯增加，糖尿病+燈盞花素處理組較糖尿病組的VEGF表達(dá)顯著減少(P＜0.05)，但正常對照組大鼠視網(wǎng)膜和燈盞花素組大鼠視網(wǎng)膜VEGF表達(dá)差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見圖5。

Figure 3.The effects of high glucose and scutellarin(SCU)on the expression of VEGF，VEGFR2 and p-ERK in ARPE-19 cells.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs high glucose.圖3　高糖以及燈盞花素對ARPE-19細(xì)胞VEGF、VEGFR2和p-ERK蛋白表達(dá)水平的影響

Figure 4.The pathological changes and scores of retinas of the diabetic rats treated with scutellarin(SCU).Mean±SEM.n=10.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs diabetes.圖4　各組大鼠視網(wǎng)膜組織的病理變化和評分

Figure 5.The expression of VEGF in the retina of the diabetic rats treated with scutellarin(SCU).Mean±SEM.n=10.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs diabetes.圖5　VEGF在各組大鼠視網(wǎng)膜組織中的表達(dá)

討論

糖尿病視網(wǎng)膜病變是糖尿病常見且不可逆轉(zhuǎn)的最嚴(yán)重的并發(fā)癥，主要引起視網(wǎng)膜微血管系統(tǒng)的損害，毛細(xì)血管腫脹變形，血-視網(wǎng)膜屏障破壞和視網(wǎng)膜新生血管形成［1］。一直以來，高血糖被認(rèn)為是糖尿病視網(wǎng)膜病變的主要因素［12］。在糖尿病環(huán)境下，細(xì)胞內(nèi)外糖濃度升高，末期糖基化產(chǎn)物累積增加，缺氧和氧化應(yīng)激都可以引起RPE細(xì)胞分泌VEGF增多［13］。在DR的發(fā)生發(fā)展過程中，VEGF都是關(guān)鍵性的因子，VEGF可以增加視網(wǎng)膜內(nèi)皮血管滲透性，又可以通過調(diào)控其它細(xì)胞因子，介導(dǎo)視網(wǎng)膜微血管滲漏，造成視網(wǎng)膜水腫;也可以介導(dǎo)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，直接參與血管新生的過程。臨床研究證實DR患者的玻璃體液體中VEGF的含量明顯上升，并且與視網(wǎng)膜新生血管化的進(jìn)程一致［14］，抑制VEGF的產(chǎn)生及其受體的過度表達(dá)可以延緩DR病變的發(fā)生發(fā)展［15］，因此可以抑制VEGF表達(dá)的藥物有望成為糖尿病視網(wǎng)膜病變的有效治療藥物。

燈盞花素是從燈盞花中提取的黃酮類有效成分，包括燈盞乙素和燈盞甲素，可擴張微動脈，減輕白細(xì)胞黏附性，降低血漿黏度，增強組織灌注，改善微循環(huán)代謝，已廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病及腎病等微循環(huán)性疾?。?，10］。

本實驗通過觀察燈盞花素對ARPE-19細(xì)胞和糖尿病大鼠視網(wǎng)膜VEGF表達(dá)的影響，來探討燈盞花素抑制糖尿病視網(wǎng)膜病變的作用機制。通過ELISA檢測各組VEGF的分泌，發(fā)現(xiàn)ARPE-19細(xì)胞在高糖環(huán)境下VEGF的分泌顯著增加，燈盞花素組的細(xì)胞分泌VEGF與正常對照組相比有所減少，高糖+燈盞花素處理組的細(xì)胞分泌VEGF與單純高糖組相比有所減少。VEGF有2種受體(VEGFR1和VEGFR2)，其中VEGFR2，又稱FLK-1，存在于血管和淋巴管內(nèi)皮等處，在生理和病理血管新生中，VEGFR2均是主要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，通過自身磷酸化，觸發(fā)下游一系列信號通路促進(jìn)血管的發(fā)生。VEGF可與VEGFR2結(jié)合，經(jīng)MAPK通路，激活ERK1/2，參與調(diào)解血管新生。Western blot實驗表明，燈盞花素不但抑制正常環(huán)境下ARPE-19細(xì)胞的VEGF過表達(dá)，還可以抑制其受體VEGFR2的表達(dá)及其下游ERK的磷酸化。以上結(jié)果提示燈盞花素在正常環(huán)境下即對ARPE-19細(xì)胞VEGF及其受體VEGFR2下游相關(guān)蛋白即有抑制作用，因此燈盞花素對ARPE-19細(xì)胞VEGF分泌及其受體VEGFR2下游相關(guān)蛋白的作用是否與高糖環(huán)境相關(guān)還有待進(jìn)一步的實驗研究。

大量的研究報道了糖尿病視網(wǎng)膜病變后，視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)增生、紊亂，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹變形，新生小血管增多，新近的研究還發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜組織中的VEGF沉積量與視網(wǎng)膜的病變程度成正比［1，4］。為了進(jìn)一步驗證體外實驗的結(jié)果，我們通過腹腔注射STZ后給予高糖飲食構(gòu)建了大鼠糖尿病模型。HE和免疫組化染色發(fā)現(xiàn)在對照組視網(wǎng)膜中，血管新生增加，表面失光滑，結(jié)構(gòu)紊亂，證實了大鼠糖尿病模型存在嚴(yán)重的視網(wǎng)膜病變。在糖尿病燈盞花素治療組中，燈盞花素可以明顯減輕糖尿病所致的視網(wǎng)膜病變，可以顯著減少VEGF在視網(wǎng)膜中的沉積，并且糖尿病燈盞花素處理組大鼠視網(wǎng)膜的病理評分和糖尿病組大鼠視網(wǎng)膜的病理評分差異顯著，這些結(jié)果提示燈盞花素可能通過降低VEGF的表達(dá)，減少VEGF和VEGFR2的結(jié)合，阻止MAPK通路的激活，從而減少血管的新生，達(dá)到延緩糖尿病視網(wǎng)膜病變進(jìn)程。但燈盞花素組大鼠視網(wǎng)膜和正常對照組大鼠視網(wǎng)膜的病理評分和VEGF沉積量差異并沒有統(tǒng)計學(xué)意義，提示燈盞花素對正常狀態(tài)下大鼠視網(wǎng)膜的影響并不大，與離體細(xì)胞實驗的結(jié)果不完全一致，這究竟是由于人的細(xì)胞與鼠的視網(wǎng)膜組織之間存在種系差異還是由于本實驗中樣本例數(shù)較少，有待進(jìn)一步證實。

總之，上述結(jié)果提示燈盞花素在正常環(huán)境下即對ARPE-19細(xì)胞VEGF及其受體VEGFR2下游相關(guān)蛋白即有抑制作用，但燈盞花素能夠減低糖尿病大鼠視網(wǎng)膜VEGF的含量，延緩糖尿病視網(wǎng)膜病病程，因此其在預(yù)防和治療糖尿病視網(wǎng)膜方面有一定的應(yīng)用前景，對將其應(yīng)用于預(yù)防和治療糖尿病視網(wǎng)膜病變方面還需大量的臨床隨機對照研究才能造福于病人。

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Effect of scutellarin on VEGF expression in human retinal pigment epithelial cells and retinas of diabetic rats

WANG Jing-nan1，YANG Li-qun2，DENG Yu-bin1
(1Research Center of TranslationalMedicine，The First Affiliated Hospital，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510080，China;2Institute of Polymer Science，School of Chemistry and Chemical Engineering，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510275，China.E-mail:dengyub@mail.sysu.edu.cn)

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2015.05.023

1000-4718(2015)05-0900-06

2015-01-08［修回日期］2015-03-11

廣東省教育部產(chǎn)學(xué)研結(jié)合項目(No.2012B091100457)

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