薏苡葉黑斑病病原菌分離鑒定和生物學特性的初步研究*

李雪玲，楊海艷，陳華紅

(楚雄師范學院化學與生命科學學院，云南 楚雄 675000)

薏苡 ［Coix lachrymajobi L.var.mayuen(Roman)Stapf］，禾本科草本植物。薏苡的營養(yǎng)價值很高，被列為防癌食品之一［1］。作為一種營養(yǎng)價值較高的糧食作物和藥用植物，薏苡在全國各個地方都有廣泛栽培。目前，對薏苡的研究主要集中在藥用和保健方面的作用機理［2—6］、薏苡植株中的提取物及其藥效［7—9］和抗癌方面［10—12］，而對薏苡栽培過程中病害的研究相對較少［13］。近幾年來，隨著薏苡經(jīng)濟價值的不斷攀升，薏苡的栽培面積和栽培規(guī)模迅速擴大，導致薏苡黑斑病的發(fā)生非常嚴重，使薏苡的產(chǎn)量和質量都受到了很大的影響。為此，要防治薏苡黑斑病，首要的工作應對薏苡黑斑病病原菌進行分離鑒定，了解該菌的生長特性，以期對該病進行有效的防治。

1.材料和方法

1.1 病原菌的分離

薏苡黑斑病病葉采自云南省楚雄州元謀縣，用組織分離法分離到一株真菌菌株，菌株編號為CX098。

1.2 病原菌形態(tài)學和分子生物學鑒定［14］

1.3 生物學特性研究［15，16］

1.3.1 不同碳源和氮源對菌落生長的影響

1.3.2 不同溫度對菌落和分子孢子萌發(fā)的影響

1.3.3 不同pH對菌落和分子孢子萌發(fā)的影響

1.3.4 不同光照處理

1.4 不同殺菌劑對菌落生長的影響［17］

2.結果與結論

2.1 CX098病原菌的鑒定

2.1.1 形態(tài)學鑒定

該病害發(fā)病初期葉片中部出現(xiàn)黑色小斑點，隨著時間的推移，葉片逐漸分布到整個葉片，嚴重時病斑相互匯合，使整個葉片枯萎掉落。在PDA培養(yǎng)基上，菌落邊緣青綠色，最中心灰白色，圓形、規(guī)則，菌絲絮狀，邊緣整齊;背面褐色，菌落生長緩慢，28℃培養(yǎng)6 d后直徑3.7cm (圖1)。菌絲淺褐色到褐色，有隔。分生孢子梗短，簡單，楔狀，從菌絲側面長出，近于無色，孢子梗長×寬為 (6.2～41)μm× (1.8～6.7)μm。分生孢子單生，頂生，大多為幾個細胞 (多隔孢子或磚隔孢子);形狀大多為寬橢圓形，長圓形到梨形或不規(guī)則形狀大小3.6～16.3×2.1～8μm(平均12.6×4.2μm);分生孢子通常由分生孢子梗的壁破裂而分離 (圖2，圖3)。

圖1 病原菌在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài) (A:PDA培養(yǎng)基正面;B:PDA培養(yǎng)基背面)Fig.1 Conial morpholoy of pathogen on the PDA medium(A.The front of PDA medium;B.The back of PDA medium)

圖2 病原菌分生孢子Fig.2 Conidia of pathogen

圖3 病原菌分生孢子和分生孢子梗 (40倍鏡下觀察)Fig.3 Conidiophores and conidia of pathogen

2.1.2 病原菌rDNA—ITS序列分析

用BioEdit、Clustal x和MEGA 4.1軟件采用NJ法進行系統(tǒng)分析，構建系統(tǒng)進化樹 (圖4)。結果表明與其遺傳距離較近的有5個種，屬內(nèi)節(jié)點支持率為1.00，結合其形態(tài)特征的觀察研究，初步判斷供試菌株cx098為鏈格孢屬真菌 (Alternaria sp.)。

圖4 基于5.8S rDNA－ITS堿基序列構建的系統(tǒng)樹Fig.4 Phylogenetic tree based on 5.8S rDNA －ITS sequence

2.2 CX098菌株對不同氮、碳源的利用

對供試的7種氮源和碳源CX098菌株均能利用。最適氮源和碳源分別是蛋白胨和葡萄糖。不同氮源和碳源對CX098菌株生長速度有顯著影響 (表1)。

表1 不同氮源和炭源對菌株生長速度的影響Table 1 Effect of different nitrogen and carbon sources on the strain growth speed

2.3 CX098菌株在不同光照下的生長狀況

全光照、黑暗處理與12 h光/暗交替處理差異極顯著，其中12 h光/暗交替處理能促進菌落生長，全光照和黑暗處理菌絲生長相對較緩慢。分生孢子在有光或無光照條件下均能萌發(fā) (表2)。

表2 不同光照對菌落和孢子萌發(fā)的影響Table 2 Effect of different light on colony and the spore germination

2.4 CX098菌株生長和孢子萌發(fā)在不同溫度下的狀況

試驗結果表明，該病原菌在15～40℃范圍內(nèi)均能生長，最適菌株的生長溫度和孢子萌發(fā)溫度均為28℃。溫度高于45℃菌絲和孢子均不能繼續(xù)生長和萌發(fā) (表3)。

表3 溫度對菌落生長和孢子萌發(fā)的影響Table 3 Effect of temperature on mycelial growth and spore germination

2.5 不同pH對CX098菌落生長和孢子萌發(fā)的影響

試驗結果表明，該菌生長最適宜的pH為pH6.0－7.0，與其他處理在5%水平存在顯著差異。孢子適宜在微酸性環(huán)境下萌發(fā)，pH 6.0時孢子萌發(fā)率最高，pH 6.0時的孢子萌發(fā)率與pH 5.0、pH 7.0、pH 8.0時孢子萌發(fā)率在5%水平存在顯著差異，與其他處理達到極顯著差異 (表4)。

表4 pH對菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響Table 4 Effect of pH on mycelial growth and spore germination

2.6 不同殺菌劑對CX098菌株的抑制作用

在供試的5種廣譜殺菌劑處理條件下，CX098菌株的生長均受到抑制。抑制效果為撲海因＞代森錳鋅＞百菌清＞惡霜錳鋅＞敵克松。撲海因、代森錳鋅的抑菌效果在5%差異水平與惡霜錳鋅、百菌清達到差異顯著，與敵克松達到極顯著差異 (圖5)。

圖5 不同殺菌劑對菌絲生長的影響Fig.5 Effect of different getrmicides on mycelial growth

3.結論

真菌的系統(tǒng)發(fā)育和分類鑒定研究中廣泛應用核酸序列及其結構基因的分析［18］。本文中薏苡葉片黑斑病病原菌的形態(tài)學特征觀察與分子生物學分析結果相互吻合為鏈格孢屬Alternaria sp.。供試的所有碳源和氮源均能被該菌利用，光暗交替利于該菌的菌絲生長，最高溫度為28℃;光照和微酸環(huán)境利于分生孢子萌發(fā)，撲海因和代森錳鋅對其生長有明顯的抑制作用，可選用此類藥劑防治由鏈格孢引起的薏苡黑斑病。

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