ZIC1基因在乳腺癌中的表達及其對乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖的影響

李鵬飛，王杰鋒，曹方，楊正府，丁厚中（.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 03；.江蘇大學(xué)附屬昆山醫(yī)院普外科，江蘇昆山 5300）

ZIC1基因在乳腺癌中的表達及其對乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖的影響

李鵬飛1，王杰鋒1，曹方2，楊正府2，丁厚中2
（1.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.江蘇大學(xué)附屬昆山醫(yī)院普外科，江蘇昆山 215300）

目的：探討小腦鋅指結(jié)構(gòu)1（zinc finger of the cerebellum 1，ZIC1）基因在人乳腺癌組織中的表達及其對乳腺癌 MDA-MB-231細胞增殖能力的影響。方法：應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測238例乳腺癌和40例癌旁組織中ZIC1蛋白的表達，并分析其與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。構(gòu)建真核表達載體 pcDNA3.1-ZIC1，通過脂質(zhì)體法瞬時轉(zhuǎn)染乳腺癌MDA-MB-231細胞（實驗組），以未轉(zhuǎn)染細胞和轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空質(zhì)粒細胞分別作為空白對照和陰性對照。采用反轉(zhuǎn)錄 PCR及蛋白質(zhì)印跡法檢測3組細胞中 ZIC1 mRNA及蛋白的表達，采用 MTT法檢測細胞增殖能力的變化。結(jié)果：ZIC1蛋白在乳腺癌組織中的陽性表達率（39.1％，93/238）明顯低于癌旁組織（77.5％，31/40），兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。乳腺癌組織中 ZIC1蛋白的表達與病理分型、組織學(xué)分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0.05）。ZIC1 mRNA和蛋白在實驗組中均有表達，在兩對照組中不表達；與陰性對照組和空白對照組相比，實驗組細胞的增殖能力明顯減弱。結(jié)論:乳腺癌組織中 ZIC1蛋白的陽性表達率明顯下降并與多項臨床病理參數(shù)相關(guān)，轉(zhuǎn)染 ZIC1基因后能夠明顯抑制乳腺癌細胞的增殖，提示 ZIC1基因在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

小腦鋅指結(jié)構(gòu)1基因；乳腺癌；細胞增殖

［Abstract］Objective:To investigate the expression of zinc finger of the cerebellum 1（ZIC1）gene in human breast cancer and its effect on proliferation of breast cancer MDA-MB-231 cell lines.Methods:Immunohistochemical technique was used to examine the expression of ZIC1 protein in 238 specimens of breast cancer and 40 adjacent cancer tissues.The relationship between ZIC1 protein expression and clinicopathological parameters of breast cancer was analyzed.The recombinant eukaryotic expression plasmid pcDNA3. 1-ZIC1 was constructed and transiently transfected into breast cancer MDA-MB-231 cell lines by lipofectamine（experiment group）.For the following experiments，untransfected and pcDNA3.1 plasmid transfected cells were used as control.RT-PCR and western blotting were applied to detect the expression of ZIC1 mRNA and protein in three groups.Cell proliferation was then detected by MTT assay.Results:The positive expression rate of ZIC1 protein in specimens of breast cancer was significantly lower than that in adjacent cancer tissues［39.1％ （93/238）vs 77.5％（31/40），P＜0.05］.The positive expression of ZIC1 protein was correlated with pathological classification，histological grade and lymph node metastasis.Compared with blank control group and negative control group，the expression of ZIC1 mRNA and protein level were positive in experiment group and cell proliferation ability was drastically repressed.Conclusion:Positive expression rate of ZIC1 protein was decreased in specimens of breast cancer.After transfection of ZIC1

gene，the growth of breast cancer MDA-MB-231 cell lines were inhibited，which suggest that ZIC1 gene may play an important role in the occurrence and development of breast cancer.

［Key words］zinc finger of the cerebellum 1 gene；breast cancer；cell proliferation

乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤之一，嚴重危害患者的身心健康。統(tǒng)計顯示，我國乳腺癌的發(fā)病率持續(xù)上升且趨于年輕化，已高居女性癌癥發(fā)病率的第1位，死亡率的第 5位［1］。與其他癌癥一樣，乳腺癌的形成也是多基因、多因素共同作用的結(jié)果［2］。近年來探索乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制，尋找有效的腫瘤分子標志物，一直是科學(xué)研究的熱點。小腦鋅指結(jié)構(gòu)1（zinc finger of the cerebellum gene 1，ZIC1）基因是一種新近發(fā)現(xiàn)的腫瘤相關(guān)基因，與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。目前，國內(nèi)外對ZIC1基因在乳腺癌形成中所發(fā)揮的作用卻鮮見報道。本研究擬檢測 ZIC1基因在乳腺癌中的表達并分析其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。同時，應(yīng)用 pcDNA3.1-ZIC1表達載體及脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染乳腺癌MDA-MB-231細胞，觀察ZIC1基因?qū)DAMB-231細胞增殖能力的影響。

1 材料與方法

1.1 標本來源

收集2007年1月至 2012年12月于昆山市第一人民醫(yī)院行乳腺癌根治術(shù)的238例患者的乳腺癌標本，構(gòu)建含有乳腺癌原發(fā)灶和40例對應(yīng)癌旁乳腺組織的組織芯片。所有患者術(shù)前均未接受放療或化療，術(shù)后病理檢查結(jié)果均經(jīng)2名以上病理醫(yī)師確認，臨床病例資料完整。

1.2 主要試劑

人乳腺癌MDA-MB-231細胞株購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心。羊抗人ZIC1單克隆抗體購自美國 Santa Cruz公司；SP免疫組織化學(xué)試劑盒及 DAB顯色試劑盒購自福州邁新生物公司；Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；RNA提取試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司；BCA蛋白測定試劑盒（增強型）購自上海維奧生物科技有限公司；RIPA裂解液（中）購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.3 免疫組織化學(xué)法檢測 ZIC1蛋白的表達

標本采用鏈霉菌抗生物素蛋白 過氧化物酶連結(jié)（SP）法染色，按照說明書進行實驗，以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。每例標本隨機選取5個高倍鏡視野，按陽性細胞所占百分比和染色強度綜合分析染色結(jié)果［3］。陽性細胞計數(shù):根據(jù)陽性細胞所占5個以上高倍鏡視野比例計數(shù)，＜5％記0分，5％～25％記1分，26％～50％記 2分，51％～75％ 記3分，76％～100％記4分；染色強度分類:淡黃色記1分，黃或深黃色記2分，褐或棕褐色記3分。陽性細胞計數(shù)評分與染色強度評分相乘結(jié)果≥1為陽性，＜1為陰性。

1.4 細胞培養(yǎng)

乳腺癌 MDA-MB-231細胞呈貼壁生長，采用含10％胎牛血清的DMEM，置于37℃、5％CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)、傳代，取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.5 細胞轉(zhuǎn)染及分組

pcDNA3.1-ZIC1真核表達載體由上海吉凱基因公司構(gòu)建。制備 MDA-MB-231單細胞懸液，接種于6孔板，加入含10％胎牛血清的 DMEM，常規(guī)培養(yǎng)24 h。細胞分為 3組:實驗組（轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1-ZIC1質(zhì)粒），陰性對照組（轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空質(zhì)粒）和空白對照組（常規(guī)培養(yǎng)未進行轉(zhuǎn)染），轉(zhuǎn)染步驟按照Lipofectamine 2000說明書進行。轉(zhuǎn)染8 h后更換成含10％胎牛血清的 DMEM，繼續(xù)培養(yǎng) 48 h，部分用于mRNA和蛋白提取，部分用于細胞增殖實驗。

1.6 RT-PCR檢測ZIC1 mRNA的表達

收集轉(zhuǎn)染后48 h的細胞，按照說明書步驟提取總 RNA進行反轉(zhuǎn)錄。ZIC1引物序列:上游為 5′-AAACTGGTTAACCACATCCGC-3′，下游為 5′-CTCAAACTCGCACTTGAAGG-3′；內(nèi)參GAPDH引物序列:上游為5′-GAAGGTGAAGGTCGAAGT-3′，下游為5′-GAAGATGGTGATGGGATTT-3′。擴增條件:95℃預(yù)變性3 min，再行95℃30 s、55℃30 s、72℃60 s，循環(huán) 35次，最后 72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測后觀察結(jié)果。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法檢測 ZIC1蛋白的表達

收集轉(zhuǎn)染后48 h的細胞，提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度后，定量加樣，10％SDS-PAGE分離蛋白樣品，250 mA電轉(zhuǎn)膜 90 min至硝基纖維素膜，5％脫脂奶粉封閉1 h后加入ZIC1一抗（1∶1 000），4℃孵育過夜，將膜取出，TBST洗膜3次，10 min/次，加入TBST稀釋的 HRP標記的二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h后，TBST洗膜 3次，5 min/次，ECL顯色，以β-肌動蛋白作為內(nèi)參對照。

1.8 MTT法檢測細胞增殖

收集轉(zhuǎn)染后 48 h的細胞，制備單細胞懸液，以每孔1×104個細胞接種于96孔板內(nèi)，每組設(shè)3個平行孔，于 37℃、5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于培養(yǎng) 24、48、72 h后加入5 mg/mL的 MTT 10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h后吸去上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，振蕩10 min。于酶標儀492 nm波長處檢測各孔光密度值（D），取3孔平均數(shù)，以時間為橫坐標，D值為縱坐標繪制各組細胞生長曲線。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均應(yīng)用 SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。對于計數(shù)資料，采用 χ2檢驗；對于計量資料，各組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用 LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ZIC1蛋白在乳腺癌組織和癌旁組織的表達

ZIC1蛋白陽性染色呈淡黃色至棕褐色。ZIC1蛋白在乳腺癌組織中多呈陰性表達，而在癌旁組織中多呈陽性表達，見圖1。乳腺癌組織中 ZIC1蛋白的陽性表達率為39.1％（93/238），明顯低于癌旁組織中的陽性表達率 77.5％（31/40），兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=20.462，P=0.000），見表1。

圖1 ZIC1蛋白在乳腺癌和癌旁組織中的表達（SP法 ×400）

2.2 ZIC1蛋白表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，ZIC1蛋白陽性表達與乳腺癌的病理分型、組織學(xué)分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0.05），而與患者年齡、腫瘤大小、雌激素受體、孕激素受體無明顯相關(guān)（P＞0.05），見表1。

表1 乳腺癌中 ZIC1蛋白陽性表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 ZIC1基因表達對乳腺癌 MDA-MB-231細胞增殖的影響

RT-PCR和蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，ZIC1 mRNA和蛋白在實驗組中均有表達，而在陰性對照組及空白對照組中均無表達，見圖 2、3。MTT檢測結(jié)果顯示，細胞培養(yǎng)24 h后，實驗組的細胞生長與陰性對照組及空白對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；培養(yǎng)48 h、72 h后，實驗組的細胞生長較陰性對照組及空白對照組明顯減慢（P均＜0.05），而陰性對照組和空白對照組之間的細胞生長差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P均 ＞0.05），提示 ZIC1基因能夠抑制乳腺癌細胞的生長，見圖4。

圖2 各組細胞中ZIC1 mRNA的表達

圖3 各組細胞中 ZIC1蛋白的表達

圖4 各組細胞的生長曲線

3 討論

Aruga等［4］于1994年在篩選鼠小腦cDNA文庫時發(fā)現(xiàn)ZIC1基因，并于1995年克隆出了人ZIC1基因，兩者高度同源［4-5］。ZIC1基因定位于人類3號染色體長臂2區(qū)4帶（3q24），含有3個外顯子，cDNA全長 3 100 bp，編碼 477個氨基酸，由 5個 Cys2His2型鋅指結(jié)構(gòu)域組成，相對分子質(zhì)量為 48 400［5］。ZIC1蛋白是重要的轉(zhuǎn)錄因子，可識別并結(jié)合富含GC序列的靶基因，組成相互作用的“復(fù)合體”，進而影響靶基因的轉(zhuǎn)錄［6］。早期研究發(fā)現(xiàn)，ZIC1基因在脊椎動物的神經(jīng)系統(tǒng)，尤其是小腦的發(fā)育中起重要作用［7］。近來研究發(fā)現(xiàn)，ZIC1基因在多種腫瘤的形成中起重要作用，但究竟是抑癌基因還是癌基因，目前尚無定論，如在胃癌、結(jié)腸癌、肝癌、甲狀腺癌、子宮內(nèi)膜癌中呈低表達，而在髓母細胞瘤、腦膜瘤、脂肪肉瘤中呈高表達［8-14］。上述研究表明，ZIC1基因在不同腫瘤中的表達差異可能與腫瘤的組織來源即組織特異性有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，ZIC1蛋白在乳腺癌組織中低表達（39.1％，93/238），而在癌旁組織中高表達（77.5％，31/40）。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中ZIC1蛋白的表達與下列因素有關(guān):與組織學(xué)分級呈負相關(guān)，分級越高，表達愈低；與腫瘤的轉(zhuǎn)移呈負相關(guān)，隨著淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移，表達逐步降低；與病理分型相關(guān)，浸潤性非特殊癌中ZIC1蛋白的表達率明顯低于早期浸潤性癌和浸潤性特殊癌，而浸潤性非特殊癌是乳腺癌最常見的類型，約占 80％，分化程度低且預(yù)后較差。上述結(jié)果表明，ZIC1基因與乳腺癌的惡性生物學(xué)行為呈負相關(guān)，推測其參與了細胞內(nèi)許多事件，對抑制乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展具有重要意義。

為進一步研究ZIC1基因在乳腺癌中的作用，我們將已構(gòu)建完成的 pcDNA3.1-ZIC1真核表達載體瞬時轉(zhuǎn)染到MDA-MB-231細胞中。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，ZIC1蛋白在實驗組中表達，而在陰性對照組和空白對照組不表達，與 ZIC1 mRNA的變化一致，說明轉(zhuǎn)染 ZIC1基因后，不但增強了目的基因的轉(zhuǎn)錄，也增強了蛋白的翻譯。在此基礎(chǔ)上，MTT結(jié)果顯示，實驗組細胞的生長較對照組明顯減弱，提示ZIC1基因的表達可抑制乳腺癌細胞的增殖，而兩對照組之間并無明顯差別，從而排除了載體因素導(dǎo)致的細胞增殖能力改變。而 Wang等［15］在胃癌中也有類似結(jié)果，即ZIC1基因的表達可抑制胃癌細胞的增殖。上述結(jié)果進一步提示 ZIC1基因在乳腺癌中具有抑癌基因的作用。

綜上所述，乳腺癌組織中 ZIC1蛋白的陽性表達率明顯下降，轉(zhuǎn)染ZIC1基因后可明顯抑制乳腺癌細胞的增殖，提示ZIC1基因在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。因此，隨著研究的深入，ZIC1基因在乳腺癌中的功能將被逐步揭示，有望成為乳腺癌分子診斷和基因治療的新靶點。

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Expression of ZIC1 gene in breast cancer and its effect on the proliferation of MDA-MB-231 cell lines

LI Peng-fei1，WANG Jie-feng1，CAO Fang2，YANG Zheng-fu2，DING Hou-zhong2
（1.School of Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013；2.Department of General Surgery，Kunshan Hospital Affiliated to Jiangsu University，Kunshan Jiangsu 215300，China）

R737.9

A

1671-7783（2015）01-0053-04

10.13312/j.issn.1671-7783.y140284

李鵬飛（1987—），男，碩士研究生；丁厚中（通訊作者），教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail:dinghouzhong@163.com

2014-11-03 ［編輯］劉星星