靶向干擾GPx1基因?qū)θ四z質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移的影響*

劉 陽(yáng)， 李軍亮， 許新科， 鄺崑琦， 翁胤侖， 陳 偉， 陳 程， 李方成，△

(1中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院神經(jīng)外科，2廣州市婦女兒童醫(yī)療中心神經(jīng)外科，廣東廣州 510120)

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是成人最常見(jiàn)的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，惡性程度最高;具有高度異質(zhì)性和侵襲性，與正常組織分界不清，手術(shù)難以全部切除，同時(shí)對(duì)術(shù)后放、化療不敏感，易復(fù)發(fā)，預(yù)后極差，中位總體生存時(shí)間約為14.6月［1］。

谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidases，GPxs)是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過(guò)氧化物分解酶，能夠有效清除代謝中產(chǎn)生的過(guò)多的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，減輕細(xì)胞氧化損傷，兩者在維持機(jī)體內(nèi)氧化-抗氧化平衡中發(fā)揮著重要的作用［2］。谷胱甘肽過(guò)氧化物酶1(glutathione peroxidase 1，GPx1)作為谷胱甘肽過(guò)氧化物酶族中最多見(jiàn)的抗氧化酶，能有效清除脂質(zhì)氫過(guò)氧化物和其它活性氧化物，在多個(gè)腫瘤中如乳腺癌、肺癌、前列腺癌均出現(xiàn)高表達(dá)，并能促進(jìn)細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力［3-5］。GPxs的異常高表達(dá)能清除某些腫瘤藥物誘導(dǎo)產(chǎn)生的 ROS 而出現(xiàn)耐藥［6］。研究［7-8］報(bào)道 GPx1在膠質(zhì)瘤中也同樣出現(xiàn)不同程度異常表達(dá)，并能影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)狀態(tài)。同時(shí)，腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生可能與ROS引起細(xì)胞DNA損傷，導(dǎo)致遺傳信息的變異有關(guān)［9-10］。目前尚無(wú)GPx1影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及侵襲能力方面的研究，我們推論通過(guò)針對(duì)GPx1誘導(dǎo)改變機(jī)體內(nèi)氧化還原反應(yīng)狀態(tài)可能成為一種新治療腦膠質(zhì)瘤的輔助方法。故本研究通過(guò)合成小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)和構(gòu)建、鑒定 pcDNA3.1-GPx1重組質(zhì)粒下調(diào)和上調(diào)GPx1，探討其對(duì)人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株U87MG和U118MG的細(xì)胞活力、遷移和侵襲的影響，可為個(gè)體化誘導(dǎo)氧化還原反應(yīng)狀態(tài)、輔助治療膠質(zhì)瘤提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1 主要試劑

人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株U87MG和U118MG購(gòu)于ATCC;DMEM、MEM細(xì)胞培養(yǎng)液購(gòu)自Gibco;胎牛血清購(gòu)自BI;羊抗兔IgG II抗、細(xì)胞增殖檢測(cè)盒MTS和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒購(gòu)自Sigma;兔抗人GPx1單克隆抗體購(gòu)自CST;轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購(gòu)自Invitrogen;RIPA組織細(xì)胞裂解液購(gòu)自碧云天公司;Matrigel膠購(gòu)自BD;Transwell小室購(gòu)自Costar;細(xì)胞RNA提取試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒均購(gòu)自TaKaRa。

2 siRNA的設(shè)計(jì)、合成和pcDNA3.1-GPx1重組質(zhì)粒的構(gòu)建、鑒定

選取特異性 GPx1序列正義鏈為5’-GGUACUACUUAUCGAGAAUTT-3’，反義鏈為 5’-AUUCUCGAUAAGUAGUACCTT-3’;陰性對(duì)照序列正義鏈為5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，反義鏈為 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。將擴(kuò)增克隆的GPx1基因片段按照產(chǎn)品說(shuō)明與載體pcDNA3.1(Invitrogen)連接，構(gòu)建成重組質(zhì)粒?？寺⌒蛄薪?jīng)測(cè)序證實(shí)正確，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。以上序列均由上海吉瑪制藥公司完成。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及 siRNA和 pcDNA3.1-GPx1的轉(zhuǎn)染 將U118MG細(xì)胞和U87MG細(xì)胞分別置于含10%小牛血清DMEM和MEM培養(yǎng)液中，于5%CO2、37℃濕度條件下培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照(blank control，Ctr)組(加轉(zhuǎn)染試劑)、陰性對(duì)照(negative control，NTC)組(加入非特異性siRNA及轉(zhuǎn)染試劑、非特異性pcDNA3.1-GPx1及轉(zhuǎn)染試劑)、特異干擾組(加入GPx1-siRNA及轉(zhuǎn)染試劑、特異性pcDNA3.1-GPx1及轉(zhuǎn)染試劑)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用胰酶消化調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度后接種于35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中。待細(xì)胞生長(zhǎng)至70% ～80%時(shí)，按照脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒操作步驟分別對(duì)U87MG細(xì)胞和U118MG細(xì)胞進(jìn)行siRNA和pcDNA3.1-GPx1轉(zhuǎn)染。繼續(xù)培養(yǎng)6～8 h后換液，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要收集細(xì)胞。

3.2 Real-time PCR檢測(cè)GPx1 mRNA的表達(dá) 提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用real-time PCR法。反應(yīng)體系20 μL。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為:37℃ 15 min;85℃ 60 s。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以β-actin為內(nèi)參照計(jì)算相對(duì)表達(dá)量(relative quantity，RQ)。GPx1引物序列正義鏈為 5’-AAGGTACTACTTATCGAGAATGTG-3’，反義鏈為 5’-GTCAGGCTCGATGTCAATGGTCTG-3’;β-actin引物序列正義鏈為5’-GGGTGTGGCACAGCTAGTTCCG-3’，反義鏈為 5’-CATTGTCAAGTGACGATCACAG-3’。

3.3 Western blotting檢測(cè)GPx1蛋白的表達(dá) 轉(zhuǎn)染后72 h，用PBS漂洗細(xì)胞3遍。收集細(xì)胞，用組織蛋白裂解液裂解細(xì)胞，置于冰上30 min，以12 000 r/min速率離心20 min。取上清20 μL，加入等體積的4×上樣緩沖液振蕩，煮沸10 min。用二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測(cè)定總蛋白濃度。定量后上樣，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，100 V電泳溴酚藍(lán)至凝膠底部。200 mA恒流2 h后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉液于常溫封閉1 h，TBST漂洗3次，加人兔抗人 GPx1單抗(1∶1 000)，孵育過(guò)夜，用TBST洗膜3次。加 II抗，于室溫孵育1 h。TBST洗膜，顯色。

3.4 MTS實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力 轉(zhuǎn)染后24 h細(xì)胞經(jīng)消化處理，配置為2×107/L濃度的細(xì)胞懸液，然后分別接種于96孔板，劑量為100 μL/孔，每組均設(shè)5個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)置試劑組，不加任何細(xì)胞。觀察細(xì)胞完全貼壁后，分別于 24 h、48 h、72 h加入 20 μL MTS試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，酶標(biāo)儀于490 nm處測(cè)定吸光度值(A值)。按下列公式計(jì)算細(xì)胞活力抑制率(inhibitory rate，IR)=［對(duì)照組A值－實(shí)驗(yàn)組A值］/對(duì)照組A值×100%;細(xì)胞活力促進(jìn)率(promoting rate，PR)=［實(shí)驗(yàn)組A值－對(duì)照組A值］/對(duì)照組A×100%。

3.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力 將饑餓的細(xì)胞消化收集并計(jì)數(shù)，按每個(gè)小室5×104個(gè)細(xì)胞接種，上室中為含細(xì)胞的無(wú)血清的DMEM/MEM培養(yǎng)基，下室加入600 μL含10%血清的 DMEM/MEM培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)12 h，取出Transwell小室，用4%多聚甲醛固定20 min，結(jié)晶紫染色，棉棒擦凈未穿透微孔濾膜的上室細(xì)胞，100倍倒置顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，計(jì)數(shù)視野中的細(xì)胞數(shù)，以穿膜的細(xì)胞數(shù)表示細(xì)胞的遷移能力。制備無(wú)血清DMEN/MEM培養(yǎng)基與Matrigel膠1∶9比例稀釋的膠，每個(gè)小室鋪100 μL膠，4 h后吸出并將饑餓的細(xì)胞消化收集并計(jì)數(shù)，按每個(gè)小室1×105個(gè)細(xì)胞接種，上室中為含細(xì)胞的無(wú)血清的DMEM/MEM培養(yǎng)基，下室加入600 μL含20%血清的DMEM/MEM培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)24 h，取出Transwell小室，后續(xù)操作同前，以穿膜的細(xì)胞數(shù)表示細(xì)胞的侵襲能力。按下列公式計(jì)算遷移抑制率(%)=(對(duì)照組遷移細(xì)胞數(shù)－實(shí)驗(yàn)組遷移細(xì)胞數(shù))/對(duì)照組遷移細(xì)胞數(shù)×100%;遷移促進(jìn)率(%)=(實(shí)驗(yàn)組遷移細(xì)胞數(shù)－對(duì)照組遷移細(xì)胞數(shù))/對(duì)照組遷移細(xì)胞數(shù)×100%。侵襲計(jì)算方法同前。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析或t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Real-time PCR檢測(cè) U87MG、U118MG細(xì)胞GPx1 mRNA表達(dá)的情況

U87MG細(xì)胞的GPx1 mRNA表達(dá)量較內(nèi)參照β-actin的表達(dá)升高約7.60±3.21倍，說(shuō)明U87MG細(xì)胞的GPx1 mRNA含量呈高表達(dá)(P＜0.05)。同時(shí)U118MG細(xì)胞GPx1 mRNA表達(dá)量較β-actin升高約1.26±0.50倍，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明經(jīng)轉(zhuǎn)染處理后，U118MG細(xì)胞的GPx1 mRNA含量呈低表達(dá)，見(jiàn)圖1。

Figure 1.mRNA expression of GPx1 in U87MG cells and U118MG cells detected by real-time PCR.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs U118MG.圖1 Real-time PCR檢測(cè)U87MG和U118MG細(xì)胞GPx1 mRNA的表達(dá)情況

2 Western blotting檢測(cè)轉(zhuǎn)染后U87MG、U118MG細(xì)胞GPx1蛋白表達(dá)的情況

siRNA轉(zhuǎn)染72 h后U87MG細(xì)胞的GPx1蛋白表達(dá)明顯低于對(duì)照組及陰性對(duì)照組，說(shuō)明經(jīng)轉(zhuǎn)染處理后，U87MG細(xì)胞的GPx1蛋白含量明顯降低(P＜0.05)。同時(shí)pcDNA3.1-GPx1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染72 h后U118MG細(xì)胞GPx1蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組及陰性對(duì)照組，說(shuō)明經(jīng)轉(zhuǎn)染處理后，U118MG細(xì)胞的GPx1蛋白表達(dá)明顯升高(P＜0.05)，見(jiàn)圖2。

Figure 2.The protein expression of GPx1 in U87MG cells and U118MG cells interfered with the siRNA or pcDNA3.1 detected by Western blotting.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs blank control group(Ctrl)or negative control group(NTC).圖2 Western blotting檢測(cè)siRNA作用U87MG細(xì)胞和pcDNA3.1作用U118MG細(xì)胞后GPx1蛋白的表達(dá)情況

3 MTS實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力的變化

siRNA下調(diào)組24 h、48 h、72 h細(xì)胞活力抑制率分別為25.9%、35.7%、34.8%。siRNA組 U87MG細(xì)胞活力較空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組明顯降低(P＜0.05)。質(zhì)粒上調(diào)組24 h、48 h、72 h細(xì)胞活力促進(jìn)率分別為22.7%、45.8%、39.8%。質(zhì)粒組U118MG細(xì)胞的活性較空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組明顯升高(P ＜0.05)，見(jiàn)表1～2。

表1 siRNA下調(diào)GPx1對(duì)U87MG細(xì)胞活力的影響Table 1.The effect of down-regulating the expression of GPx1 by the specific siRNA on the activity of U87MG cells(Mean±SD.n=3)

表2 質(zhì)粒上調(diào)GPx1對(duì)U118MG細(xì)胞活力的影響Table 2.The effect of up-regulating the expression of GPx1 by pcDNA3.1-GPx1 on the activity of U118MG cells(Mean±SD.n=3)

4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移和侵襲能力

siRNA轉(zhuǎn)染后，U87MG細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯下降，各組穿膜細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，細(xì)胞遷移抑制率為41.6%±8.2%，細(xì)胞侵襲抑制率為40.4% ±10.1%;質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后U118MG細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著升高，各組穿膜細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，細(xì)胞遷移促進(jìn)率為55.8% ±9.8%，細(xì)胞侵襲促進(jìn)率為60.8% ±9.2%，見(jiàn)圖3、4及表3、4。

Figure 3.The effect of down-regulating the expression of GPx1 by the specific siRNA on the migration and invasion of U87MG cells(×40).圖3 siRNA下調(diào)GPx1基因?qū)87MG細(xì)胞的遷移與侵襲能力的影響

Figure 4.The effect of up-regulating the expression of GPx1 by pcDNA3.1-GPx1 on the migration and invasion of U118MG cells(×40).圖4 質(zhì)粒上調(diào)GPx1基因?qū)118MG細(xì)胞的遷移與侵襲能力的影響

表3 siRNA下調(diào)GPx1對(duì)U87MG細(xì)胞遷移與侵襲能力的影響Table 3.The effect of down-regulating the expression of GPx1 by the specific siRNA on migration and invasion of U87MG cells(Mean±SD.n=3)

表4 質(zhì)粒上調(diào)GPx1對(duì)U118MG細(xì)胞遷移與侵襲能力的影響Table 4.The effect of up-regulating the expression of GPx1 by the pcDNA3.1－GPx1 on migration and invasion of U118MG cells(Mean±SD.n=3)

討 論

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療仍以手術(shù)切除為主，同期放化療或其它治療為輔，但因其高度侵襲性和異質(zhì)性決定任何單一的治療方法都有一定的局限性，探索新的治療方法迫在眉睫［11］。

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比上調(diào)GPx1表達(dá)后U118MG細(xì)胞的活力、遷移和侵襲能力均有促進(jìn)作用;相反的，下調(diào) GPx1的表達(dá)后U87MG細(xì)胞的活力、遷移和侵襲均有抑制作用。由上述結(jié)果可以看出GPx1的表達(dá)狀態(tài)對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的活力、遷移和侵襲能力有著明顯的調(diào)控作用，具體機(jī)制仍然不清楚。生理情況下，機(jī)體內(nèi)的自由基能夠通過(guò)濃度改變引起細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、壞死的功能，調(diào)節(jié)著機(jī)體細(xì)胞的生死平衡［12-13］。研究發(fā)現(xiàn)GPxs、ROS的異常表達(dá)常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密不可分的關(guān)系［2-3，10］。Szatrowski等［14］研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞較正常細(xì)胞產(chǎn)生更多的活性氧化物或其中間產(chǎn)物，以致腫瘤變異，損傷局部正常組織，向周圍組織侵襲，發(fā)生轉(zhuǎn)移?？赡苁歉弑磉_(dá)的GPx1過(guò)多清除活性氧簇，降低了ROS對(duì)本就比正常細(xì)胞耐受的高應(yīng)激狀態(tài)的腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，同樣有研究指出低濃度的ROS能夠激活轉(zhuǎn)錄因子以及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和分化［13］。膠質(zhì)瘤的侵襲是一個(gè)多步驟的復(fù)雜過(guò)程，包括腫瘤細(xì)胞黏附，細(xì)胞外基質(zhì)降解及細(xì)胞移動(dòng)等，細(xì)胞外基質(zhì)的降解是關(guān)鍵?；|(zhì)金屬蛋白酶2和尿激活型纖溶酶原在惡性膠質(zhì)瘤中表達(dá)，均介導(dǎo)細(xì)胞周圍基質(zhì)蛋白的降解，均與膠質(zhì)瘤的侵襲性和血管生成有密切關(guān)系［15-16］。研究發(fā)現(xiàn)高表達(dá)GPx1的腫瘤細(xì)胞中伴有基質(zhì)金屬蛋白酶2和尿激酶型纖溶酶原激活因子蛋白的表達(dá)升高［4］。推測(cè)其可能通過(guò)激活基質(zhì)金屬蛋白酶2和尿激酶型纖溶酶原激活因子通路促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，siRNA組細(xì)胞遷移抑制率為40% ～50%，細(xì)胞侵襲抑制率為40% ～50%;質(zhì)粒上調(diào)組細(xì)胞遷移促進(jìn)率為50% ～60%，細(xì)胞侵襲抑制率為50%～70%?？梢?jiàn)GPx1的表達(dá)對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的遷移和侵襲能力影響顯著。siRNA下調(diào)GPx1后對(duì)24 h、48 h、72 h細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為25% ～35%，同時(shí)質(zhì)粒上調(diào)組24 h、48 h、72 h細(xì)胞增殖促進(jìn)率20% ～40%。相較而言，下調(diào)GPx1抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖效果不理想，考慮可能因?yàn)槟z質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞高氧化應(yīng)激耐受。也可能因?yàn)榱蜓趸€原蛋白還原酶在惡性腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)有著重要的作用［10］。望能夠通過(guò)后續(xù)研究驗(yàn)明作用機(jī)制后可以提高其有效性。

綜上，本研究結(jié)果表明通過(guò)小干擾RNA成功下調(diào)GPx1表達(dá)，能夠抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，并顯著抑制細(xì)胞遷移和侵襲能力，對(duì)臨床上抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的生長(zhǎng)，特別是腫瘤轉(zhuǎn)移的治療有著重要的意義。

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