二氮嗪后處理對(duì)離體大鼠心功能及線粒體心磷脂的影響*

段忠心，劉興奎，喻田(遵義醫(yī)學(xué)院麻醉系，貴州遵義563003;南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院麻醉科，湖南衡陽(yáng)400)

二氮嗪后處理對(duì)離體大鼠心功能及線粒體心磷脂的影響*

段忠心1，2，劉興奎1△，喻田1
(1遵義醫(yī)學(xué)院麻醉系，貴州遵義563003;2南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院麻醉科，湖南衡陽(yáng)421001)

目的:建立離體大鼠心肌缺血/再灌注損傷模型，觀察二氮嗪(diazoxide，D)后處理對(duì)缺血/再灌注損傷離體大鼠心功能及線粒體心磷脂的影響，并探討ATP敏感性鉀通道在二氮嗪后處理心肌保護(hù)中的作用。方法:采用Langendorff裝置建立離體大鼠心肌缺血/再灌注損傷模型，將SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(control)、缺血再灌注模型組(I/R)、二氮嗪后處理組(I/R+D)、5-羥葵酸拮抗二氮嗪后處理組(I/R+5-HD+D)，每組8只，均先灌注平衡20 min。Control組:灌注平衡后續(xù)灌70 min;I/R組:缺血前灌注4℃ST.Thomas停跳液，全心缺血40 min，再灌30min;I/R+D組:全心缺血40min，缺血后給予含二氮嗪(50μmol/L)的K-H液灌注5min后，再灌25min;I/R +5-HD+D組:二氮嗪后處理前給予含5-羥葵酸(100μmol/L)的K-H液灌注5 min，再灌20 min。觀察各組續(xù)(再)灌注末心率、冠脈流出液量、心功能、心肌酶學(xué)及心肌線粒體心磷脂的變化。結(jié)果:各組續(xù)(再)灌注末比較，I/R組較control組及I/R+D組心率減慢、冠脈流出液量降低，心功能明顯受損，心肌酶增加，心磷酯含量減少，但與I/R+5-HD+D無(wú)明顯差異。結(jié)論:二氮嗪后處理通過(guò)增加線粒體心磷脂含量，減少心肌酶的釋放，改善心臟功能，減輕心肌的再灌注損傷，產(chǎn)生心肌保護(hù)作用。5-羥葵酸能夠完全阻斷二氮嗪的心肌保護(hù)作用。

心磷脂;二氮嗪;缺血/再灌注損傷

［ABSTRACT］AIM:To investigate the effect of diazoxide(D)postconditioning on Cardiac function and mitochondrial cardiolipin in isolated rat heart and to explore the protective effect of ATP sensitive potassium channel on diazoxide postconditioningmyocardium.METHODS:The myocardial ischemia/reperfusion injury model in isolated rat hearts was established by Langendorff apparatus.The isolated rat hearts were randomized into 4 groups(n=8):control group (control)，myocardial ischemia/reperfusion injury group(I/R)，diazoxide postconditioning group(I/R+D)，5-hydroxy decanoic acid(5-HD)plus diazoxide postconditioning group(I/R+5-HD+D).The hearts in each group were started with 20min perfusion for equilibration.The hearts in controlgroup perfused for70min;The hearts in I/R group was global ischemia for 40min after ischemia reperfusion at4℃ST.Thomas cardioplegia，then reperfusion for30min;The hearts in I/R+D group were treated with diazoxide(50μmol/L)in K-H perfusion for5 min after global ischemia for40 min，then reperfusion for 25 min;The hearts in I/R+5-HD+D group were treated with 5-HD(100μmol/L)in K-H perfusion for 5 min before diazoxide postconditioning，then reperfusion for 20 min.The heart rate，coronary outflow volume，heart function，myocardial enzymes and myocardialmitochondrial cardiolipin at the end of perfusion in each group were determined.RESULTS:Compared with control group and I/R+D group，the heart rate，the concentration of heart phospholipid and the coronary outflow volume were reduced，the heart function was significantly impaired the contents ofmyocardial enzymes were increased in I/R group.However，no significant difference between I/R group and I/R+5-HD+D group was ob-served.CONCLUSION:The diazoxide postconditioning protects the myocardium by increasing mitochondrial cardiolipin content，reducing the release ofmyocardial enzymes，improving heart function and reducingmyocardial reperfusion injury.Themyocardial protective effect of diazoxide is completely blocked by 5-hydroxy decanoic acid.

［KEY WORDS］Cardiolipin;Diazoxide;Ischemia/reperfusion injury

心肌線粒體內(nèi)膜富含磷脂，作為膜磷脂雙層分子的基本結(jié)構(gòu)之一，心肌缺血/再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IRI)時(shí)含量明顯減少，與心臟IRI有著密切的聯(lián)系。Zhao等［1］在研究中發(fā)現(xiàn)并首先提出了缺血后處理(ischemic post-conditioning，IPO)可明顯減輕IRI。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究［2］表明，IPO通過(guò)激活線粒體ATP敏感性鉀通道(mitoKATP)通道來(lái)保護(hù)心肌線粒體，從而產(chǎn)生心肌保護(hù)。隨后有大量研究證實(shí)IRI與mitoKATP有關(guān)［3］。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察二氮嗪(diazoxide，D)后處理對(duì)離體大鼠IRI線粒體心磷脂(cardiolipin，CL)的影響，探討二氮嗪后處理對(duì)心肌的保護(hù)機(jī)制。

材料和方法

1動(dòng)物與實(shí)驗(yàn)材料

健康清潔級(jí)雄性SD大鼠32只，16～20周齡，體重250～350 g，由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為4組:對(duì)照組(control)、缺血再灌注模型組(I/R)、二氮嗪后處理組(I/R+D)、5-羥基癸酸(5-hydroxydecanoic acid，5-HD)拮抗二氮嗪后處理組(I/R+5-HD+D)。

二氮嗪、CL及5-HD(Sigma);Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所);肌酸激酶(creatine kinase，CK)試劑盒及乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)試劑盒(南京建成生物技術(shù)研究所)。Langendorff離體心臟灌注裝置(PanLab);Powerlab/8SP實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)(AD Instrument);內(nèi)切式高速均質(zhì)器(IKA);HP-1100系列高效色譜分析儀(Agilent);色譜柱(編號(hào)C18B081203，中科院大連化物所)。其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純和色譜純。

2方法

2.1離體大鼠心臟模型的建立腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)、肝素(250 U/kg)，麻醉后迅速劍突下沿著肋緣剪開(kāi)腹壁，打開(kāi)膈肌，沿著兩側(cè)腋前線剪開(kāi)胸壁并上翻頭側(cè)，保留主動(dòng)脈3～4 mm于心臟根部剪下心臟，立即放入預(yù)冷的K-H液(4℃)，輕輕擠壓心臟洗清殘留血液。液面下主動(dòng)脈插管，固定置于Langendorff灌注管口。用37℃預(yù)先氧平衡的KH液心臟逆行灌注(灌注壓力75～85 mmHg)，心臟跳動(dòng)后于左心耳剪一小口，將帶有乳膠水囊的測(cè)壓管經(jīng)二尖瓣插入左心室，連接Powerlab/8SP生物機(jī)能試驗(yàn)壓力換能器系統(tǒng)，調(diào)節(jié)水囊使LVEDP為4～8 mmHg。上述步驟均在2 min內(nèi)完成。離體心臟用37℃的K-H液平衡灌注20 min，平衡后心率(heart rate，HR)＞250 min－1、左室收縮壓(left ventricular systolic pressure，LVSP)＞85 mmHg、室性早搏＜2 min－1者納入實(shí)驗(yàn)，未達(dá)條件者舍棄。

2.2灌注方案Control組平衡20 min后，續(xù)灌70 min;I/R組平衡20 min，灌注4℃ST.Thomas停跳液10 mL/kg，常溫下停跳后中斷灌注40 min，再次灌注37℃含氧的K-H液30 min;I/R+D組于缺血后主動(dòng)脈分別逆灌含二氮嗪(50μmol/L)的K-H液5 min、37℃含氧的K-H液25 min;I/R+5-HD+D組于缺血后主動(dòng)脈分別逆灌含5-HD(100μmol/L)的K-H液持續(xù)5 min、含二氮嗪(50μmol/L)的K-H液5 min，再灌注37℃的K-H液20 min。

2.3心臟功能數(shù)據(jù)采集于續(xù)灌末或再灌注末采集心臟功能參數(shù)。記錄HR、左心室舒張末壓(left ventricular end diastolic pressure，LVEDP)及左心室最高收縮壓(left ventricular peak systolic pressure，LVPSP)，計(jì)算左室發(fā)展壓(left ventricular developed pressure，LVDP)=LVPSP－LVEDP。

2.4冠脈流出液量及心肌酶學(xué)檢測(cè)標(biāo)本的收集

各組予量筒收集并測(cè)量冠脈流出液量(coronary flow，CF)，留冠脈流出液2 mL，用于LDH及CK的檢測(cè)，具體方法按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

2.5心肌線粒體提取參照文獻(xiàn)［3］方法，適當(dāng)修改。各灌注終點(diǎn)取心臟后，立即將心臟在4℃線粒體分離液(10 mL/g心肌組織)中剪碎，內(nèi)切式高速均質(zhì)器勻漿(破碎頭8G，設(shè)置6，時(shí)間5 s)，600×g離心10 min，取上清液，3 600×g離心15 min取沉淀，取等量分離液將沉淀重新分散懸浮，1 000×g離心5 min，取上清液，5 500×g離心10 min，取沉淀，再次分散于適量分離液中。線粒體蛋白定量方法，參照Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)，用酶標(biāo)儀測(cè)定A595，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中的蛋白濃度。

2.6心肌線粒體總磷脂的提取參照Bligh等［4］方法，線粒體懸液按1∶(V/V)的比例加心磷脂提取液，混勻，靜置20 min，1 000×g離心3 min(4℃)，取下層，加1/5體積0.05 mol/L的氯化鈣旋轉(zhuǎn)混勻，靜置1 min，1 000×g離心10min，取下層氯仿相，在40℃的水浴箱中用氮?dú)獯抵寥軇]發(fā)殆盡，準(zhǔn)確加入磷脂稀釋液0.1 mL，密閉、避光、液氮－80℃儲(chǔ)存待行高效液相色譜分析。除40℃的水浴箱外，其余過(guò)程均在0～4℃冰浴中進(jìn)行，同時(shí)盡可能避光和隔絕空氣。線粒體CL含量測(cè)定參照Lesnefsky等［5］液相色譜法進(jìn)行定性及定量:色譜系統(tǒng)為Agilent 1100系列高效液相色譜分析化學(xué)工作站(G1312A二元泵，G1313A自動(dòng)進(jìn)樣器，G1316A管柱控溫箱，G1315A二極管陣列檢測(cè)器);色譜柱為不銹鋼正相柱(Lichrosorb si60，5μm，4.6mm×250mm，中科院大連化物所，色譜柱編號(hào)C18B081203);淋洗條件為流動(dòng)相流速1 mL/min，柱溫30℃，DAD檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)206 nm，參考波長(zhǎng)360 nm。定性分析用內(nèi)標(biāo)法，并以CL標(biāo)準(zhǔn)品在相同條件下的保留時(shí)間確定;定量分析以峰面積積分值記錄，用峰面積積分值轉(zhuǎn)換為CL量與線粒體蛋白含量之比表示CL含量(mg/g)。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1HR及CF的變化

I/R組較control組和I/R+D組HR減慢，CF降低(P＜0.01)，但與I/R+5-HD+D組無(wú)明顯差異，I/R+D組較control組的HR減慢，CF降低(P＜0.01);I/R組心功能明顯低于control組和I/R+D組(P＜0.01)，但與I/R+5-HD+D組無(wú)明顯差異，control組的心功能優(yōu)于I/R+D組(P＜0.01)，見(jiàn)表1。

表1　各組離體大鼠心臟HR、CF、LVEDP和LVDP的變化Table 1.The changes of the HR，CF，LVEDP and LVDP in the isolated rat heartswith different treatments(Mean±SD.n=8)

2心肌酶及心肌線粒體CL含量的變化

I/R組的心肌酶含量高于control組和I/R+D組(P＜0.01)，但與I/R+5-HD+D組無(wú)明顯差異，control組的心肌酶低于I/R+D組(P＜0.01);I/R組的CL含量低于control組和I/R+D組(P＜0.01)，但與I/R+5-HD+D組無(wú)明顯差異，control組的CL含量高于I/R+D組(P＜0.01)，見(jiàn)表2。

表2　各組離體大鼠心臟LDH、CK和心肌線粒體CL的變化Table 2.The changes of LDH，CK and CL in isolated rat hearts with different treatments(Mean±SD.n=8)

3高效液相色譜結(jié)果

在0.31μg～40μg線性良好，回歸方程為CL (μg)=0.003582×峰面積－0.7280(r=0.988);標(biāo)準(zhǔn)品最低檢測(cè)質(zhì)量為0.15625μg(S/N≥3);日內(nèi)及日間變異均＜7%，回收率＞69%，回收率及精密度見(jiàn)表3;溶劑色譜圖、CL標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖及心肌線粒體磷脂色譜圖見(jiàn)圖1。

表3　CL高、中、低濃度的回收率和精密度Table 3.The recovery rate and precision of CL detected at high，moderate and light concentrations(Mean±SD.n=8)

Figure 1.The chromatogram ofmyocardialmitochondrial cardiolipin.圖1　心肌線粒體CL的色譜圖

討論

無(wú)論何種原因引起的心肌細(xì)胞損傷都會(huì)引起心肌酶不同程度的升高，心肌酶對(duì)于評(píng)價(jià)心肌損傷具有一定的敏感性和特異性。LDH是觀測(cè)缺血再灌注損傷的重要指標(biāo);CK是目前臨床上應(yīng)用最為廣泛的心肌損傷標(biāo)記物。本研究觀察冠脈流出液LDH及CK來(lái)判斷心肌損傷。HR、CF、LVDP及LVEDP的變化可直接反映心肌的損傷及收縮能力。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明二氮嗪后處理可顯著改善缺血心肌的收縮和舒張功能，使心輸出量增加，左室內(nèi)壓升高，LVEDP下降，從而有效減輕IRI，減少心肌酶的釋放，產(chǎn)生心肌保護(hù)作用。5-HD能夠完全阻斷二氮嗪后處理對(duì)IRI的心臟保護(hù)功能。

線粒體膜是維持線粒體整體性與內(nèi)外環(huán)境衡定的主要結(jié)構(gòu)，是維護(hù)線粒體的電子傳遞、能量代謝及膜完整性必不可少的成分，其含量的降低影響內(nèi)膜蛋白(陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及呼吸鏈復(fù)合體)的功能，導(dǎo)致能量合成障礙，嚴(yán)重者導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡或凋亡。CL位于線粒體內(nèi)膜，是線粒體內(nèi)膜的特征性磷脂，緊密結(jié)合并支撐著線粒體呼吸鏈氧化酶及其它某些線粒體蛋白發(fā)揮功能，并與線粒體呼吸功能及活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)關(guān)系密切［6］，CL減少導(dǎo)致活性氧生成增多，線粒體膜電位降低，導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡［7］。IRI可使CL、卵磷脂、腦磷脂含量下降，以CL下降最明顯。Petrosillo等［8］認(rèn)為CL為復(fù)合體Ⅲ提供反應(yīng)界面，補(bǔ)充外源性CL則復(fù)合體Ⅲ的功能幾乎可以完全恢復(fù)，但是補(bǔ)充其它磷脂則不能恢復(fù)，表明只有保護(hù)CL才能維持呼吸鏈酶活性。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，心肌IRI后線粒體呼吸功能受到抑制，電子傳遞受阻，ROS產(chǎn)生增加，而CL對(duì)ROS的攻擊特別敏感，ROS攻擊CL使復(fù)合體Ⅲ活性降低，電子漏增加，產(chǎn)生更多的ROS，導(dǎo)致線粒體CL含量下降，這種惡性循環(huán)最終導(dǎo)致細(xì)胞功能完全損害。細(xì)胞色素C(cytochrome C，Cyt C)存在于膜間隙，它與CL通過(guò)非離子與線粒體的內(nèi)膜結(jié)合，CL含量下降會(huì)導(dǎo)致Cyt C與內(nèi)膜親和力下降，促進(jìn)Cyt C釋放到胞質(zhì)［9］，Cyt C漏出線粒體將使線粒體消除ROS的功能喪失，從而導(dǎo)致凋亡的發(fā)生。同時(shí)，脂質(zhì)過(guò)氧化的中間產(chǎn)物還可使膜內(nèi)蛋白質(zhì)發(fā)生鏈?zhǔn)骄酆献饔?，造成膜蛋白分子?nèi)和分子間交換，引起與CL密切相關(guān)的Cyt C氧化酶和三磷酸腺苷合成酶的活性降低，從而導(dǎo)致氧化磷酸化功能受損，細(xì)胞因能量供應(yīng)障礙而死亡［10］。

本研究結(jié)果顯示，二氮嗪后處理能夠增加灌注末線粒體CL含量，保護(hù)和維持線粒體結(jié)構(gòu)和功能的完整性而產(chǎn)生心肌保護(hù)作用。5-HD能夠阻斷二氮嗪后處理這一作用。其機(jī)制可能是增加CL含量，抑制3態(tài)呼吸活動(dòng)、減少呼吸控制比率和磷氧比，4態(tài)呼吸活動(dòng)的增加及抑制膜流動(dòng)性的降低，使損傷呼吸鏈的氧化磷酸化偶聯(lián)減輕［11］，減輕心肌線粒體氧化損傷，保護(hù)心肌線粒體，從而保護(hù)心肌。

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Effect of diazoxide postconditioning on cardiac function and m itochondrial cardiolipin in isolated rat heart

DUAN Zhong-xin1，2，LIU Xing-kui1，YU Tian1
(1Department of Anesthesiology，ZunyiMedical College，Zunyi563003，China;2Departmentof Anesthesiology，The Second Affiliated Hospital，University of South China，Hengyang 421001，China.E-mail:xkliu@zmc.edu.cn)

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2015.05.008

1000-4718(2015)05-0812-05

2014-07-23

2015-03-03

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.30740044);貴州省科技基金資助項(xiàng)目［(2007)2121號(hào)］

Tel:0852-8608567;E-mail:xkliu@zmc.edu.cn