纈沙坦對心力衰竭家兔心肌細胞核及肌漿網鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ的影響

曲輔政 張曉錄 孫經武 王秀花 曲愛燕 路新磊 周紅霞 程林 康浩飛衣曉蕊 王青海 劉靜 史孟松 魏靜 張明哲

基礎研究

纈沙坦對心力衰竭家兔心肌細胞核及肌漿網鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ的影響

曲輔政 張曉錄 孫經武 王秀花 曲愛燕 路新磊 周紅霞 程林 康浩飛衣曉蕊 王青海 劉靜 史孟松 魏靜 張明哲

目的 探討家兔慢性心力衰竭（心衰）時心肌細胞核及肌漿網鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）蛋白表達和活性的改變，以及血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑纈沙坦長期干預的意義。方法 24只家兔隨機分為3組，假手術組、心衰組和纈沙坦組，各8只。通過超容量負荷聯(lián)合壓力負荷建立家兔心衰模型，于術后7周觀察左心室結構、血流動力學的變化及CaMKⅡ的表達和活性的改變。結果 與假手術組比較，心衰組左心室重量指數（LVMI）［（3.61±0.09）g/kg 比 （1.32±0.06）g/kg，P＜0.05]、左心室舒張末壓（LVEDP）［（23.00±2.37）mm Hg 比（-1.50±0.50）mm Hg，P＜0.05]顯著升高，左心室縮短率（LVFS）［（17.38±3.13）%比（37.83±3.58）%，P＜0.05]及左室射血分數（LVEF）［（38.50±6.07）%比（71.92±4.56）%，P＜0.05]明顯降低。與心衰組比較，纈沙坦組 LVMI［（2.07±0.14）g/kg 比（3.61±0.09）g/kg，P＜0.05]和 LVEDP［（2.17±0.72）mm Hg 比（23.00±2.37）mm Hg，P＜0.05]顯著降低，LVFS［（33.83±2.85）%比（17.38±3.13）%，P＜0.05]和 LVEF［（64.45±3.66）%比（38.50±6.07）%，P＜0.05]明顯升高。心衰組細胞核及肌漿網 CaMKⅡ蛋白表達（1.42±0.11比 0.86±0.04，1.39±0.14 比 0.80±0.06，P＜0.05）及活性（3.43±0.15 比 2.14±0.13，3.38±0.11 比 2.09±0.11，P＜0.05）顯著高于假手術組；纈沙坦組細胞核及肌漿網CaMKⅡ蛋白表達（1.18±0.11比1.42±0.11，1.10±0.11比1.39±0.14，P＜0.05）及活性（2.72±0.13 比 3.43±0.15，2.69±0.12 比 3.38±0.11，P＜0.05）顯著低于心衰組。結論 纈沙坦長期干預心力衰竭，能夠改善心臟舒縮功能，可能與其降低細胞核及肌漿網CaMKⅡ蛋白表達及活性有關。

纈沙坦； 心力衰竭； 鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ

心力衰竭（心衰）是臨床常見的危重癥之一，死亡率極高。研究表明，心肌細胞核、肌漿網CaMKⅡ鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ（calcium/calmodulindependent protein kinase-Ⅱ，CaMKⅡ）異常在心衰的病程發(fā)展機制中發(fā)揮不同的作用[1]。目前國內尚沒有關于心衰時細胞核、肌漿網CaMKⅡ的變化及纈沙坦進行長期干預進而改善心功能狀況的報道。本實驗通過用超容量負荷聯(lián)合壓力負荷制備家兔心衰模型，觀察纈沙坦對細胞核、肌漿網CaMKⅡ表達和活性的影響，探討纈沙坦改善心功能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和材料 家兔24只，雌雄不限，體重 2．0～2．2 kg，由蘇州大學醫(yī)學院實驗動物中心提供。SCHILLER TM-7型有創(chuàng)血壓監(jiān)護儀產自瑞士，低溫離心機（BECMAN）產自德國，液閃儀（BECMAN）產自德國，Bio Rad電泳轉印儀產自美國，KPL Western Blot試劑盒產自美國，BCA蛋白濃度測定試劑盒購于上海西唐生物公司，Merck KgaA ProteoExtract Subcellular ptoteome Extraction Kit產自德國，CaMKⅡ一抗購于abcam公司，β-actin一抗購于Upstate公司，二抗羊抗兔IgG購于上海西唐生物公司，CaMKⅡ活性檢測試劑盒購于美國Promega公司，［γ-32P]ATP購于北京市福瑞生物工程公司。

1.2 心衰模型的建立 家兔經心臟超聲檢查，排除器質性病變后，隨機分為假手術組（8只）、心衰組（8只）和纈沙坦組（8只）。心衰組家兔利用超容量負荷聯(lián)合壓力負荷制備心力衰竭模型[2]。3%戊巴比妥鈉30 mg/kg經家兔耳緣靜脈麻醉；從右側頸總動脈插入4 F鞘管及4 F導管，并經壓力換能器連接心電血壓監(jiān)護儀，用4 F導管迅速捅穿主動脈瓣膜幾次，誘導主動脈瓣膜關閉不全（主閉）。10 d后在左腎動脈上方暴露腹主動脈，根據腹主動脈的粗細選擇6 F或者5 F導管與其平行相貼，4號線結扎后抽出導管，使腹主動脈狹窄50%左右。纈沙坦組家兔在主閉后第2天開始給予纈沙坦20 mg·kg-1·d-1。術后 7周心超測定左室短軸縮短率（LVFS）及左室射血分數（LVEF），利用心導管術測定左室收縮壓（LVESP）、左室舒張末壓（LVEDP）；然后處死家兔，取出心臟，剪下左室心肌組織稱重，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 蛋白表達的測定

1.3.1 心肌細胞核提取 取左心室肌組織標本50 mg，剪碎，置于離心管中，加入1 ml Extraction BufferⅠ及 5 μl Inhibitor Cocktail，4 ℃孵育 10 min，800 rpm離心5 min；除掉上清液，在沉淀物中加入1 ml Extraction BufferⅢ ，5 μl Inhibitor Cocktail，1.5 μl Benzonase，4 ℃孵育 10 min，8500 rpm 離心 10 min；取上清液為細胞核蛋白提取物，用BCA法測定蛋白濃度，-70℃保存。

1.3.2 心肌肌漿網提取步驟 參照改良的Jones等[3]的方法制備肌漿網：①取液氮中黃豆至花生米大小的心肌組織，剪碎后置入離心管中，加入5倍體積的緩沖液A（30 mmol/L Tris-馬來酸緩沖液，0.3 mol/L 蔗糖，0.1 mmol/L PMSF，2 mmol/L DTT，3 mmol/L MgCL2，0.1 mmol/L EDTA，pH=7.2），用勻漿器將它們勻漿，然后用2層和4層紗布分別過濾1次。②4℃，3800 g離心20 min。③取上清液，移入新離心管中，4℃，14 000 g離心20 min。④取上清液，移入新離心管中，4℃，45 000 g離心60 min。⑤棄上清液，收集沉淀，用緩沖液 B（30 mmol/L Tris-馬來酸緩沖液，0.3 mol/L蔗糖，0.1 mmol/L PMSF，2 mmol/L DTT，0.5 mol/L KCL，pH=7.0）1 ml懸浮，用勻漿器打勻，4 ℃，45 000 g離心60 min。⑥收集沉淀，用緩沖液C（30 mmol/L Tris-馬來酸緩沖液，0.3 mol/L蔗糖，0.1 mmol/L PMSF，2 mmol/L DTT，pH=7.0）1 ml懸浮，用勻漿器充分混勻以形成肌漿網囊泡。蛋白含量測定采用BCA法

1.3.3 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 取含20 μg總蛋白的樣本，于100℃煮沸5 min，用非連續(xù)梯度SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白（CaMKⅡ相對分子質量為60 KDa，分離膠濃度為8%，濃縮膠濃度為5%）；首先電壓35 V、40 min直到樣品在濃縮膠底部成一直線，然后電壓100 V、80 min至溴酚藍到達分離膠底部。

1.3.4 蛋白免疫印跡 在冰水中將凝膠上的蛋白轉移到硝酸纖維膜上，電壓110 V、75 min；然后硝酸纖維膜置于封閉液中，室溫溫育1 h；再加入一抗（CaMKⅡ抗體滴度 1∶100、β-actin 抗體滴度 1∶1000）封閉，4℃冰箱過夜。次日用洗液漂洗；加入1∶10 000二抗（二抗為羊抗兔IgG），溫育1 h；然后用洗液漂洗。最后將顯色劑LumiGLO A液和B液1∶1混合，直接加到硝酸纖維膜上；1 min后將顯色液用吸水紙吸干，放入暗盒，加蓋一層透明薄膜，曝光2 min。

1.3.5 蛋白表達半定量分析 將膠片掃描至計算機內，應用UVIDoc成像儀進行蛋白條帶灰度分析；CaMKⅡ與β-actin灰度比值表示蛋白表達半定量水平。

1.4 CaMKⅡ活性分析 按CaMKⅡ檢測試劑盒說明操作。根據CaMKⅡ依賴CaM（鈣調蛋白）分解［γ-32P]ATP的原理，CaMKⅡ活性以每分鐘每微克蛋白催化γ-32P摻入底物的量表示：pmol·min-1·μg-1。

分別取細胞核及肌漿網提取液約50 mg，加入2 ml提取緩沖液：20 mM Tris-HCL（PH 8.0），2 mM EDTA（乙二胺四乙酸），2 mM EGTA（乙二醇雙2-氨基乙基醚四乙酸），20 μg/ml大豆胰蛋白酶抑制劑，10 μg/ml抑肽酶，5 μg/ml亮肽素，2 mM 二硫蘇糖醇，25 mM苯甲脒。0℃環(huán)境下進行勻漿。然后4℃下14 000 r/min離心5 min，吸取上清液作酶樣，用BCA法測定蛋白濃度。按0.5 mM ATP 5 μl和［γ-32P]ATP（3000 ci/mmol） 10 mci/ml 0.05 μl準備ATP混合物。在離心管中準備下列反應：5×CaMKⅡ反應緩沖液（250 mM Tris-HCl（PH7.5），50 mM MgCl2，2.5 mM 二硫蘇糖醇）5 μl、5×CaMKⅡ激活緩沖液 （5 mM CaCl2，5 μM CaM，0.l mg/ml BSA）5 μl、［γ-32P]ATP 5 μl、CaMKⅡ生物素化的多肽底物 2.5 μl、去離子水 2.5 μl，總反應體積 20 μl。同時設無酶作用底物（即用5 mM EGTA替換激活緩沖液）的對照反應管以測量作樣本底數?；靹蚍磻旌衔铮?0℃下預溫3 min。將5 μl酶樣本加入反應物中即開始反應?？偡磻w積需要25 μl，反應在30℃溫育中進行2 min。加入12.5 μl終止緩沖液終止反應。

從每個終止反應中吸取10 μl點到生物素捕獲膜方塊上，在所有樣品都點好后［再選任意2個反應管取出5 μl點在生物素捕獲膜上，此兩膜不清洗，用于計算標記（γ-32P）ATP的特殊活性]，將生物素捕獲膜方塊放入清洗容器中，用200 ml 2 M NaCl溶液清洗3次，用100 ml去離子水清洗2次。將生物素捕獲膜方塊放在一張鋁鉑上，在室溫下用空氣吹干。將各生物素捕獲膜方塊剪開，分別放入液閃瓶中，加入閃爍液并計數。

CaMKⅡ活性（mol·min-1·μg-1）的計算按試劑盒說明計算。

1.5 統(tǒng)計學方法 應用SAS 6.12統(tǒng)計軟件包進行數據處理。所有數據以±s表示，組間均數比較采用ANOVA檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 三組家兔血流動力學和心功能比較 家兔飼養(yǎng)過程中，心衰組有2只死亡，纈沙坦組有1只死亡，發(fā)生在3周左右，假手術組無死亡，均取其中6只作比較。心衰組家兔解剖時可見皮下、胸腔、腹腔大量積水，而假手術組、纈沙坦組家兔無以上表現。心衰組家兔左室重量（LVW）和左室重量指數（LVMI）較假手術組、纈沙坦組均明顯增高。與假手術組相比，心衰組家兔LVEDP、LVESP顯著升高，LVFS及LVEF明顯降低；而纈沙坦組家兔的LVEDP、LVESP顯著低于心衰組，LVFS及LVEF明顯高于心衰組。見表1。

表1 實驗兔術后7周血流動力學和心功能比較（±s）

表1 實驗兔術后7周血流動力學和心功能比較（±s）

注：LVW：左室重量；LVMI：左室重量指數；LVEDP：左室舒張末壓；LVESP：左室收縮末壓；LVFS：左室短軸縮短率；LVEF：左室射血分數。與假手術組比較，aP＜0.05；與心衰組比較，bP＜0.05

組別例數LVW（g）LVMI（g/kg）心率（次/min）LVEDP（mm Hg）LVESP（mm Hg）LVFS（%）LVEF（%）假手術組 6 2.48±0.15 1.32±0.06 244.67±9.39 -1.50±0.50 112.67±3.78 37.83±3.58 71.92±4.56心衰組 6 7.15±0.59a 3.61±0.09a 270.50±2.88a 23.00±2.37a 139.50±3.08a 17.38±3.13a 38.50±6.07a纈沙坦組 6 4.82±0.21b 2.07±0.14b 252.67±3.50b 2.17±0.72b 122.17±0.75b 33.83±2.85b 64.45±3.66b

2.2 三組家兔心肌細胞核及肌漿網CaMKⅡ蛋白比較 心衰組心肌細胞核及肌漿網CaMKⅡ表達顯著高于假手術組，纈沙坦組顯著低于心衰組。見圖 1、2，表 2、3。

圖1 三組家兔心肌細胞核CaMKⅡ蛋白印跡結果

圖2 三組家兔心肌肌漿網CaMKⅡ蛋白印跡結果

表2 各組間心肌細胞細胞核CaMKⅡ蛋白表達及CaMKⅡ活性的比較（±s）

表2 各組間心肌細胞細胞核CaMKⅡ蛋白表達及CaMKⅡ活性的比較（±s）

注：與假手術組比較，aP＜0.05；與心衰組比較，bP＜0.05

組別 灰度比 CaMKⅡ活性（pmol·min-1·μg-1）假手術組 0.86±0.04 2.14±0.13心衰組 1.18±0.11a 2.72±0.13a纈沙坦組 1.42±0.11b 3.43±0.15b

表3 各組間心肌細胞肌漿網CaMKⅡ蛋白表達及CaMKⅡ活性的比較（±s）

表3 各組間心肌細胞肌漿網CaMKⅡ蛋白表達及CaMKⅡ活性的比較（±s）

注：與假手術組比較，aP＜0.05；與心衰組比較，bP＜0.05

組別 灰度比 CaMKⅡ活性（pmol·min-1·μg-1）假手術組 0.80±0.06 2.09±0.11心衰組 1.10±0.11a 2.69±0.12a纈沙坦組 1.39±0.14b 3.38±0.11b

2.3 三組家兔心肌細胞核及肌漿網CaMKⅡ活性比較 心衰組細胞核及肌漿網CaMKⅡ活性較假手術組明顯增強，纈沙坦組CaMKⅡ活性顯著低于心衰組，見表 2、3。

3 討論

CaMKⅡ屬于絲/蘇氨酸蛋白酶家族，受CaM調節(jié)。CaMKⅡ包括 α、β、γ、δ 四種亞基，α、β 亞基主要存在于神經細胞，γ、δ亞基普遍存在于多種細胞，其中δ亞基是CaMKⅡ在心肌中的主要成分[4]。每個CaMKⅡ亞基又各自有多種剪接體（splice variants）。研究發(fā)現，在正常心臟生長發(fā)育及各種心臟疾病過程中，都伴有δ亞基不同剪接體相對表達程度的變化。在心臟中δ亞基的不同剪接體主要有δB和δC。δB主要分布于細胞核中，可能與病理狀態(tài)下調控基因轉錄密切相關；δc則主要定位于細胞質中，集中在心肌細胞Z帶T小管的胞質面，與ryanodine受體（RyR）、L-型鈣通道（L-type Ca2+channels，LTCC）相鄰，參與 Ca2+依賴的信號轉導途徑，同時可磷酸化調控胞質中的Ca2+調節(jié)蛋白，影響胞內鈣穩(wěn)態(tài)，從而在心律失常、心肌肥厚、心衰發(fā)生中起著重要作用[5]。

目前在心肌細胞中研究頗多的是，CaMKⅡ可作用于細胞內一些鈣調控的相關蛋白，影響胞內鈣穩(wěn)態(tài)。CaMKⅡ可以直接磷酸化肌漿網鈣泵（sarcoplasmic reticulum calcium adenodine triphosphatase，SERCA2），增加肌漿網對 Ca2+回攝速度，從而增加心肌舒張速率。研究表明，心衰時細胞核及肌漿網CaMKⅡ表達和活性增加，但其作用卻不同，細胞核CaMKⅡ的過表達主要引起心肌肥厚，肌漿網CaMKⅡ過表達可加重心力衰竭，形成惡性循環(huán)[6]。大量證據表明，CaMKⅡ在心肌肥厚和心力衰竭過程中發(fā)揮重要作用。Kashiwase等[7]的研究發(fā)現，采用表達CaMKⅡδ的腺相關病毒載體體外轉染心肌細胞，過度表達CaMKⅡδ可誘導心肌肥大，應用CaMKⅡ特異性抑制劑KN-93可抑制心肌細胞肥大的形成。過度表達CaMKⅡδ可通過激活細胞凋亡信號調節(jié)激酶1（apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1）及核轉錄因子－KB來誘導心肌肥大。另有研究表明，過度表達CaMKⅡδ的轉基因鼠心肌收縮功能明顯下降，心室明顯擴張，最終發(fā)生心力衰竭[8]。在體研究表明，擴張型心肌病伴心力衰竭患者心肌組織CaMKⅡ的活性升高20%，而且CaMKⅡ的活性升高與心功能變化呈負相關[9]。心肌細胞凋亡是心力衰竭的機制之一。CaMKⅡ能夠傳導凋亡信號，如選擇性抑制CaMKⅡ，能夠明顯抑制腫瘤壞死因子α（TNF－α）導致的凋亡。β腎上腺素可通過CaMKⅡ傳導的通路導致成年心肌凋亡，胞漿CaMKⅡδ過度表達能放大β腎上腺素的凋亡效果。CaMKⅡδ轉基因大鼠發(fā)生心力衰竭伴有明顯心室變薄，也提示在CaMKⅡ的參與下發(fā)生凋亡[10]。

本研究顯示，7周后心衰組家兔均表現為不同程度的進食和活動減少，呼吸頻率增快；LVW、LVMI、LVEDP明顯增加；LVFS及LVEF明顯降低；解剖時可見皮下、胸腔、腹腔大量積水。以上結果表明，心衰組家兔在超容量負荷及壓力負荷的影響下，結構上表現為心室重構，功能上表現為收縮功能降低，最終發(fā)展為心力衰竭。與假手術組相比，心衰組家兔細胞核、肌漿網CaMKⅡ蛋白表達和活性顯著增加，與以往的報道一致[1]。

本實驗表明，纈沙坦長期干預心衰，可明顯抑制細胞核、肌漿網的CaMKⅡ蛋白的表達和活性，顯著改善血流動力學，緩解心室肥厚。纈沙坦作為一種ARB類藥物，主要通過與AT1受體結合，競爭性抑制血管緊張素Ⅱ的生物學效應而發(fā)揮作用。具體機制可能包括以下因素：①纈沙坦作為血管擴張劑降低了心臟的前后負荷，降低了室壁的張力，改善了促使心室重構的血流動力異常；②抑制了心肌細胞凋亡、肥大和膠原的增生；③抑制了交感神經的過度激活；④增強了血管緊張素Ⅱ受體的良性心血管效應；⑤抑制了炎癥因子等；⑥也可能是抑制細胞核、肌漿網的CaMKⅡ蛋白的表達和活性等。

總之，本實驗結果說明，心衰家兔細胞核、肌漿網CaMKⅡ蛋白表達和活性增加，可影響心肌舒縮功能，這有可能為心衰治療提供新的方向。纈沙坦長期干預心衰，改善心臟舒縮功能，可能與其抑制CaMKⅡ蛋白的表達和活性有關。

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Effect of Valsartan on Calcium/calmodulin-dependent protein kinase-Ⅱin nucleus and sarcoplasmic reticulum in heart failure rabbit

Qü Fu-zheng＊，ZHANG Xiao-lu，SUN Jing-wu，et al.＊Department of Cardiology，Yantai Affiliated Hospital of Binzhou Medical University，Yantai 264100，China

ZHANG Xiao-lu，E-mail：zhangxiaolu7821@126.com

ObjectiveTo investigate the expression and activity of Calcium/calmodulin-dependent protein kinase-Ⅱ（CaMKⅡ）in nucleus and sarcoplasmic reticulum in heart failure rabbit and the effects of Valsartan on the prevention of chronic heart failure．Methods24 rabbits were divided into three groups：8 rabbits with heart failure induced by volume overload plus pressure overload，8 sham rabbits and 8 rabbits those were treated with Valsartan.7 weeks later，left ventricular function，hemodynamic parameters，expression and activity of CaMKⅡwere observed．ResultsCompared with the sham operated rabbits，LVMI［（3.61±0.09）g/kg vs（1.32±0.06）g/kg，P＜0.05]and LVEDP［（23.00±2.37）mm Hg vs（-1.50±0.50）mm Hg，P＜0.05]in heart failure rabbits were significantly increased，but their left ventricular shorten fraction［LVFS（17.38±3.13）%vs （37.83±3.58）%，P＜0.05]and left ventricular ejection fraction［LVEF（38.50±6.07）%vs（71.92±4.56）%，P＜0.05]were decreased．Compared with the heart failure rabbits，LVMI［（2.07±0.14）g/kg vs（3.61±0.09）g/kg，P＜0.05]and LVEDP［（2.17±0.72）mm Hg vs （23.00±2.37）mm Hg，P＜0.05]in the Valsartan treated rabbits were significantly decreased，but their LVFS［（33.83±2.85）%vs（17.38±3.13）%，P＜0.05]and LVEF［（64.45±3.66）%vs（38.50±6.07）%，P＜0.05]were increased．Expression（1.42±0.11 vs 0.86±0.04，1.18±0.11， P＜0.05） （1.39±0.14 vs 0.80±0.06，1.10±0.11，P＜0.05）and activity（3.43±0.15 vs 2.14±0.13，2.72±0.13，P＜0.05）（3.38±0.12 vs 2.09±0.11，2.69±0.12，P＜0.05）of CaMKⅡ in nucleus and sarcoplasmic reticulum in heart failure rabbits were remarkably higher than sham operated rabbits and valsartan treated rabbits respectively．ConclusionValsartan can improve cardiac function，probably owing to its disregulating expression and activity of CaMKⅡ in nucleus and sarcoplasmic reticulum on the prevention of heart failure.

Valsartan； Heart failure； CaMKⅡ

264100 山東省煙臺市，濱州醫(yī)學院煙臺附屬醫(yī)院心內科（曲輔政、孫經武、王秀花、曲愛燕、路新磊、周紅霞、程林、康浩飛、衣曉蕊、王青海、劉靜、史孟松、魏靜、張明哲）；煙臺毓璜頂醫(yī)院檢驗科（張曉錄）

張曉錄，E-maill：zhangxiaolu7821@126.com

10．3969/j．issn．1672－5301．2015．08．022

Q95-33；R541.6

A

1672-5301（2015）08-0759－05

2015-03-30）