大鼠原代肝星狀細(xì)胞活化后組蛋白修飾水平的觀察*

田甜，張金娟，羅新華，謝汝佳，韓冰，楊婷，陳騰祥，楊勤(貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，貴州貴陽(yáng)550000)

大鼠原代肝星狀細(xì)胞活化后組蛋白修飾水平的觀察*

田甜，張金娟，羅新華，謝汝佳，韓冰，楊婷，陳騰祥，楊勤△
(貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，貴州貴陽(yáng)550000)

目的:觀察體外培養(yǎng)大鼠肝星狀細(xì)胞(HSCs)活化過(guò)程中組蛋白修飾的改變以及與HSCs活化指標(biāo)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)的關(guān)系，探討組蛋白修飾在HSCs活化過(guò)程中可能的作用。方法:體外分離、鑒定、培養(yǎng)大鼠HSCs，光鏡觀察HSCs活化過(guò)程中的形態(tài)變化，細(xì)胞免疫熒光染色和Western blotting檢測(cè)desmin和α-SMA的表達(dá)，比較靜止型HSCs和激活型HSCs中H4K12乙?；3K9乙?；3K4二甲基化和H3K9二甲基化的變化。結(jié)果:(1)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果表明HSCs在培養(yǎng)過(guò)程中形態(tài)由靜息狀態(tài)向高度分化的肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化。細(xì)胞免疫熒光染色及Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，分離培養(yǎng)24 h的HSCs有desmin表達(dá)，但幾乎不表達(dá)α-SMA;隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，HSCs內(nèi)α-SMA和desmin表達(dá)逐步增加，至15 d時(shí)達(dá)到最大。(2)根據(jù)HSCs細(xì)胞形態(tài)變化及HSCs活化標(biāo)志蛋白檢測(cè)結(jié)果，確定培養(yǎng)24 h的HSCs為靜止型HSCs，培養(yǎng)15 d的HSCs為激活型HSCs，分別檢測(cè)其組蛋白修飾變化。結(jié)果顯示，與靜止型HSCs比較，激活型HSCs中H4K12乙?；?、H3K9乙?；虷3K9二甲基化修飾水平明顯降低(P＜0.01)，而H3K4二甲基化修飾水平明顯增加(P＜0.01)，且H3K4二甲基化修飾水平變化與α-SMA表達(dá)變化一致。結(jié)論:在體外培養(yǎng)HSCs活化過(guò)程中，組蛋白修飾發(fā)生明顯異常，提示組蛋白修飾改變有可能參與了HSCs活化以及肝纖維化的發(fā)生。

肝星狀細(xì)胞;組蛋白修飾;肝纖維化

［KEY WORDS］Hepatic stellate cells;Histonemodifications;Liver fibrosis

近年來(lái)研究表明，肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSCs)的激活是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)，HSCs自分泌的多種細(xì)胞因子作用于HSCs表面的受體，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，不斷刺激HSCs自身分裂增殖，并大量合成和分泌膠原等細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)在肝內(nèi)沉積，最終導(dǎo)致肝纖維化［1］。表觀遺傳是不通過(guò)DNA序列改變就能影響基因表達(dá)的、可遺傳的調(diào)控方式，包括DNA甲基化、微小RNA(microRNA，miRNA)和組蛋白修飾等。近來(lái)有研究提示，表觀遺傳機(jī)制在肝星狀細(xì)胞激活過(guò)程中可能起重要調(diào)控作用。Chen等［2］研究發(fā)現(xiàn)，大鼠HSCs由靜止?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)為活化狀態(tài)后miR-335和miR-150表達(dá)發(fā)生顯著下調(diào)，而miR-143、miR-145和miR-121卻明顯上調(diào)，認(rèn)為這些在肝纖維化進(jìn)程中差異表達(dá)的miRNA可靶向調(diào)控HSCs活化增殖相關(guān)的細(xì)胞因子或蛋白，調(diào)控HSCs的活化增殖，進(jìn)而參與肝纖維化發(fā)生發(fā)展。Bian等［3］的研究發(fā)現(xiàn)PTEN基因高甲基化可激活PI3K/AKT與ERK通路來(lái)參與HSCs的活化及肝纖維化的形成。然而，組蛋白修飾作為表觀遺傳的一個(gè)重要內(nèi)容，其是否參與HSCs活化及ECM產(chǎn)生的調(diào)控，目前仍不清楚。組蛋白修飾主要包括乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等，其中以組蛋白的乙?；图谆芯孔疃?。這些修飾可作為一種標(biāo)記或語(yǔ)言組成“組蛋白密碼”，被一系列特定的蛋白質(zhì)所識(shí)別，并將其轉(zhuǎn)譯成一種特定的染色質(zhì)狀態(tài)以實(shí)現(xiàn)對(duì)特定基因的調(diào)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)擬分離培養(yǎng)大鼠原代HSCs，觀察HSCs在活化前后組蛋白修飾4個(gè)位點(diǎn)水平變化，了解在HSCs激活過(guò)程中組蛋白修飾的變化以及與HSCs產(chǎn)生的ECM的相關(guān)性，以探討組蛋白修飾在HSCs活化中可能的作用及與肝纖維化發(fā)生的關(guān)系。

材料和方法

1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)雄性Wistar大鼠，體重400～500 g，由貴州省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證編號(hào)為(黔)2003-001。

2主要試劑

DNaseⅠ購(gòu)自Solarbio;IV型膠原酶購(gòu)自Sigma; Opetiprep密度梯度離心液購(gòu)自Axis-Shield;DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自HyClone;胎牛血清購(gòu)自Gibco;強(qiáng)細(xì)胞裂解液、蛋白酶抑制劑、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、兔抗H3K9me2、兔抗H3K4me2、Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)以及DyLight 549標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;鼠抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)單抗購(gòu)自Santa Cruz;兔抗desmin、兔抗acH4K12、兔抗acH3K9和兔抗GAPDH抗體購(gòu)自Bioworld。

3主要方法

3.1原代HSCs的分離和培養(yǎng)大鼠HSCs的分離參考戴春蕾等［4］的方法。細(xì)胞分離后，用臺(tái)盼藍(lán)染色鑒定細(xì)胞活率。以含20%胎牛血清及雙抗的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×1010/L，接種于6 cm無(wú)包被塑料培養(yǎng)皿和激光共聚焦皿中，置于5% CO2、37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種24 h后首次換液，以后每2～3 d換1次液。并于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

通過(guò)上述方法分析得出，3階模態(tài)的振型圖是獨(dú)立的，表5顯示與其他模態(tài)置信度相比很低，所以其為真實(shí)模態(tài)。1階模態(tài)與2階模態(tài)的頻率接近，二者振型圖為對(duì)稱2點(diǎn)間的上下振動(dòng)。4階與5階模態(tài)的頻率接近，振型圖均為邊緣彎曲振動(dòng)。6階模態(tài)與7階模態(tài)的頻率接近，振型圖為內(nèi)部的扭轉(zhuǎn)振動(dòng)。對(duì)比MAC值，發(fā)現(xiàn)第1階模態(tài)與第2階模態(tài)的置信度很高，確認(rèn)二者為重根模態(tài)。分析4階與5階模態(tài)為密集模態(tài)或重根模態(tài)，進(jìn)行二級(jí)驗(yàn)證。

3.2細(xì)胞免疫熒光法觀察HSCs中desmin和α-SMA的表達(dá)吸棄激光共聚焦皿內(nèi)培養(yǎng)液，PBS清洗，4%多聚甲醛固定，3%BSA封閉1 h，滴加1∶50稀釋的兔抗desmin抗體(或1∶50稀釋鼠抗α-SMA)，4℃孵育過(guò)夜，加入1∶200稀釋的Alexa Fluor 488標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(H+L)［或1∶100稀釋的DyLight549標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)］，室溫孵育2 h，PBS洗滌后DAPI染核，在激光共聚焦顯微鏡下觀察。

3.3Western blotting檢測(cè)HSCs中α-SMA、desmin、acH4K12、acH3K9、H3K9me2以及H3K4me2的修飾水平吸棄培養(yǎng)液，預(yù)冷PBS洗滌后以細(xì)胞裂解液冰上裂解細(xì)胞，高速離心后收集上清，BCA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞總蛋白。蛋白定量后進(jìn)行加樣，上樣量為40μg，行12%SDS-PAGE分離蛋白，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，含5%脫脂奶粉的TBST封閉，分別加入1∶1 000稀釋的鼠抗α-SMA抗體、1∶1 000稀釋兔抗desmin抗體、1∶500稀釋兔抗acH4K12抗體、1∶500稀釋兔抗acH3K9抗體、1∶1 000稀釋兔抗H3K9me2抗體、1∶1 000稀釋H3K4me2抗體和1∶10 000稀釋的GAPDH抗體，4℃過(guò)夜。次日TBST洗膜，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗室溫孵育1 h，TBST洗膜，ECL顯示特異條帶。GAPDH抗體作為內(nèi)參照。利用GeneTools圖像分析軟件對(duì)每個(gè)條帶灰度進(jìn)行定量分析。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理。兩組樣本均數(shù)比較采用兩個(gè)獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1分離HSCs的得率、存活率及純度

光鏡下計(jì)數(shù)分離得到的HSCs，臺(tái)盼藍(lán)染色判斷細(xì)胞存活率。結(jié)果顯示，每只大鼠肝臟分離純化后HSCs的細(xì)胞得率約為4.0×107，細(xì)胞存活率為95%。以desmin免疫熒光染色顯示原代HSCs結(jié)果表明陽(yáng)性率為96%，見圖1。

Figure 1.Desmin expression in HSCs at24 h observed by immunofluorescence(×200).圖1　細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)desm in在培養(yǎng)24 h的HSCs中的表達(dá)

2體外培養(yǎng)過(guò)程中大鼠原代HSCs的形態(tài)變化

鏡下觀察剛分離的HSCs呈折光性很強(qiáng)的圓球形，培養(yǎng)24 h后細(xì)胞基本貼壁，胞質(zhì)內(nèi)含大量折光性強(qiáng)的顆粒。隨培養(yǎng)時(shí)間增加，細(xì)胞逐漸伸展，培養(yǎng)3 d時(shí)細(xì)胞體較大，胞質(zhì)內(nèi)含較多折光性強(qiáng)顆粒，開始伸出偽足。第5～10天細(xì)胞內(nèi)折光性強(qiáng)的顆粒逐漸減少，細(xì)胞繼續(xù)伸展，開始融合成片。第15天時(shí)，細(xì)胞內(nèi)折光性強(qiáng)顆粒明顯減少，絕大多數(shù)細(xì)胞呈典型星形，梭形，融合成片，見圖2。

Figure 2.Themorphological changes of HSCs isolated from rats during the culture(×200).圖2　不同培養(yǎng)時(shí)間大鼠肝星狀細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

3體外培養(yǎng)HSCs過(guò)程中α-SMA和desm in免疫熒光染色

分別用黃色熒光和綠色熒光標(biāo)記desmin和α-SMA蛋白，在激光共聚焦顯微鏡下觀察可見:分離培養(yǎng)24 h的HSCs中有desmin陽(yáng)性表達(dá)，而幾乎沒有α-SMA陽(yáng)性表達(dá);分離培養(yǎng)3 d后的HSCs desmin陽(yáng)性表達(dá)逐漸增多(＞90%)，并可見較多α-SMA陽(yáng)性表達(dá)(＞85%);隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，HSCs中desmin及α-SMA陽(yáng)性明顯增多，至培養(yǎng)15 d時(shí)幾乎所有的HSCs中都有desmin和α-SMA陽(yáng)性表達(dá)(＞98%)，且在細(xì)胞中可見細(xì)胞骨架呈典型的肌絲狀條紋，見圖3、4。

Figure 3.The expression ofα-SMA in the HSCs cultured at different time points observed by immunofluorescence(×200).圖3　α-SMA在不同培養(yǎng)時(shí)間的HSCs中的免疫熒光觀察

4Western blotting檢測(cè)HSCs培養(yǎng)過(guò)程中α-SMA和desm in蛋白的表達(dá)

Western blotting結(jié)果顯示，在HSCs分離培養(yǎng)的不同時(shí)期都有desmin蛋白表達(dá)，且desmin蛋白表達(dá)量隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而增加。分離培養(yǎng)24 h的HSCs基本不表達(dá)α-SMA，培養(yǎng)3 d后的HSCs開始表達(dá)α-SMA，且α-SMA的表達(dá)隨培養(yǎng)時(shí)間增加逐漸增加，至15 d時(shí)α-SMA的表達(dá)量達(dá)到最大，見圖5。

Figure 4.The expression of desmin in the HSCs cultured at different time points observed by immunofluorescence(×200).圖4　Desm in在不同培養(yǎng)時(shí)間的HSCs中的免疫熒光

Figure 5.The expression ofα-SMA and desmin in the HSCs cultured at different time points detected by Western blotting.Mean± SD.n=5.*P＜0.05 vs24 h.圖5　α-SMA和desm in在不同培養(yǎng)時(shí)間的HSCs中的表達(dá)

5Western blotting檢測(cè)培養(yǎng)24 h HSCs和培養(yǎng)15 d的HSCs中組蛋白acH4K12、acH3K9、H3K9me2和H3K 4m e2修飾水平

根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)desmin及α-SMA蛋白表達(dá)情況分別將培養(yǎng)24 h、3 d和15 d HSCs視為靜止HSCs、部分活化HSCs和完全活化HSCs。我們選取培養(yǎng)24 h HSCs(靜止HSCs)和培養(yǎng)15 d HSCs(激活HSCs)作為研究對(duì)象，用Western blotting檢測(cè)其組蛋白修飾情況。結(jié)果顯示，培養(yǎng)15 d HSCs中H4K12和H3K9乙酰化修飾水平明顯較培養(yǎng)24 h HSCs降低(P＜0.01)。進(jìn)一步檢測(cè)HSCs細(xì)胞中組蛋白甲基化水平的結(jié)果顯示，與培養(yǎng)24 h HSCs相比，培養(yǎng)15 d的HSCs中H3K4二甲基化水平明顯增高，組蛋白H3K9甲基化水平明顯減低(P＜0.01)，見圖6。

Figure 6.The expression of acH4K12，acH3K9，H3K9me2 and H3K4me2 in 24 h HSCs and 15 d HSCs isolated from the rats.Mean ±SD.n=5.*P＜0.01 vs24 h HSCs.圖6　靜止型和激活型HSCs中acH4K12、acH3K 9、H3K 9me2和H3K4me2的修飾水平

討論

肝星狀細(xì)胞位于肝竇內(nèi)皮與肝細(xì)胞之間的Disse間隙內(nèi)，呈典型的樹突狀突起星芒狀結(jié)構(gòu)，以表達(dá)desmin等間質(zhì)標(biāo)記為特征［5］。在生理狀態(tài)下，HSCs呈靜止?fàn)顟B(tài)，其主要功能是儲(chǔ)存和代謝維生素A，合成和分泌少量ECM，但不表達(dá)α-SMA。當(dāng)各種因素造成肝細(xì)胞損傷時(shí)，在肝細(xì)胞和其它非實(shí)質(zhì)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子作用下，HSCs形態(tài)由星狀變成梭形，脂滴消失，變成肌成纖維樣細(xì)胞，表達(dá)α-SMA，轉(zhuǎn)變成為激活型HSCs，后者產(chǎn)生大量ECM在肝臟內(nèi)沉積，形成肝纖維化。有研究發(fā)現(xiàn)，在無(wú)包被的塑料培養(yǎng)皿上培養(yǎng)靜止型HSCs，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，靜止型HSCs可發(fā)生自發(fā)活化，其形態(tài)變化及標(biāo)志物表達(dá)的改變與體內(nèi)肝纖維化發(fā)生過(guò)程中HSCs變化相似［6］。靜止型的HSCs不表達(dá)α-SMA，故α-SMA被認(rèn)為是HSCs活化的標(biāo)志，其表達(dá)量的大小可用來(lái)衡量HSCs激活程度，也可以反映活化HSCs分泌ECM量［7］。

本實(shí)驗(yàn)采用體外膠原酶循環(huán)灌注結(jié)合密度梯度離心法分離得到原代HSCs后，在鏡下觀察到剛分離的HSCs呈圓球形，培養(yǎng)24 h后細(xì)胞基本貼壁，胞質(zhì)內(nèi)含大量折光性強(qiáng)的顆粒;隨培養(yǎng)時(shí)間增加，細(xì)胞逐漸伸展，培養(yǎng)3 d時(shí)開始伸出偽足，培養(yǎng)5～10 d時(shí)細(xì)胞繼續(xù)伸展，胞內(nèi)折光性強(qiáng)的顆粒逐漸減少，培養(yǎng)第15天時(shí)，絕大多數(shù)細(xì)胞呈典型星形，梭形，融合成片。這與文獻(xiàn)報(bào)道中HSCs形態(tài)變化相符。我們通過(guò)細(xì)胞免疫熒光染色和Western blotting分別對(duì)不同培養(yǎng)時(shí)間的HSCs細(xì)胞內(nèi)desmin和α-SMA表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，以期對(duì)分離得到的細(xì)胞進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示，分離培養(yǎng)24 h的HSCs細(xì)胞表達(dá)desmin但不表達(dá)α-SMA，分離培養(yǎng)3 d的HSCs細(xì)胞持續(xù)表達(dá)desmin并開始表達(dá)一定量的α-SMA，而培養(yǎng)15 d的HSCs細(xì)胞顯示高表達(dá)desmin和α-SMA，且在細(xì)胞內(nèi)可見細(xì)胞骨架呈明顯肌絲樣條紋，其形態(tài)學(xué)變化及細(xì)胞活化標(biāo)志物變化與既往文獻(xiàn)報(bào)道一致，由此我們初步認(rèn)定分離培養(yǎng)24 h HSCs細(xì)胞為靜止型HSCs，分離培養(yǎng)3 d的HSCs為部分活化型HSCs，而培養(yǎng)15 d的HSCs為完全激活型HSCs。鑒于本文主要研究研究HSCs由靜止型轉(zhuǎn)變?yōu)榧せ钚秃蠼M蛋白修飾變化，故選用培養(yǎng)24 h HSCs和15 d HSCs作為研究對(duì)象。

組蛋白修飾是表觀遺傳學(xué)的重要組成部分。有關(guān)肝纖維化的表觀遺傳學(xué)研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)DNA甲基化和微小RNA都參與HSCs激活的調(diào)控，推測(cè)組蛋白修飾有可能也參與其中。組蛋白有多種共價(jià)修飾方式，其中H3K9乙?；?、H4K12乙酰化、H3K4me2和H3K9me2是修飾基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要機(jī)制［8］。一般認(rèn)為組蛋白乙?；揎椫泻推浒被速嚢彼釟埢恼姾?，削弱了組蛋白與DNA的接觸，DNA易于解聚，染色質(zhì)呈轉(zhuǎn)錄活性結(jié)構(gòu)，進(jìn)而激活基因轉(zhuǎn)錄。組蛋白乙?；癄顟B(tài)受組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶和組蛋白去乙?；刚{(diào)控，取決于兩者的動(dòng)態(tài)平衡［9］。有研究發(fā)現(xiàn)H3K4me2使組蛋白和DNA結(jié)構(gòu)由緊變松，靶基因才能和轉(zhuǎn)錄復(fù)合物相互作用而得以轉(zhuǎn)錄［10］。還有研究認(rèn)為H3K9me2能使組蛋白形成一個(gè)異染色質(zhì)蛋白1(heterochromatin protein 1)結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致DNA分子上特定CpG島的甲基化而使基因沉默［11］。不同組蛋白修飾可依次發(fā)揮作用或組合在一起，形成一個(gè)修飾的級(jí)聯(lián)，通過(guò)協(xié)同或拮抗來(lái)共同發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。我們對(duì)靜止型HSCs與激活型HSCs acH4K12、acH3K9、H3K9me2及H3K4me2觀察的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，分離培養(yǎng)15 d(激活型)HSCs中H4K12乙?；捷^培養(yǎng)24 h(靜止型)HSCs明顯降低，這一結(jié)果與Qin等［12］發(fā)現(xiàn)大鼠HSCs培養(yǎng)活化過(guò)程中H4K12乙?；街饾u減少的研究結(jié)果一致。此外Qin等［12］還發(fā)現(xiàn)肝纖維化大鼠MMP13基因啟動(dòng)子區(qū)H4總乙?；揭彩菧p少的，認(rèn)為MMP13基因H4總乙?；浇档蜁?huì)抑制MMP13基因的轉(zhuǎn)錄，以致沒有足夠的MMP13蛋白來(lái)降解ECM，導(dǎo)致ECM在肝內(nèi)沉積是最終引起肝纖維化的根本原因。我們還發(fā)現(xiàn)激活型HSCs中H3K9乙?；揭草^靜止型HSCs為低，但α-SMA的表達(dá)卻較靜止型HSCs明顯增加。結(jié)合我們實(shí)驗(yàn)室及其他學(xué)者以往的研究發(fā)現(xiàn)在肝纖維化大鼠肝臟HSCs活化增殖的同時(shí)伴有肝臟MMP-1等基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)增加，細(xì)胞外基質(zhì)成分明顯增多的結(jié)果［13］，我們推測(cè)激活型HSCs中H4K12乙?；浇档陀锌赡軈⑴c膠原代謝相關(guān)酶基因調(diào)控而參與肝纖維化的發(fā)生。有學(xué)者用去乙酰化酶抑制劑拉格唑拉處理大鼠原代激活型HSCs后，發(fā)現(xiàn)伴隨著組蛋白3和組蛋白4的總乙?；矫黠@增加，而HSCs中α-SMA、Ⅰ型膠原和TIMP-1的表達(dá)明顯降低［14］，表現(xiàn)出抗肝纖維化效應(yīng)的結(jié)果也進(jìn)一步支持我們的推測(cè)。有關(guān)激活型HSCs中H4K12乙?；礁淖?nèi)绾握{(diào)控膠原代謝相關(guān)酶基因的機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

在本研究中我們還發(fā)現(xiàn)激活的HSCs中H3K4me2水平增加和H3K9me2水平減少，表明在HSCs活化過(guò)程中存在組蛋白H3K4me2和H3K9me2修飾改變。有研究發(fā)現(xiàn)在肝硬化患者肝組織中H3K4me2的去甲基化轉(zhuǎn)移酶RBP2和α-SMA表達(dá)上調(diào)，通過(guò)沉默LX-2 HSCs中RBP2基因后發(fā)現(xiàn)α-SMA表達(dá)下調(diào)同時(shí)HSCs增殖抑制，過(guò)表達(dá)LX-2 HSCs中RBP2基因后發(fā)現(xiàn)α-SMA的表達(dá)上調(diào)，因此認(rèn)為RBP2調(diào)控了肝硬化患者肝臟中α-SMA的表達(dá)，從而參與肝硬化的病理過(guò)程［15］。由此我們認(rèn)為激活型HSCs中H3K4me2修飾改變與α-SMA表達(dá)上調(diào)及肝纖維化發(fā)生可能存在某種聯(lián)系。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在正常腦組織中存在H3K4me2修飾，而在星形細(xì)胞瘤中H3K4me2修飾水平增加，且隨星形細(xì)胞瘤病理分級(jí)的增高而增高［16］，提示H3K4me2修飾可能是星形細(xì)胞增殖的一個(gè)標(biāo)志。因此，我們推測(cè)在激活的HSCs中發(fā)現(xiàn)的H3K4me2修飾水平的改變也可能是HSCs活化增殖的一個(gè)標(biāo)志，可成為判斷肝纖維化進(jìn)展的一個(gè)指標(biāo)。

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Levels of histonemodifications in activated primarily cultured rat hepatic stellate cells

TIAN Tian，ZHANG Jin-juan，LUO Xin-hua，XIE Ru-jia，HAN Bing，YANG Ting，CHEN Teng-xiang，YANG Qin
(Department of Pathophysiology，Guiyang Medical University，Guiyang 550000，China.E-mail:qinyang@gmc.edu.cn)

R329.2+1

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2015.05.018

1000-4718(2015)05-0871-06

2014-10-24［修回日期］2015-02-05

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81160064);貴州省科技廳聯(lián)合基金［黔科合LG字(2012)023號(hào)］

Tel:0851-6908489;E-mail:qinyang@gmc.edu.cn