睪丸支持細胞對精原干細胞作用因子研究進展

鄧偉民孫大林綜述 金保方審校

1. 南京中醫(yī)藥大學（江蘇南京 210046）；2. 東南大學附屬中大醫(yī)院中西醫(yī)結合男科

睪丸支持細胞對精原干細胞作用因子研究進展

鄧偉民1孫大林2綜述 金保方2審校

1. 南京中醫(yī)藥大學（江蘇南京 210046）；2. 東南大學附屬中大醫(yī)院中西醫(yī)結合男科

輔助生殖技術的迅速發(fā)展，使得男性不育癥患者在治療上的困境得到了很大的改善，但是仍然有許多不育癥患者由于無精子癥等問題無法完全解決。精原干細胞（Spermatogonial Stem cells， SSCs）位于睪丸生精小管基底膜上，是體內處于自然狀態(tài)條件下唯一可將遺傳信息傳至子代的干細胞。既能通過自我更新維持數量的穩(wěn)定，也能通過基因或者信號的調節(jié)達到自我分化，最終產生精細胞。SSCs自我更新和分化之間的動態(tài)平衡，保證了雄性生命過程中持續(xù)進行的精子發(fā)生，如果該平衡被破壞則有可能導致精子生成的障礙：過度增殖則導致生殖細胞瘤的產生，而過度分化則導致雄性的不育［1］。所以SSCs的廣泛研究為臨床上無精子癥的患者帶來希望，同時也為于少、弱、畸精子癥（OAT）患者的臨床治療帶來指導意義。

睪丸支持細胞（Sertoli Cells，SCs）是1865年被德國組織學家Entico Sertoli第一次發(fā)現(xiàn)的，并進行了詳細描述，它是體細胞中唯一與生精細胞接觸的，具有獨特的形態(tài)結構：在光鏡下細胞輪廓清晰，電鏡下呈上窄下寬的不規(guī)則錐體形，頂端可達生精小管管腔，基底部緊貼基膜，呈橢圓形或錐形的細胞核，也有的核呈分葉狀，核膜常皺縮，胞質含量高，含有較多的細胞器以及大量的脂滴，并還有組織有序、功能十分活躍的骨架。相鄰SCs靠近基底膜處存在緊密連接，該緊密連接是參與形成睪丸血-睪屏障的一部分，借助它的封閉作用，能將生精小管分為近管腔的近腔室和近基底部的基底室。

現(xiàn)已證實，SCs主要作用是提供營養(yǎng)給各級生精細胞、參與并調控生精細胞自我更新和分化之間的穩(wěn)定，使精子能夠有序和持續(xù)的進行發(fā)生。因此，SCs可以稱作是生精細胞的“保姆細胞”，在精子的生成過程中起著至關重要的作用，本文就SCs對SSCS的作用以及主要相關作用因子進行綜述。

一、SCs與SSCs關系及對其作用

（一） SCs是包括SSCs在內的各級生精細胞發(fā)育的支架

睪丸內部生精小管主要由SCs和SSCs兩種細胞構成， SSCs有很強的自我更新能力和較高的分化潛能，以及向子代傳遞遺傳信息的特殊功能。SSCs的自我更新和分化在SCs分泌的各種因子調控下有序而精確的進行。SSCs以及處于分化前期的精原細胞位于基底室內，處于分化后期的精母細胞則位于近腔室內，精子成熟之后再從近腔室的頂端釋放進入到管腔內部。所以說，SCs是包括SSCs在內的各級生精細胞發(fā)育的支架。而且，SCs所形成的獨特而封閉的局部微環(huán)境也是生精細胞進行分化和更新活動的必需場所。

（二）SCs是SSCs特定發(fā)育環(huán)境的主要結構和調控者

在哺乳動物睪丸內的組織結構可以分為生精小管和管外間質組織。生精小管由管腔和生精上皮構成， SCs存在于生精上皮， 主要為精子生成提供特定微環(huán)境及免疫豁免環(huán)境。維持免疫豁免功能首先是SCs通過緊密連接，形成一層物理屏障，即血睪屏障（blood testis barrier，BTB）。BTB由相鄰支持細胞之間的緊密連接復合體在青春期開始形成，使生精小管內形成特殊免疫豁免區(qū)域。為精子的產生提供不受機體免疫系統(tǒng)干擾的微環(huán)境。精子產生的過程中，在細胞黏附和運動中構成緊密連接的蛋白質分子參與細胞信號轉導和轉錄調控。這些分子的研究，有利于闡明生精過程中SCs緊密連接的重構作用、促進生精細胞發(fā)育以及精母細胞通過血-睪屏障的機制。

SSCs移植研究證明［2］，基底室是SSCs能進行自身維持的唯一場所， 因此能推斷出基底室可能就是SSCs 的特定發(fā)育微環(huán)境，它由支持細胞及其連接、細胞外基質、管周肌樣細胞、生精小管基膜等構成。研究表明， 將野生型小鼠的SCs向不育小鼠的睪丸內移植，使得不育小鼠重新可育，表明SCs在SSCs的維持、更新及分化等過程中具有不可替代的功能［3］。因此，SCs是SSCs 特定發(fā)育環(huán)境的主要結構和調控者。

睪丸微環(huán)境主要包括各種調控精原干細胞的增殖和分化因子，如由支持細胞分泌的GDNF、FGF2等， 間質細胞分泌的CSF1、睪酮等， 以及血液及周圍體液含有的Neuregulin 1、Activin A、BMP4和SOHLH等因子。同時，也標明了精原干細胞及其相鄰細胞的相對位置， 如支持細胞、管周肌樣細胞等形成的基底室結構，見圖1。

圖1 簡潔地表示了SCCs與SCs以及睪丸微環(huán)境間的關系

二、SCs產生的調節(jié)SSCs 發(fā)育的主要因子

（一）膠質細胞源性神經生長因子

膠質細胞源性神經生長因子（glial cell line derived neurotrophic factor，GDNF）是由SCs分泌的，屬于轉化生長因子-β （transforming growth factor-β，TGF-β）家族的中的一個亞族，是含有134個氨基酸殘基的糖基化二硫鍵結合的同源二聚體蛋白。SSCs 表達的GDNF 受體復合物包括GDNF家族受體α1（GDNF family receptor alpha1，GFRα1）和酪氨酸激酶Ret受體。在SSCs、神經干細胞等多種細胞的發(fā)育、分化，GDNF均有調節(jié)作用并貫穿個體的整個生命過程［4］。已有報道證實GDNF 信號途徑對SSCs 自我更新和分化之間的作用是決定性的［5］。敲除GDNF 的基因小鼠可以存活，但小鼠的SSCs 卻會逐漸地消失。相反， GDNF 表達過多則會因未分化精原細胞數量增多而導致生殖細胞瘤。

在人幼年和成年的睪丸中，GDNF 于SCs、Leydig 細胞、精母、精子細胞以及一些微小動脈血管壁的平滑肌表達。GDNF 的表達不僅受到成纖維細胞生長因子2（fi broblast growth factor 2，F(xiàn)GF2）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和人白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）等物質的調控外，還受到卵泡刺激素（ follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH） 的調控。所以，GDNF 的表達受到整體和局部的雙重調控［5］。GDNF 主要通過三方面調控SSCs［6］：（1）GDNF可參與精子發(fā)生過程，GDNF還參與調控SSCs 增殖和分化的旁分泌。小劑量的GDNF 會導致SSCs 過度分化和損耗； 而大劑量的GDNF則會促進SSCs 的增殖而抑制其分化。（2） GDNF參與睪丸的發(fā)育，SCs分泌GDNF，并以自分泌方式促進SCs的成熟和分裂，從而促進睪丸發(fā)育。（3）GDNF 促進血睪屏障的形成，用以構成SSCs的微環(huán)境。管周肌樣細胞分泌GDNF，毛細血管內皮細胞表達GDNF 的受體GFRα1（GDNF family receptor alpha1，GFRα1） ，GDNF 作用于毛細血管內皮細胞的方式是旁分泌，既促進其增殖，又可以形成細胞間的緊密連接，是通過促進毛細血管內皮達到的［7］。

（二）干細胞因子

干細胞因子（stem cell factor， SCF）是SCs的分泌產物之一，是原癌基因c-Kit受體的配體［8］。c-Kit受體蛋白是酪氨酸激酶的受體之一。將自然生長型的生殖細胞移植到Steel/Steeldickie小鼠睪丸中仍然可以形成集落，但其并不能更進一步分化，這表明SCF與c-Kit結合對于維持精原細胞的分化是必不可少的，出生后的個體精原細胞的增殖、分化中也同樣受到SCF/ c-KIT系統(tǒng)調控。在小鼠精原細胞群體中，c-KIT受體表達于正在分化中的精原細胞，而未分化型精原細胞和SSCs 中卻不表達或很少表達［9］。同時更多資料表明，SCF /c-Kit 系統(tǒng)可以通過不同的途徑調節(jié)SSCs的自我更新和增殖： 通過使拉巴霉素敏感的PI3K → AKT→ mTOR → p70S6K → CyclinD3 → cdk4，cdk6 →Rb 發(fā)生磷酸化，SCF /c-Kit 系統(tǒng)使c-Kit陽性SSCs 從G1 期向S 期過渡，若阻斷PI3K與c-Kit 結合，可導致精子生成障礙，造成男性不育。研究發(fā)現(xiàn)MEK通路也可調控生精過程，SCF /c-Kit 系統(tǒng)激活MEK→Erk1 /2→CyclinE，CyclinA2→cdk2→拮抗Rb 磷酸化，控制生精過程的進程，使用U0126可以阻斷MEK 通路，導致SCF 誘導的促有絲分裂過程的中斷［10］。

（三）轉錄因子Ets 差異基因5

轉錄因子Ets 差異基因5（Ets variant gene 5，Etv5）是由Sertoli 細胞分泌的一種轉錄因子，是ETS家族的一個成員，而ETS家庭是一個大型轉錄基因家庭，他們在細胞生理學上的不同方面發(fā)揮作用：包括細胞遷移、增殖、分化、凋亡和癌變細胞相互作用［11］。ETV5在未成年和成年人體內組織內有著廣泛的影響［12］，包括睪丸和卵巢［13，14］。在老鼠和人類細胞中，ETV5定位的區(qū)域在精原干細胞和支持細胞［15］。小鼠模型研究表明，ETV5是男女生育必不可少的基因［16］，破壞小鼠Etv5 基因，可導致SSCs 缺失，造成唯支持細胞綜合征（SCOS）和無精子癥。運用微陣列分析法，同野生型（WT）小鼠相比較，Etv5（Etv5-/-）敲除的小鼠，幾種趨化因子表達量和原始生殖細胞（primordial germ cells，PGCs）的遷移明顯減少［17］。Chen 等［12］運用微陣列分析Etv5 缺失小鼠的原始SCs，發(fā)現(xiàn)調節(jié)造血干細胞龕（niche）的一些保守因子發(fā)生改變，基質細胞源性因子12（stromal cellderived factor12，Cxcl12）、Cxcl15 等趨化因子大量減少，這些趨化因子可能是調控SSCs 自我更新的信號分子。Morrow等研究表明［18］，Etv5 基因的缺失，可能通過影響SCs的功能，進而造成SSCs 缺失，其作用機制可能是通過降低突變鼠claudin5 蛋白水平，進而導致血睪屏障的損傷。

（四）骨形態(tài)發(fā)生蛋白4

骨形態(tài)發(fā)生蛋白4 （bone morphogenetic protein-4，Bmp4），是轉化生長因子β（transforming growth factor β，TGF-β）家族中不可或缺的一員，多種細胞的增殖和分化在胚胎發(fā)育時期均受到其調控作用，又因其能在異位誘導骨和軟骨的形成而得名［19］。Bmp4基因敲除的小鼠會導致中胚層發(fā)育缺陷而引起胚胎性死亡。通常由細胞內信號轉導蛋白Smad介導Bmp4信號轉導通路，Bmp4通過絲氨酸/蘇氨酸激酶受體（TβR II）結合后，再與TβR-I受體相結合形成復合物。

Carlomaqno等［20］發(fā)現(xiàn)Bmp4可促進大鼠SSCs的分化，并能改變細胞粘附特性。據報道，雄性小鼠的Bmp4由SCs產生，有調控精原細胞的分化的作用，可能是通過c-Kit基因的表達實現(xiàn)的［21］。小鼠中除精子細胞不表達外，精原細胞、精母細胞和支持細胞均表達Bmp4；是因為受體在精細胞中表達，而在精母和精子細胞中不表達。李毅、郝晶等實驗［22］，使用添加Bmp4的培養(yǎng)基培養(yǎng)SSCs，通過提高Bmp4的濃度達到激活Bmp4/Smad信號通路，促進細胞分化。提出了Bmp4/Smad信號通路可能是通過上調靶基因sohlh2的活性來激活并促進小鼠SSCs的分化。

（五）染色質修飾獨立基因Sin3A

哺乳動物體內SIN3蛋白復合物在基因表達的過程中執(zhí)行多種功能，如：影響核小體重塑，并介導DNA損傷修復和復制時間等。而其中的Sin3A（Chromatin modifi er Swi-independent 3a，Sin3A）連同相關的組蛋白去乙酰化酶，影響細胞的特異性轉錄因子在發(fā)育和分化過程中的表達，Sin3A是維護大量內細胞所必不可少的，如小鼠囊胚細胞，胚胎成纖維細胞，成肌細胞等。在有絲分裂中Sin3A基因特異性敲除的SCs可以支持精子發(fā)生的早期階段，但在分化期，這種細胞是無法引導單倍體的精子細胞的伸長過程。

Payne等［23］，在SCs胚胎期基因敲除Sin3A， Sin3A特異性缺失的SCs導致出生后一些未分化精原細胞的形成，同時維持最初的分化狀態(tài)。在早期，突變體睪丸的SSCs逐漸喪失分化能力，精細胞生長被限制，同時伴隨著大量的生殖細胞衰退。損失Sin3A基因的小鼠會導致SCOS的表型，Miyamoto等的研究［24］，通過編碼區(qū)基因分析80例Sin3A缺失日本患者，缺乏Sin3A會導致SCOS造成人類無精子癥。這些結果表明，Sin3A的缺失以一個特定的方式損害SCs的分子行為，影響了雄性動物睪丸微環(huán)境，進而導致SSCs的生成障礙。導致Sin3A的缺失引發(fā)DNA損傷的機制目前未知。目前的研究顯示［25］，一個哺乳動物完整的SIN3復合蛋白需要適當的臂間異染色質化，Sin3A缺失可能與Sds3蛋白導致染色體分離現(xiàn)象相關，這可能是導致染色體破損的機制。

（六）CXCL12/CX4R系統(tǒng)

CXCL12是由睪丸支持細胞分泌并表達的基因編碼的一種趨化因子，與CXCR4受體相結合并參與精原干細胞自我更新和維持的調控。CXCR4的還原作用，是在未分化的小鼠精原細胞的培養(yǎng)中，通過CXCR4特異性抑制劑和 CXCL12抗體阻斷劑，導致了SSCs的死亡，而CXCR4通路的抑制作用，是通過在成年小鼠睪丸中注射CXCR4特異性抑制劑，破壞了SSCs的自我維持，導致了生殖細胞的損失。GDNF和FGF2都可以調節(jié)CXCR4 的mRNA在thy1c SSCs培養(yǎng)上的表達。運用微陣列基因分析顯示，CXCL12/ CXCR4通路的中斷導致的FGF-2數量顯著降低［26］，這表明CXCL12，F(xiàn)GF-2和GNDF形成對SSCs自我更新影響的合作網絡。此外，CXCR4還參與胚胎發(fā)育階段原始生殖細胞歸巢和出生后SSCs在睪丸微環(huán)境的種系回歸［6］。SCs中Sin3A特異性缺失導致結構上一些未分化的精原細胞的形成。趨化因子CXCL12及其受體CXCR4在新生期睪丸特異性缺失sin3a的SCs中未被檢測到［23］，表明CXCL12/CXCR4的系統(tǒng)影響SSCs微環(huán)境的建立，進而影響SSCs。

（七）其他因子

除以上因子外SCs還分泌許多因子影響精原干細胞，如白細胞介素IL-1α、IL-6，集落刺激因子CSF-1，胰島素樣生長因子IGF-1，表皮生長因子EGF，生長因子FGF-2等等。如圖1所示GDNF、FGF-2、EGF、CSF-1 以及IGF-1 是構成精原干細胞微環(huán)境的主要細胞因子，它們共同調節(jié)并控制精原干細胞的生存的能力。

三、小結與展望

在睪丸成體細胞中，SCs對SSCs的影響最大，SCs為包括SSCs在內的各級生精細胞提供了發(fā)育的外部支架之外，還為其中的生精細胞提供了生長發(fā)育的微環(huán)境。作為“保姆細胞”的SCs通過分泌各類因子及物質對SSCs的自我更新和分化進行精確的調節(jié)，同時為SSCs提供了特殊的免疫豁免環(huán)境。SCs還能通過調控其他成體細胞，從而間接影響SSCs的功能，在精子發(fā)生中發(fā)揮著無可替代的作用。

SSCs 的研究也是近年來的熱點和重點，現(xiàn)如今人的SSCs 的體外培養(yǎng)體系已經建立［2］，解決了人SSCs 體外繁殖的問題。最近研究表明［27］，小鼠的組織體外培養(yǎng)可以支持精子的發(fā)生，但是通過體外的一些研究只能說明GDNF 在調控精子發(fā)生過程中起到很重要的作用，也就是說，在體外FGF-2，IL，IGF-I，EGF，CSF-1 等對于SSCs的作用需要進一步的研究。研究人員對SSCs微環(huán)境定位的主要困難是SSCs的數量稀少，并且缺少特異性分子標記，所以尋找SSCs特異性生物標志物和建立可靠的分選方法依然是SSCs 的重要研究方向之一。所以，建立一個安全有效的能將人類SSCs 誘導成精子的體外誘導體系并大量運用于臨床實踐，是實現(xiàn)SSCs 在人類輔助生殖上應用迫切需要解決的問題。

致謝：本文受國家自然科學基金（81273760；81473678）；國家自然科學基金青年基金（81403402；81302969）基金項目資助

不育，男性； 精原干細胞； 塞爾托利細胞

1 Singh SR， Burnicka-Turek O， Chauhan C， et al. J Cell Mol Med 2011； 15（3）： 468-483

2 He Z， Kokkinaki M， Jiang J， et al. Biol Reprod 2010；82（2）： 363-372

3 金波. 長春： 吉林大學畜牧獸醫(yī)學院， 2012； 6： 1

4 Buageaw A， Sukhwani M， Ben-Yehudah A， et al. Biol Reprod 2005； 73（5）： 1011-1016

5 Oatley JM， Avarbock MR， Brinster RL. J Biol Chem 2007； 282（35）： 25842- 25851

6 Kanatsu-Shinohara M， Inoue K， Takashima S， et al. Cell Stem Cell 2012； 11（4）： 567-578

7 李冬梅， 秦曉東. 中華男科學雜志 2013； 19（11）： 963-967

8 Caires K， Broady J， McLean D. J Endocrinol 2010；205（2）： 133-145

9 Dadoune JP. Folia Histochem Cytobiol 2007； 45（3）： 141-147

10 Berruti G. Front Biosci 2006； 11： 2144-2156

11 Sharrocks AD. Nat Rev Mol Cell Biol 2001； 2（11）： 827-837

12 Liu Y， Jiang H， Crawford HC， et al. Dev Biol 2003；261（1）： 10-24

13 Chen C， Ouyang W， Grigura V， et al. Nature 2005；436（7053）： 1030-1034

14 O'Bryan MK， Grealy A， Stahl PJ， et al. Fertil Steril 2012；98（4）： 827-35.e1-3

15 Tyagi G， Carnes K， Morrow C， et al. Biol Reprod 2009；81（2）： 258-266

16 Eo J， Shin H， Kwon S， et al. Mol Hum Reprod 2011；17（9）： 568-576

17 Simon L， Ekman GC， Garcia T， et al. Stem Cells 2010；28（10） ： 1882-1892

18 Morrow CM， Tyagi G， Simon L， et al. Biol Reprod 2009；81（5）： 871-879

19 Luyten FP， Cunningham NS， Ma S， et al. J Biol Chem 1989； 264（23）： 13377-13380

20 Carlomaqno G， van Braqt MP， Korver CM， et al. Biol Reprod 2010； 83（5）： 742-749

21 張繼強， 秦達念. 中華男科學雜志 2004； 10（9）： 688-691

22 李毅， 郝晶. 山東大學， 2012， 5

23 Payne CJ， Gallagher SJ， Foreman O， et al. Stem Cells 2010； 28（8）： 1424-1434

24 Miyamoto T1， Koh E， Tsujimura A， et al. Andrologia 2014； 46（3）： 273-276

25 Pellegrino J， Castrillon DH， David G. Dev Biol 2012；369（2）： 349-355

26 Yang QE， Kim D， Kaucher A， et al. J Cell Sci 2013；126（Pt 4）： 1009-1020

27 Sato T， Katagiri K， Gohbara A， et al. Nature 2011；471（7339）： 504-507

（2015-09-18收稿）

10.3969/j.issn.1008-0848.2015.12.017

R 698.2