p38/ATF-2通路參與C反應(yīng)蛋白誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞活化*

劉少軍，李沅美，劉慰華，熊龍根，劉世明△(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院廣州心血管疾病研究所/心內(nèi)科，廣東廣州5060;廣東藥學(xué)院生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣東廣州50006)

p38/ATF-2通路參與C反應(yīng)蛋白誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞活化*

劉少軍1，李沅美2，劉慰華1，熊龍根1，劉世明1△
(1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院廣州心血管疾病研究所/心內(nèi)科，廣東廣州510260;2廣東藥學(xué)院生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣東廣州510006)

目的:考察p38 MAPK/ATF-2通路在C反應(yīng)蛋白(CRP)誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞活化中的作用。方法:采用培養(yǎng)的人冠狀動脈內(nèi)皮細胞(HCAEC)第3～7代用于實驗。CRP刺激誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞活化，給予p38抑制劑SB203580和SB202190干預(yù)。免疫印跡法檢測p-eNOS、p-p38和p-ATF2的水平;ELISA法測定HCAEC分泌的黏附分子ICAM-1、VCAM-1和MCP-1的變化。結(jié)果:CRP呈濃度依賴性地抑制p-eNOS水平，CRP誘導(dǎo)HCAEC分泌ICAM-1、VCAM-1和MCP-1;CRP激活p38/ATF-2通路;SB203580和SB202190部分恢復(fù)p-eNOS水平和抑制CRP誘導(dǎo)的ICAM-1、VCAM-1和MCP-1分泌。結(jié)論:p38 MAPK/ATF-2通路參與CRP誘導(dǎo)的HCAEC活化。

p38 MAPK/ATF-2通路;C反應(yīng)蛋白;內(nèi)皮細胞活化;動脈粥樣硬化

［ABSTRACT］AIM:To investigate the role of p38 MAPK/ATF-2 pathway in C-relative protein(CRP)-induced endothelial cell activation.METHODS:Human coronary artery endothelial cells(HCAEC)were cultured and were used between passages 3 and 7.CRP served as a stimulus for endothelial cell activation.Western blotting was performed to determine the expression and phosphorylation of eNOS，p38 and ATF2.ELISA was carried out to detect the levels of ICAM-1，VCAM-1 and MCP-1 released from HCAEC.Pharmacological p38 inhibitors SB203580 and SB202190 were used to determine the effect of p38/ATF-2 pathway.RESULTS:CRP reduced the p-eNOS level in a concentration-dependentmanner and induced the release of ICAM-1，VCAM-1 and MCP-1.The p38/ATF-2 pathway was activated by CRP treatment.SB203580 and SB202190 partially rescued p-eNOS level and suppressed the secretion of ICAM-1，VCAM-1 and MCP-1.CONCLUSION:p38MAPK/ATF-2 pathway participates in CRP-induced endothelial activation.

［KEY WORDS］p38 MAPK/ATF-2 pathway;C-relative protein;Endothelial activation;Atherosclerosis

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)被視為是一種炎癥性的疾?。?］。C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)是機體在炎癥或組織損傷后而產(chǎn)生的急性期反應(yīng)蛋白和非特異性的炎癥標志物［2］。近來研究表明CRP還可作為AS、心肌梗死等的心血管疾病危險的預(yù)測因子［3-4］。CRP在AS中重要作用之一是誘導(dǎo)內(nèi)皮型(endothelial cell，EC)活化。EC活化被認為是AS的起始環(huán)節(jié)?；罨腅C表現(xiàn)為內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的活性降低，細胞間黏附分子1(intercellular adhesionmolecule-1，ICAM-1)、血管細胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)、E-selectin和單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)分泌增加［3，5］。目前CRP誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞活化的分子機制尚未完全清楚。本研究主要考察p38 MAPK/ATF-2通路在CRP誘導(dǎo)的人冠狀動脈內(nèi)皮細胞(human coronary artery endothelial cells，HCAEC)活化中的作用。

材料和方法

1材料

培養(yǎng)基EGM-2購自Lonza;CRP購自Trichem Rsources和Calbiochem;除抗體GAPDH購自Santa Cruz外，其余抗體均購自Cell Signaling;抑制劑SB203580和SB202190分別購自Enzo Life Sciences和Calbiochem;ICAM-1和VCAM-1的ELISA試劑盒購于eBioscience;MCP-1的ELISA試劑盒購于BD。

2方法

2.1HCAEC的培養(yǎng)HCAEC(Cell Applications)的培養(yǎng)按照說明書進行。本實驗使用的HCAEC介于3～7代之間。實驗處理細胞之前，使用含0.1%胎牛血清、不含細胞因子的EGM-2基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。

2.2免疫印跡(Western blotting)檢測參照已經(jīng)發(fā)表的文章進行［5-6］。各組細胞裂解后定量(Bio-Rad Laboratories)。用Laemm li buffer(62.5 mmol/L Tris-HCl，pH 6.8，2%SDS，10%glycerol，50 mmol/L dithiothreitol，0.1%bromphenol blue)上樣，用8%或者12%的SDS-PAGE進行蛋白分離，然后轉(zhuǎn)印到PVDF膜(GE Healthcare)上。5%的脫脂奶粉(Bio-Rad)封閉后，相應(yīng)的抗體孵育4℃過夜。孵育HRP標記的II抗后進行ECL曝光。

2.3ELISA檢測HCAEC處理后收集細胞培養(yǎng)液。離心后回收上清液。按照eBioscience或者BD Biosciences的說明書進行操作。最后在酶標儀上以450 nm的波長進行讀數(shù)。

3統(tǒng)計學(xué)處理

檢測的數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析，多組比較用單因素方差分析、LSD法，兩組間比較用t檢驗。統(tǒng)計數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean ±SD)表示。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1CRP誘導(dǎo)EC活化

內(nèi)皮細胞活化的主要標志是eNOS活性下降和黏附分子(ICAM-1、VCAM-1和MCP-1等)的分泌。Ser1177位的磷酸化調(diào)控是eNOS活性調(diào)節(jié)的最重要的一種方式，因此p-Ser1177水平能夠反映eNOS的活性。我們首先觀察到各濃度CRP(0、12.5、25、50和100 mg/L)刺激后HCAEC細胞形態(tài)沒有明顯改變。免疫印跡結(jié)果表明，eNOS的Ser1177位磷酸化水平呈濃度依賴性下降，表明CRP抑制eNOS活性。同時ELISA檢測表明，與對照組相比，CRP(50 mg/ L)處理組的ICAM-1、VCAM-1和MCP-1的表達水平分別是對照組的2.83、4.80和2.03倍，見圖1。這些結(jié)果表明，CRP活化內(nèi)皮細胞，與之前的報道一致［6-8］。

Figure 1.CRP induced HCAEC activation.A:typical images of cellular morphology;B:the phosphorylation of eNOS detected by Western blotting;C:HCAEC culture supernatantwas analyzed by ELISA.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control.圖1　CRP誘導(dǎo)HCAEC活化

2CRP激活p38/ATF2通路

免疫印跡實驗觀察到CRP呈濃度依賴性地誘導(dǎo)p38的Thr180/Tyr182磷酸化水平(p-p38)增加，而p38的總蛋白表達不變。同時，p38的底物ATF2的Thr69/71磷酸化水平(p-ATF2)增加，見圖2。這表明CRP激活p38/ATF2通路。

Figure 2.CRP activated p38 MAPK/ATF2 pathway in the HCAEC.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control.圖2　CRP激活p38/ATF2通路

3p38/ATF2部分參與CRP誘導(dǎo)的eNOS活性下降

用2個p38抑制劑SB203580和SB202190進行干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SB203580和SB202190在抑制CRP誘導(dǎo)的p-p38和p-ATF2增加的同時，還增加p-eNOS的表達水平，見圖3。這說明抑制p38/ATF2能夠部分恢復(fù)eNOS的活性。

Figure 3.p38 inhibitors partially recovered the phosphorylation level of eNOS at Ser1177 in the HCAEC.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs CRP.圖3　p38抑制劑部分恢復(fù)p-eNOS水平

4p38抑制劑對黏附分子分泌的影響

ELISA結(jié)果顯示，SB203580和SB202190能夠有效抑制CRP誘導(dǎo)的ICAM-1、VCAM-1和MCP-1分泌，見圖4。綜合上述結(jié)果，p38/ATF2部分介導(dǎo)CRP誘導(dǎo)的eNOS活性下調(diào)和黏附分子(ICAM-1、VCAM-1和MCP-1)的分泌，即p38/ATF2參與CRP誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞活化過程。

討論

大量的研究表明CRP是心血管疾病強有力的、獨立的預(yù)測因子［3-4］。流行病學(xué)調(diào)查、臨床藥物試驗和實驗室研究都表明CRP在AS的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。CRP能夠活化EC、造成內(nèi)皮功能障礙、促進血管平滑肌細胞的增殖和遷移、誘導(dǎo)黏附分子分泌進而募集單核細胞入侵血管壁等等［3，5］;CRP對EC的損傷主要是抑制eNOS活性、促進黏附分子分泌、產(chǎn)生活性氧簇以及促進氧化型低密度脂蛋白的攝取等［3，9］。

Figure 4.Inhibition of VCAM-1，ICAM-1 and MCP-1 releases from the HCAEC by p38 inhibitors.Mean±SD.n= 3.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs CRP.圖4　SB203580和SB202190抑制黏附分子的分泌

本研究主要探討CRP誘導(dǎo)EC活化的分子機制，重點集中在p38/ATF2通路上。我們觀察到p38抑制劑SB203580和SB202190在抑制CRP誘導(dǎo)的p38/ATF2激活同時，還能部分恢復(fù)eNOS活性和抑制黏附分子(ICAM-1、VCAM-1和MCP-1)分泌，表明p38/ATF2通路部分介導(dǎo)了CRP誘導(dǎo)的EC活化。

p38 MAPK是一個在真核生物中高度保守的絲裂原蛋白激酶家族。p38信號通路在細胞外界應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮極其重要的作用，幾乎所有有害的外部刺激或內(nèi)部損傷均可以激活p38信號通路。本研究證實p38/ATF2通路參與CRP誘導(dǎo)的EC活化過程，為揭示EC損傷的分子機制甚至尋找AS的防治靶點提供有益線索。事實上，他汀類藥物可以通過降低p38 MAPK信號通路的活性［10］，發(fā)揮抑制CRP誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞損傷的效應(yīng)［11］。

本研究不足之處在于沒有探討p38通路激活與EC活化的內(nèi)在機制，即p38/ATF2激活與抑制eNOS活性，以及與促進ICAM-1、VCAM-1和MCP-1分泌之間的直接分子關(guān)系。已有報道表明CRP通過CD32受體激活p38激酶，進而激活NF-κB促進黏附分子VCAM-1的表達［12-14］。p38/NF-κB通路在CRP誘導(dǎo)的EC活化中的作用也是我們后續(xù)的研究內(nèi)容之一。

［1］Ross R.Atherosclerosis:an inflammatory disease［J］.N Engl JMed，1999，340(2):115-126.

［2］Du Clos TW.Function of C-reactive protein［J］.Ann Med，2000，32(4):274-278.

［3］Ferri C，Croce G，Cofini V，etal.C-reactive protein:interaction with the vascular endothelium and possible role in human atherosclerosis［J］.Curr Pharm Des，2007，13 (16):1631-1645.

［4］Koenig W.Predicting risk and treatment benefit in atherosclerosis:the role of C-reactive protein［J］.Int JCardiol，2005，98(2):199-206.

［5］Liu SJ，Liu WH，Zhong Y，et al.Glycogen synthase kinase-3βis involved in C-reactive protein-induced endothelial cell activation［J］.Biochemistry(Mosc)，2013，78 (8):915-919.

［6］Liu SJ，Zhong Y，You XY，et al.Insulin-like growth factor 1 opposes the effects of C-reactive protein on endothelial cell activation［J］.Mol Cell Biochem，2014，385(1-2):199-205.

［7］Pasceri V，Willerson JT，Yeh ET.Direct proinflammatory effectof C-reactive protein on human endothelial cells［J］.Circulation，2000，102(18):2165-2168.

［8］LiHY，Wang J，Wu YX，etal.Topological localization of monomeric C-reactive protein determines proinflammatory endothelial cell responses［J］.J Biol Chem，2014，289 (20):14283-14290.

［9］Bian F，Yang X，Zhou F，et al.C-reactive protein promotes atherosclerosis by increasing LDL transcytosis across endothelial cells［J］.Br JPharmacol，2014，171(10): 2671-2684.

［10］陳埏芳，鐘健，湯紹輝，等.辛伐他汀通過抑制p38 MAPK活化降低肝硬化門靜脈高壓大鼠門靜脈壓力［J］.中國病理生理雜志，2013，29(2):205-209.

［11］鐘鈞琳，彭隆，羅艷婷，等.瑞舒伐他汀抑制C-反應(yīng)蛋白誘導(dǎo)的晚期內(nèi)皮祖細胞炎癥因子的表達［J］.中國病理生理雜志，2013，29(4):597-602.

［12］Kawanami D，Maemura K，Takeda N，et al.C-reactive protein induces VCAM-1 gene expression through NF-κB activation in vascular endothelial cells［J］.Atherosclerosis，2006，185(1):39-46.

［13］Liang YJ，Shyu KG，Wang BW，et al.C-reactive protein activates the nuclear factor-κB pathway and induces vascular cell adhesion molecule-1 expression through CD32 in human umbilical vein endothelial cells and aortic endothelial cells［J］.JMol Cell Cardiol，2006，40(3):412-420.

［14］Qamirani E，Ren Y，Kuo L，et al.C-reactive protein inhibits endothelium-dependent NO-mediated dilation in coronary arterioles by activating p38 kinase and NAD(P)H oxidase［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2005，25 (5):995-1001.

p38 MAPK/ATF-2 pathway is involved in C-relative protein-induced endothelial cell activation

LIU Shao-jun1，LIYuan-mei2，LIUWei-hua1，XIONG Long-gen1，LIU Shi-ming1
(1Department of Cardiology，Guangzhou Institute of Cardiovascular Disease，Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510260，China;2College of Life Science and Bio-pharmaceutics，Guangdong Pharmaceutical U-niversity，Guangzhou 510006，China.E-mail:gzliushiming@126.com)

R541

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2015.05.007

1000-4718(2015)05-0808-04

2014-11-20［修回日期］2015-01-04

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81300151);廣東省自然科學(xué)基金重點項目(No.S2011020002143)

△通迅作者Tel:020-34153522;E-mail:gzliushiming@126.com