泛素蛋白酶系統(tǒng)通過穩(wěn)定PPARγ調(diào)節(jié)脂肪細胞分化*

唐照，張葉敏，李明欣，汪長華(武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，湖北武漢430071)

泛素蛋白酶系統(tǒng)通過穩(wěn)定PPARγ調(diào)節(jié)脂肪細胞分化*

唐照，張葉敏，李明欣，汪長華△
(武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，湖北武漢430071)

目的:探討泛素蛋白酶系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system，UPS)在體外脂肪細胞分化中的作用。方法:常規(guī)方法誘導(dǎo)前脂肪細胞分化為脂肪細胞，Western blot檢測蛋白質(zhì)表達，免疫共沉淀檢查蛋白質(zhì)間結(jié)合，油紅O染色檢測脂肪細胞中的脂質(zhì)，RT-PCR檢測mRNA表達。結(jié)果:UPS抑制劑硼替佐米可抑制3T3-L1前脂肪細胞分化為脂肪細胞，表現(xiàn)為細胞內(nèi)脂質(zhì)含量降低以及脂肪細胞標志蛋白mRNA表達的降低。蛋白激酶G激動劑西地那非可激活UPS，并增強脂肪細胞的分化。抑制UPS可降低熱休克蛋白90(HSP90)和過氧化物酶體增殖物活化受體γ(PPARγ)間的結(jié)合;同時降低細胞可溶性組分中HSP90和PPARγ的表達，增強其在不可溶性組分中的表達。HSP90特異性的N末端抑制劑格爾德霉素可抑制西地那非促進的PPARγ表達和脂肪細胞的分化。結(jié)論:泛素蛋白酶系統(tǒng)通過HSP90調(diào)節(jié)PPARγ的表達，從而影響脂肪細胞的分化。

泛素蛋白酶系統(tǒng);過氧化物酶體增殖物活化受體γ;熱休克蛋白90;脂肪細胞;細胞分化

［ABSTRACT］AIM:To investigate the role of ubiquitin-proteasome system(UPS)in adipocyte differentiation.METHODS:Differentiation of3T3-L1 preadipocytes into adipocytes was induced by treatmentwith insulin，3-isobutyl-1-methylxanthine and dexamethasone.Western blotand immunoprecipitation were performed to detect the protein abundances and association，respectively.Oil red O staining was used to determine the intracellular lipid of 3T3-L1 adipocytes.The levels ofmRNA weremeasured by reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR).RESULTS:UPS inhibitor bortezomib(BZM)suppressed the differentiation of 3T3-L1 pre-adipocytes，evidenced by reduced intracellular content of triglyceride，and decreased mRNA expression of adipogenicmarker proteins such as adiponectin and adipocyte protein 2.In contrast，administration of sildenafil(SDN)，an activator of protein kinase G which was also found to activate UPS，promoted adipocyte differentiation.In addition，BZM treatment decreased the expression of heat shock protein 90(HSP90)and peroxisome proliferator-activated receptor gamma(PPARγ)in the soluble fraction and reduced association of HSP90 and PPARγ.Furthermore，HSP90-specific N-terminal inhibitor geldanamic mitigated SDN-induced increase in PPARγlevel and 3T3-L1 cell differentiation.CONCLUSION:UPSmodulates HSP90-dependent PPARγstability，thus leading to promotion of adipocyte differentiation.

［KEY WORDS］Ubiquitin-proteasome system;Peroxisome proliferator-activated receptor gamma;Heat shock protein 90;Adipocytes;Cell differentiation

脂肪細胞一般分為白色脂肪細胞和棕色脂肪細胞，前者的主要功能是以甘油三酯(triglyceride，TG)的形式儲存能量，而棕色脂肪的主要功能是消耗能量［1］。近年研究表明:白色脂肪細胞還具有重要的內(nèi)分泌功能，可以分泌多種激素或者脂質(zhì)因子(adipokines)，調(diào)節(jié)體內(nèi)眾多的生理或病理活動［2］。白色脂肪細胞的結(jié)構(gòu)和功能紊亂可引發(fā)肥胖、胰島素抵抗、炎癥，并與多種疾病如糖尿病、腫瘤、心腦血管疾病等的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)［3］。脂肪細胞的分化對脂肪細胞的結(jié)構(gòu)和功能變化具有重大影響［4］。因此，探討脂肪細胞分化的詳細機制、研究其調(diào)節(jié)因素，尤其是白色脂肪向棕色脂肪的轉(zhuǎn)化機制已成為具有廣闊應(yīng)用前景的研究新領(lǐng)域［4］。

泛素蛋白酶系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system，UPS)和細胞自噬是細胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的2種主要方式，參與了脂肪細胞分化的調(diào)節(jié)。研究已經(jīng)證實，白色脂肪細胞的分化早期有細胞自噬的參與［5］，而脂肪細胞的衰老與UPS活性的變化和脂肪細胞的分化具有密切關(guān)系［6］。然而，UPS在調(diào)節(jié)白色脂肪細胞分化中的具體作用和詳細機制仍不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，UPS是白色脂肪細胞分化所必需的，UPS通過調(diào)節(jié)熱休克蛋白90(heat shock protein 90，HSP90)與過氧化物酶體增殖物活化受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ)結(jié)合，從而影響PPARγ的表達水平，并由此調(diào)節(jié)脂肪細胞的分化。

材料和方法

1材料與試劑

抗綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)、PPARγ和HSP90的抗體(CST);抗tubulin抗體、堿性磷酸酶和辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗(Santa Cruz);胰島素、地塞米松和3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX)為Sigma產(chǎn)品;泛素蛋白酶系統(tǒng)抑制劑硼替佐米(bortezomib)、HSP90特異性的N末端抑制劑格爾德霉素(geldanamycin，GA)和蛋白激酶G(protein kinase G，PKG)激動劑西地那非(sildenafil，SDN)均購自Calbiochem;蛋白A瓊脂糖珠(Protein-A Agarose)為Amersham-Pharmacia Biotech產(chǎn)品。

2細胞培養(yǎng)與脂肪細胞分化

3T3-L1前脂肪細胞購自ATCC，并按要求培養(yǎng)于含10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、1%青霉素/鏈霉素(penicillin/streptomycin，P/S)的DMEM中。脂肪細胞的分化按文獻方法進行［7-8］，基本步驟如下:100%匯合的3T3-L1前脂肪細胞繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)3 d;然后，采用含1μmol/L地塞米松、0.5 mmol/ L IBMX、1.67μmol/L胰島素和10%FBS的DMEM，以及含0.41μmol/L胰島素和10%FBS的DMEM先后誘導(dǎo)分化各3 d;其后，誘導(dǎo)分化的細胞培養(yǎng)于常規(guī)培養(yǎng)液中。誘導(dǎo)分化10 d后，90%以上的前脂肪細胞將分化為脂肪細胞，并可用于實驗。

3主要實驗方法

2.1 風險識別。要實現(xiàn)對風險進行有效的預(yù)防前提是要對風險進行識別，風險識別是利用有效的系統(tǒng)、經(jīng)驗的技術(shù)手段和科學(xué)的方法對事故發(fā)生前各種風險的大小、風險存在的原因進行全面、聯(lián)系分析的過程。風險識別包括分析風險的關(guān)鍵環(huán)節(jié)、風險的事故種類和風險的控制重點等。

3.1油紅(oil red)O染色誘導(dǎo)分化10 d后的細胞用磷酸鹽緩沖生理鹽水(phosphate buffered saline，PBS)洗滌3次、4%的多聚甲醛固定20 min、PBS漂洗3次、油紅O染料染色30 min，最后用去離子水除去未結(jié)合的染料［8］。

3.2TG的測定甘油三酯定量試劑盒購自Abcam，測定方法按試劑盒說明書進行。

3.3細胞病毒感染融合泛素蛋白酶系統(tǒng)作用底物的綠色熒光蛋白GFPu用于反向報告活體細胞內(nèi)UPS的功能活性［9］。為使培養(yǎng)細胞過度表達GFPu，細胞分別與攜帶GFPu的重組腺病毒Ad/GFPu和攜帶β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，β-Gal)對照腺病毒Ad/β-Gal(均由美國南達科他大學(xué)醫(yī)學(xué)院汪學(xué)軍教授贈送)在無血清條件下共同培養(yǎng)6 h(MOI=100)，然后更換為常規(guī)培養(yǎng)液。48 h后分組實驗。

3.4RT-PCR實驗按本實驗室已報告的方法進行［2］，采用TRIzol試劑提取細胞總RNA，通過酶促反應(yīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第1鏈和第2鏈。小鼠脂聯(lián)素的上游引物為5’-CCCAAGGGAACTTGTGCAGGTTGGATG-3’，下游引物為5’-GTTGGTATCATGGAAGAGAAGAAA-3’;小鼠脂肪細胞蛋白2(adipocyte protein 2，aP2)的上游引物為5’-GCGTAAATGGGGATTTGGTC-3’，下游引物為5’-CTCCTGTCGTCTGCGGTGATT-3’;小鼠GAPDH的上游引物為5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’，下游引物為5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。擴增條件為94℃5 min;94℃1 min，62℃1min，72℃1 min，共30個循環(huán);72℃10 min。瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴增產(chǎn)物，凝膠成像系統(tǒng)分析目的基因與GAPDH條帶的相對吸光度值。

3.5可溶組分和非可溶組分分離細胞溶解于含5 mmol/L EDTA、1 mmol/L PMSF、2%Triton X-100以及蛋白酶抑制劑的PBS(pH 7.4)緩沖液中，冰上孵育30 min，漩渦混勻10 min，14 000×g、4℃離心20 min，轉(zhuǎn)移上清至新的試管中，此為細胞可溶性組分。沉淀物加入一定量的SDS-PAGE上樣緩沖液，漩渦混勻20 min，100℃煮沸5 min，14 000×g室溫離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液至新的試管中，即為細胞的非可溶性組分。

3.6免疫共沉淀與蛋白免疫印跡實驗結(jié)束后，立即將細胞用4℃預(yù)冷的PBS洗滌3次。細胞裂解液(含50 mmol/L Hepes，150 mmol/L NaCl，1%Triton X-100，10 mmol/L NaF，20 mmol/L sodium pyrophosphate，20 mmol/Lβ-glycerol phosphate，1 mmol/L sodium orthovanadate，10 mg/L leupeptin，10 mg/L aprotinin和1 mmol/L phenylmethanesulfonyl fluoride)裂解細胞，冰浴10 min，14 000×g、4℃離心10 min，Bradford法定量蛋白濃度，并調(diào)整各勻漿蛋白濃度一致。為進行免疫沉淀，細胞提取液與結(jié)合有特異性抗體的蛋白A瓊脂糖珠4℃共同孵育16 h，沉淀物用50 mmol/L HEPES緩沖液洗滌3次，最后加入2× SDS-PAGE上樣緩沖液95℃加熱5 min分離蛋白與瓊脂糖珠。為進行蛋白免疫印跡，細胞裂解液與等體積的2×SDS-PAGE上樣緩沖液混合，95℃水浴5min，離心取上清行SDS-PAGE。蛋白免疫印跡的基本流程如下:恒壓100 V電泳，100 V、140 min電轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜，5%脫脂牛奶封阻1 h，Ⅰ抗4℃孵育過夜，Ⅱ抗室溫孵育1 h，ECL顯色，VersaDoc Imaging System(Bio-Rad)獲得并分析結(jié)果。

4統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差(Mean±SD)表示，計量數(shù)據(jù)資料按Student t檢驗，計數(shù)數(shù)據(jù)按χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。所有實驗至少重復(fù)3次以上。

結(jié)果

1泛素蛋白酶系統(tǒng)功能不足可抑制3T3-L1前脂肪細胞分化

硼替佐米(bortezomib，BZM)是一種有效的UPS抑制劑，為獲得其有效抑制脂肪細胞UPS功能的作用濃度，過度表達GFPu的3T3-L1前脂肪細胞分別接受5 nmol/L、10 nmol/L和20 nmol/L的BZM處理6 h。10 nmol/L和20 nmol/L濃度的BZM可有效提高GFPu的蛋白表達，表明該濃度BZM可抑制前脂肪細胞的UPS功能。為探討UPS功能對脂肪細胞分化的影響，3T3-L1前脂肪細胞在誘導(dǎo)分化期間的前3 d，持續(xù)接受10 nmol/L的BZM處理。結(jié)果表明，BZM處理顯著降低脂肪細胞中脂質(zhì)和TG的含量;脂肪細胞標志蛋白aP2和脂聯(lián)素的mRNA表達水平也顯著降低，見圖1。這些結(jié)果表明:UPS功能抑制可抑制脂肪細胞的分化。

Figure 1.Bortezomib(BZM)suppressed the differentiation of 3T3-L1 pre-adipocytes.A:the effect of BZM on GFPu expression in 3T3-L1 pre-adipocytes;B:representative images of oil red O staining of adipocytes(×200);C:the effectof BZM on TG levels of adipocytes;D:the effect of BZM onmRNA levels of Adip and aP2 in adipocytes.GFPu:green fluorescence protein(GFP)family of ubiquitin-proteasome system reporters;TG:triglyceride;Adip:adiponectin;aP2:adipocyte protein 2.Mean±SD.n=6.＊＊P＜0.01 vs DMSO.圖1　硼替佐米抑制3T3-L1前脂肪細胞的分化

2泛素蛋白酶系統(tǒng)功能激活可促進3T3-L1前脂肪細胞的分化

SDN可通過調(diào)節(jié)PKG而激活UPS［9］。20μmol/ L的SDN處理6 h可明顯降低3T3-L1前脂肪細胞中GFPu的表達，且該作用可以被BZM處理逆轉(zhuǎn)，表明SDN可促進脂肪細胞UPS的功能。已有文獻報道: SDN具有促進脂肪細胞分化的作用［10］。為研究SDN是否經(jīng)激活UPS而誘導(dǎo)脂肪細胞的分化，3T3-L1前脂肪細胞在分化誘導(dǎo)期間，同時接受20μmol/ L的SDN和/或10 nmol/L的BZM處理6 d。結(jié)果發(fā)現(xiàn):BZM可抑制SDN誘導(dǎo)的脂質(zhì)和TG在細胞內(nèi)的聚集;同時也可抑制SDN誘導(dǎo)的aP2和脂聯(lián)素mRNA表達增加，見圖2。這表明激活UPS可促進脂肪細胞的分化。

Figure 2.Sildenafil(SDN)promoted the differentiation of3T3-L1 pre-adipocytes.A:the effect of sildenafil on GFPu expression in 3T3-L1 pre-adipocytes;B:representative images of oil red O staining of adipocytes(×200);C:the effect of sildenafil on TG levels of adipocytes;D:the effect of sildenafil on mRNA levels of Adip and aP2 in adipocytes.GFPu:green fluorescence protein(GFP)family of ubiquitin-proteasome system reporters;BZM:bortezomib;TG:triglyceride;Adip:adiponectin;aP2:adipocyte protein 2.Mean±SD.n=6.＊＊P＜0.01 vs DMSO;##P＜0.01 vs SDN.圖2　西地那非促進3T3-L1前脂肪細胞的分化

3泛素蛋白酶系統(tǒng)調(diào)節(jié)PPARγ的表達

PPARγ在脂肪細胞的分化中具有關(guān)鍵作用［11］。為研究UPS活性對PPARγ表達的可能影響，分化誘導(dǎo)期第3天的3T3-L1前脂肪細胞接受10 nmol/L的BZM處理6 h。結(jié)果發(fā)現(xiàn):BZM處理可降低細胞可溶組分中PPARγ的表達，而增加其在非可溶性組分中的表達，提示BZM可影響PPARγ的穩(wěn)定性。本實驗結(jié)果同時發(fā)現(xiàn):HSP90在可溶組分和非可溶組分中的表達模式與PPARγ表達相一致;此外，BZM處理明顯降低PPARγ與HSP90間的結(jié)合，見圖3。這些結(jié)果表明:HSP90在介導(dǎo)BZM穩(wěn)定PPARγ的表達中具有重要作用。

Figure 3.Bortezomib(BZM)decreased PPARγexpression in soluble fraction.NIg:normal IgG;IP:immunoprecipitation.Mean± SD.n=4.＊＊P＜0.01 vs DMSO.圖3　硼替佐米降低細胞可溶組分中PPARγ的表達

4HSP90參與泛素蛋白酶系統(tǒng)對脂肪細胞分化的調(diào)節(jié)

為闡明HSP90在介導(dǎo)UPS誘導(dǎo)脂肪細胞分化中的作用，3T3-L1前脂肪細胞誘導(dǎo)分化期間，同時接受20μmol/L的SDN和(或)20 nmol/L的HSP90特異性的N末端抑制劑GA處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GA可抑制SDN誘導(dǎo)的脂質(zhì)和TG在細胞內(nèi)的聚集;抑制SDN誘導(dǎo)的aP2和脂聯(lián)素mRNA表達的增加。同時，GA抑制了SDN所致的PPARγ表達的增加，見圖4。這些結(jié)果表明HSP90具有穩(wěn)定PPARγ表達的作用，并由此介導(dǎo)UPS對脂肪細胞分化的影響。

Figure 4.Geldanamycin(GA)attenuated sildenafil(SDN)-induced differentiation of 3T3-L1 pre-adipocytes.A:oil red O staining for observing the effectofGA on SDN-induced differentiation of3T3-L1 pre-adipocytes(×200);B:the effectofGA on TG expression in SDN-treated 3T3-L1 adipocytes;C:the effectof GA onmRNA levels of Adip and aP2 in SDN-treated 3T3-L1 adipocytes;D:the effects of SDN and GA on the expression of HSP90 and PPARγ.Mean±SD.n=6.＊＊P＜0.01 vs DMSO;##P＜0.01 vs SDN.圖4　格爾德霉素降低西地那非誘導(dǎo)的3T3-L1前脂肪細胞的分化

討論

UPS已被證明在晶狀體細胞的分化中起到重要作用［12］。在脂肪細胞中，蛋白酶功能的降低足以抑制脂肪細胞的分化，增加成熟脂肪細胞的氧化張力，影響脂肪細胞的衰老［6］。與這些研究結(jié)果相一致，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn):在分化誘導(dǎo)期間，抑制UPS功能可阻礙脂肪細胞的分化;與此相反，誘導(dǎo)分化期間刺激UPS活性可促進脂肪細胞的分化，表明正常UPS功能是脂肪細胞分化所必需的。

PPARγ是影響脂肪細胞分化的重要因子，參與調(diào)節(jié)脂肪形成、能量平衡以及脂質(zhì)生物合成［13］。在脂肪細胞分化的過程中，轉(zhuǎn)錄因子PPARγ通過激活其下游的靶基因，如CCAAT/增強子結(jié)合蛋白家族等而決定脂肪的生成和脂肪細胞的分化。眾多離體和在體的研究表明:激活PPARγ將刺激脂肪的生成和脂肪細胞的分化;而該因子的缺乏或活性的降低將導(dǎo)致相反的結(jié)果［13］。本研究發(fā)現(xiàn):抑制UPS降低了細胞可溶性組分中PPARγ的含量，而增加了非可溶性組分中PPARγ含量。由于蛋白的可溶性是保障蛋白正常功能的基礎(chǔ)，而位于非可溶性組分中的蛋白易于被降解，因此本實驗結(jié)果提示UPS可能是通過調(diào)節(jié)PPARγ的水平而影響脂肪細胞的分化。

一般認為，PPARγ是UPS的作用底物。在一定條件下，處于增殖期的前脂肪細胞和成熟脂肪細胞中PPARγ可通過UPS介導(dǎo)降解［14］，而處于分化期的脂肪細胞中PPARγ表達相對穩(wěn)定［5，15］。存在的問題是:何種機制導(dǎo)致分化期脂肪細胞中的PPARγ處于穩(wěn)定狀態(tài)?蛋白質(zhì)降解的主要方法包括UPS、細胞脂嗜、蛋白酶途徑等。其中，UPS的主要功能是清除細胞內(nèi)錯誤折疊或未折疊蛋白，保持細胞內(nèi)正常的蛋白平衡。分子伴侶HSP90具有穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)和功能的作用，可與PPARs類蛋白結(jié)合，并影響PPARs的正常折疊、穩(wěn)定性和活性。例如，HSP90抑制PPARα和PPARβ的活性，但并不影響PPARα的穩(wěn)定性和PPARγ的活性［15］。在3T3-L1細胞中，PPARγ的穩(wěn)定主要受HSP90的保護［15］。HSP90通過與PPARγ結(jié)合保持了PPARγ的可溶性，避免其存在于非可溶組分中而被蛋白酶體降解［15］。當UPS被抑制時，泛素偶聯(lián)蛋白與HSP90的結(jié)合體出現(xiàn)在不可溶的組分中，由此增加泛素偶聯(lián)蛋白的不穩(wěn)定性。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn):在脂肪細胞分化期，抑制UPS功能降低了HSP90與PPARγ的結(jié)合、降低了細胞可溶性組分中PPARγ和HSP90的含量、增加了非可溶性組分中PPARγ和HSP90的含量，表明UPS功能降低可增加PPARγ的不穩(wěn)定性，從而增強了PPARγ被其它非UPS途徑降解的可能。另一方面，抑制HSP90將破壞HSP90-PPARγ的結(jié)合，觸發(fā)PPARγ的不穩(wěn)定性［15］。在本研究中表現(xiàn)為:HSP90特異性抑制劑GA降低SDN誘導(dǎo)的PPARγ蛋白量的增加，并由此阻止3T3-L1前脂肪細胞的分化。因此，適當提高UPS活性可維持分化中的脂肪細胞正常的蛋白平衡，減輕應(yīng)激，增加PPARγ與HSP90結(jié)合，提高PPARγ的穩(wěn)定性，刺激脂肪細胞的分化。

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Ubiquitin-proteasome system regulates adipogenic differentiation by stabilizing HSP90-dependent PPARγ

TANG Zhao，ZHANG Ye-min，LIMing-xin，WANG Chang-hua
(Department of Pathophysiology，Wuhan University School of Basic Medical Sciences，Wuhan 430071，China.E-mail: chwang0525@whu.edu.cn)

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2015.05.021

1000-4718(2015)05-0888-06

2014-12-02［修回日期］2015-01-26

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.30770758/H0178)

Tel:027-68759846;E-mail:chwang0525@wuh.edu.cn