靛玉紅吲哚-3-取代物對(duì)肝癌 HepG2細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其機(jī)制

談德斐，郭文潔，夏娟，管廷尉，高靜，姚其正（.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江03；.中國(guó)藥科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京0009）

靛玉紅吲哚-3-取代物對(duì)肝癌 HepG2細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其機(jī)制

談德斐1，郭文潔1，夏娟1，管廷尉1，高靜1，姚其正2
（1.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江212013；2.中國(guó)藥科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京210009）

目的：研究新合成的靛玉紅衍生物吲哚-3-取代物A的體外抗腫瘤作用及可能機(jī)制。方法：以不同濃度的吲哚-3-取代物 A作用于 HepG2細(xì)胞，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力；觀察 HepG2細(xì)胞的集落形成；DAPI染色觀察細(xì)胞核的變化；Annexin-V/PI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；分別采用 JC-1和 Fluo-3/AM染色檢測(cè) HepG2細(xì)胞線粒體膜電位和胞內(nèi) Ca2+含量；蛋白質(zhì)印跡檢測(cè) Bcl-2、Bax的表達(dá)和 Caspase-3、9的活化。結(jié)果：吲哚-3-取代物 A對(duì) HepG2細(xì)胞的抑制作用呈時(shí)間濃度依賴性，且可抑制HepG2細(xì)胞克隆集落的形成。吲哚-3-取代物 A作用于 HepG2細(xì)胞后，細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的核固縮、碎裂等凋亡特征，Annexin-V/PI雙染結(jié)果顯示 HepG2細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡，細(xì)胞凋亡相關(guān)的 Caspase-3、9活化也明顯增加。同時(shí)，吲哚-3-取代物 A處理可降低 Bcl-2的蛋白表達(dá)水平，提高 Bax的蛋白表達(dá)水平，呈濃度依賴性。此外，吲哚-3-取代物A能降低線粒體膜電位并誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載。結(jié)論：吲哚-3-取代物 A能夠誘導(dǎo) HepG2細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與損傷線粒體，活化線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路密切相關(guān)。

靛玉紅吲哚-3-取代物；抗腫瘤；細(xì)胞凋亡；線粒體

［Abstract］Objective:To investigate the anti-tumor effects and possible mechanisms of a novel indole-3-derivate indirubin in vitro.Methods:Human HepG2 cells were exposed to different concentrations of indole-3-derivate A，cell proliferation was detected by MTT assay and cell colony formation of HepG2 cells treated with indole-3-derivate A was also observed.Then the nuclei changes were observed by staining with DAPI and cell apoptosis was detected by Annexin-V/PI staining.Meanwhile，mitochondrial membrane potential and intracellular free Ca2+content were detected with JC-1and Fluo-3/AM staining，respectively. Moreover，the protein levels of Bcl-2，Bax and activation of Caspase-3，9 were examined by western blotting.Results:Indole-3-derivate A inhibited the proliferation and colony formation of HepG2 cells in a doseand time-dependent way.Besides that，it was found that nucleus morphology was showing pyknosis and fragmentation and early apoptotic cells were significantly increased by Annexin-V/PI staining after indole-3-derivate A treatment.Moreover，western blotting showed indole-3-derivate A activated Caspase-3，9，decreased the expression of Bcl-2 and increased the expression of Bax in a dose-dependent manner.In addition，indole-3-derivate A caused a loss of mitochondrial membrane potential and intracellular Ca2+overloading.Conclusions:Indole-3-derivate A could significantly inhibit proliferation of HepG2 cells and the mechanisms might be related to mitochondria dysfunction and activation of mitochondria-dependent apoptotic pathway.

［Key words］indole-3-derivate indirubin；antitumor；apoptosis；mitochondria

肝癌致死率占世界癌癥相關(guān)死亡的第3位［1］。而且，僅有10％～25％的肝癌患者適合手術(shù)治療［2］，且仍有復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。因此，研發(fā)治療肝癌的特異性藥物勢(shì)在必行。國(guó)內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸龍薈丸對(duì)治療慢性粒細(xì)胞白血病具有明顯療效，其中的中藥青黛是抗腫瘤的有效成分［3］，而靛藍(lán)和靛玉紅又是青黛的主要成分。靛玉紅對(duì)慢性粒細(xì)胞白血病具有明顯的抑制作用，且臨床療效可靠、毒副反應(yīng)小、對(duì)骨髓無明顯抑制，是一種有效低毒的抗癌藥物［4］；但因其溶解性較差，所以臨床應(yīng)用受到一定限制。近年來，人們不斷地認(rèn)識(shí)和研究靛玉紅的藥理作用機(jī)制，其結(jié)構(gòu)修飾和應(yīng)用范圍也不斷地得到擴(kuò)展［5-8］。因此，為了克服靛玉紅溶解性較差及效果不夠強(qiáng)等缺陷，中國(guó)藥科大學(xué)姚其正教授課題組設(shè)計(jì)合成了一系列新的靛玉紅類化合物。前期實(shí)驗(yàn)對(duì)這類化合物進(jìn)行篩選［9］，發(fā)現(xiàn)吲哚-3-取代物 A具有良好的體外抗腫瘤活性和體內(nèi)抗腫瘤作用，但其體外抗腫瘤作用的機(jī)制還不明確。故本實(shí)驗(yàn)擬對(duì)吲哚-3-取代物 A的體外抗腫瘤的作用機(jī)制進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 主要材料

吲哚-3-取代物 A（靛玉紅衍生物中篩選得到，純度 ＞98％）由中國(guó)藥科大學(xué)藥學(xué)院姚其正教授課題組合成；MTT（Amresco公司）；JC-1，F(xiàn)luo-3/AM和Annexin-V/PI凋亡檢測(cè)試劑盒（Molecular Probes公司）；兔抗人Bax抗體，兔抗人Caspase-9抗體和鼠抗人 Caspase-3抗體均購(gòu)自 Abcam公司；鼠抗人 Bcl-2抗體和鼠抗人GAPDH抗體（Santa Cruz公司）；羊抗鼠抗體和羊抗兔抗體購(gòu)自博士德公司；DAPI和 ECL化學(xué)發(fā)光液購(gòu)自碧云天生物工程公司；其余未特殊注明的試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌細(xì)胞（HepG2）由南京大學(xué)徐力致老師惠贈(zèng)，培養(yǎng)于含10％滅活新生牛血清和青霉素、鏈霉素（各 100萬 U/L）的 DMEM（Gibco公司）培養(yǎng)液中，置于 37℃，含5％CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 HepG2細(xì)胞，消化、計(jì)數(shù)，以4×104/mL的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL。培養(yǎng)24 h后，以2、4、8、16 μmol/L吲哚-3-取代物A處理細(xì)胞。給藥組每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，以含0.4％DMSO的培養(yǎng)液作為對(duì)照組。藥物分別作用細(xì)胞12、24、36、48 h后，去上清，每孔加入100 μL MTT（1 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清，每孔加入100 μL DMSO，振蕩混勻，用酶標(biāo)儀測(cè)定光密度值［D（570 nm）］計(jì)算細(xì)胞活力。細(xì)胞活力（％）=（給藥組D值/對(duì)照組D值）×100％。

1.4 集落形成分析

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 HepG2細(xì)胞（5 000個(gè)細(xì)胞/孔）接種于24孔培養(yǎng)板中，接種4 h后，給予4、8、16 μmol/L吲哚-3-取代物 A處理細(xì)胞，孵育 7 d，然后觀察集落的形成情況。用 4％低聚甲醛固定10 min，并用0.5％結(jié)晶紫染色10 min，然后流水沖洗4次，晾干，拍照。

1.5 DAPI染色檢測(cè)細(xì)胞核形態(tài)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 HepG2細(xì)胞，消化、計(jì)數(shù)，以4×104/mL的密度接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔500 μL。培養(yǎng)24 h后，以2、4、8、16 μmol/L吲哚-3-取代物A處理腫瘤細(xì)胞48 h，棄培養(yǎng)基，PBS洗2遍，4％低聚甲醛室溫固定細(xì)胞15 min。加入 DAPI染色液室溫避光孵育10 min，棄染液，PBS洗2遍，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核的變化。

1.6 Annexin-V/PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

以 2、4、8、16 μmol/L吲哚-3-取代物 A處理HepG2細(xì)胞48 h后，收集1×106細(xì)胞，預(yù)冷 PBS洗2遍，加入400 μL結(jié)合緩沖液，輕輕混勻細(xì)胞，加入5 μL Annexin-V-FITC和5 μL PI溶液，避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.7 JC-1染色檢測(cè)線粒體膜電位

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 HepG2細(xì)胞，消化、計(jì)數(shù)，以每孔4×103個(gè)細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板或96孔熒光酶標(biāo)板培養(yǎng)，以2、4、8、16 μmol/L吲哚-3-取代物 A分別作用于HepG2細(xì)胞12、24、36、48 h后，棄培養(yǎng)基，加入2.5 μg/mL JC-1染色工作液，37℃負(fù)載探針40 min，PBS洗2次。用倒置熒光顯微鏡和熒光酶標(biāo)儀于激發(fā)光波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)525/590 nm觀察檢測(cè)線粒體膜電位的變化。

1.8 Fluo-3/AM檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度

以2、4、8、16 μmol/L的吲哚-3-取代物 A處理HepG2細(xì)胞 24 h后，收集1×106細(xì)胞，PBS洗 2次；加入1 mL PBS重懸細(xì)胞，再加3～4 μL Fluo-3染料（1 μg/μL）混勻；37℃避光孵育10 min；然后1 000r/min離心5 min，PBS洗2遍；棄上清，加0.3 mL PBS重懸細(xì)胞。流式細(xì)胞儀分析104個(gè)細(xì)胞Fluo-3染色后的平均熒光強(qiáng)度，作為評(píng)定細(xì)胞內(nèi) Ca2+濃度的指標(biāo)。測(cè)定條件為激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm。

1.9 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

以4、8、16 μmol/L的吲哚-3-取代物 A處理HepG2細(xì)胞24 h，加入細(xì)胞全蛋白裂解液裂解細(xì)胞收集蛋白樣品。110 V恒壓電泳 80 min；300 mA恒流濕法轉(zhuǎn)膜90 min；將膜置于封閉液中封閉1 h，TBST洗1次；加入一抗稀釋液（抗 Caspase-3、抗Caspase-9、抗Bcl-2、抗Bax、抗GAPDH，1∶1 000），4℃孵育過夜；TBST洗6次，每次10 min；將膜置于二抗稀釋液中（1∶2 000），室溫孵育1 h；TBST洗6次，每次10 min；吸水紙吸干膜上水分，加 ECL發(fā)光液顯色，于暗室內(nèi)曝光合適時(shí)間得到目的條帶，掃描圖像并分析結(jié)果。

1.10 定量和統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 吲哚-3-取代物 A對(duì) HepG2細(xì)胞增殖的影響

以不同濃度的吲哚-3-取代物 A分別作用于HepG2細(xì)胞12、24、36、48 h，MTT結(jié)果顯示（圖1），吲哚-3-取代物 A抑制 HepG2細(xì)胞的增殖，且呈時(shí)間-濃度依賴性，在16 μmol/L處理48 h時(shí)，抑制率達(dá)到81.1％。隨后用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況（圖2），吲哚-3-取代物 A引起細(xì)胞形態(tài)發(fā)生較明顯的變化，細(xì)胞皺縮，變圓，數(shù)量明顯減少，說明吲哚-3-取代物 A能明顯抑制腫瘤細(xì)胞增殖，與MTT結(jié)果一致。

圖1 不同濃度吲哚-3-取代物 A對(duì)細(xì)胞增殖力的影響

2.2 吲哚-3-取代物A對(duì)HepG2細(xì)胞集落形成的影響

利用克隆集落形成法測(cè)量單個(gè)細(xì)胞增殖為克隆集落的能力。如圖3所示，吲哚-3-取代物 A能夠抑制HepG2細(xì)胞的克隆生成，且呈濃度依賴性；與對(duì)照組比較，16 μmol/L吲哚-3-取代物 A處理組細(xì)胞克隆形成明顯減少。由此表明，吲哚-3-取代物A處理能夠抑制 HepG2細(xì)胞的克隆生成。

圖2 吲哚-3-取代物 A作用48 h后對(duì) HepG2細(xì)胞形態(tài)的影響（倒置相差顯微鏡 ×200）

圖3 不同濃度吲哚-3-取代物A處理后細(xì)胞的集落形成

2.3 吲哚-3-取代物 A對(duì) HepG2細(xì)胞凋亡的影響

DAPI染色觀察吲哚-3-取代物A作用后HepG2細(xì)胞核的變化，如圖4A所示，吲哚-3-取代物 A能夠使HepG2細(xì)胞的染色質(zhì)固縮。同時(shí)，采用Annexin-V-FITC和 PI雙染檢測(cè)吲哚-3-取代物 A能否誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡。如圖 4B所示，用 8 μmol/L 和16 μmol/L吲哚-3-取代物A處理HepG2細(xì)胞后，分別有20.68％和51.47％的細(xì)胞出現(xiàn)早期凋亡，表明吲哚-3-取代物 A可誘導(dǎo) HepG2細(xì)胞凋亡，且呈濃度依賴性。

2.4 吲哚-3-取代物A誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生Caspases依賴性的凋亡

流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，吲哚-3-取代物A處理細(xì)胞后，凋亡早期細(xì)胞數(shù)明顯增加。對(duì) Caspase-3，9的表達(dá)及活化進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，吲哚-3-取代物A可激活Caspase-3，9前體的裂解，呈濃度依賴性；吲哚-3-取代物 A誘導(dǎo) HepG2細(xì)胞凋亡涉及內(nèi)源性凋亡信號(hào)通路。同時(shí)，隨著化合物給藥濃度的增加，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)降低，促凋亡蛋白Bax的表達(dá)水平增高。見圖5。

圖4 吲哚-3-取代物 A對(duì) HepG2細(xì)胞凋亡的影響

圖5 吲哚-3-取代物A對(duì)凋亡與抗凋亡蛋白表達(dá)的影響

2.5 吲哚-3-取代物A對(duì)HepG2細(xì)胞線粒體膜電位的影響

隨著吲哚-3-取代物 A濃度的增加，HepG2細(xì)胞的線粒體膜電位呈濃度依賴性下降。同時(shí)，熒光酶標(biāo)儀測(cè)定結(jié)果顯示，不同濃度吲哚-3-取代物 A給藥處理12 h對(duì)線粒體膜電位沒有影響，而處理24 h后細(xì)胞線粒體膜電位下降，隨著濃度的升高及處理時(shí)間的增加，細(xì)胞線粒體膜電位減弱得越明顯。見圖6。對(duì)照組JC-1呈聚合體形式存在于細(xì)胞內(nèi)，說明線粒體膜電位較高。相比對(duì)照組，不同濃度吲哚-3-取代物A處理48 h后，JC-1單體形式逐漸增多，線粒體膜電位下降，尤其16 μmol/L化合物處理時(shí)線粒體膜電位下降明顯。見圖 7。以上結(jié)果表明，吲哚-3-取代物 A可誘導(dǎo)線粒體膜電位呈時(shí)間濃度依賴性下降。

圖6 不同濃度吲哚-3-取代物 A作用不同時(shí)間后HepG2細(xì)胞線粒體膜電位的變化

2.6 吲哚-3-取代物A對(duì) HepG2細(xì)胞內(nèi) Ca2+濃度的影響

圖7 吲哚-3-取代物A作用48 h后對(duì)線粒體膜電位的影響（200×）

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，2 μmol/L處理時(shí)細(xì)胞熒光強(qiáng)度略有增強(qiáng)，圖中主峰明顯右移，與對(duì)照組比較，吲哚-3-取代物 A處理組平均熒光強(qiáng)度升高，說明吲哚-3-取代物A可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，Ca2+的熒光強(qiáng)度隨著吲哚-3-取代物 A作用濃度的增加而增強(qiáng)。見圖8。

圖8 吲哚-3-取代物 A對(duì) HepG2細(xì)胞內(nèi) Ca2+的影響

3 討論

本課題組前期的研究顯示，吲哚-3-取代物A作用于HepG2細(xì)胞后，通過下調(diào)cdc 2和cyclin B1的表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯于 G2/M期［9］。此結(jié)論與Hoessel等［10］的研究報(bào)道一致，證實(shí)吲哚-3-取代物A與靛玉紅一樣具有阻滯細(xì)胞周期的作用。本文就吲哚-3-取代物A對(duì)HepG2細(xì)胞的作用及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方式及可能機(jī)制進(jìn)行了進(jìn)一步的探索。結(jié)果顯示，吲哚-3-取代物 A對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制作用呈時(shí)間 濃度依賴性，且可抑制HepG2細(xì)胞克隆集落的形成。多項(xiàng)研究表明靛玉紅類化合物能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［11-12］。本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)吲哚-3-取代物 A同樣可以誘導(dǎo) HepG2細(xì)胞發(fā)生早期凋亡。Caspases家族蛋白是凋亡過程中涉及的蛋白水解系統(tǒng)中的主要蛋白酶成分，在促凋亡信號(hào)的促發(fā)下引起酶降解的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能的區(qū)別，Caspases家族蛋白可分為2類:起始Caspases （Caspase-2，8，9，10）和執(zhí)行 Caspases（Caspase-3，6，7）。對(duì)于線粒體介導(dǎo)的凋亡通路而言，由于線粒體膜的完整性遭到破壞導(dǎo)致線粒體膜電位降低，細(xì)胞色素C釋放，Caspase-9激活?；罨?Caspase-9進(jìn)而剪切凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3和Caspase-7，最終導(dǎo)致染色質(zhì)固縮，DNA片段化以及凋亡小體的形成。因此，在本實(shí)驗(yàn)中，我們觀察到吲哚-3-取代物A通過濃度依賴性激活 Caspase-3，9前體的裂解從而誘導(dǎo) HepG2細(xì)胞發(fā)生早期凋亡。Berger等［11］同時(shí)發(fā)現(xiàn)，靛玉紅類衍生物能敏化黑色素瘤細(xì)胞的死亡配體從而介導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生外源性凋亡，因此，我們將在以后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步研究吲哚-3-取代物 A誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是否同樣涉及外源性凋亡通路，并進(jìn)一步探索其作用機(jī)制。除此之外，我們還對(duì)線粒體的功能進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)吲哚-3-取代物A呈時(shí)間度依賴性地降低線粒體膜電位，誘導(dǎo) Ca2+超載。再者，我們還考慮到對(duì)線粒體凋亡通路的調(diào)節(jié)是一個(gè)復(fù)雜的，多重因素共同作用的結(jié)果。而 Bcl-2家族蛋白恰好在該過程中起重要作用，Bcl-2作為一種抗凋亡蛋白，其激活與腫瘤的生長(zhǎng)，侵襲，轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)［2］。因此，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中觀察吲哚-3-取代物A誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中是否涉及到 Bcl-2家族蛋白的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，吲哚-3-取代物A可誘導(dǎo)Bcl-2的表達(dá)呈濃度依賴性降低，促凋亡蛋白 Bax的表達(dá)呈濃度依賴性增高，通過降低Bcl-2/Bax的比率誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。對(duì)于 Bcl-2家族蛋白在吲哚-3-取代物A誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程中的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)探索了新合成的靛玉紅類衍生物的體外抗腫瘤作用的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)其具有一定的潛在應(yīng)用價(jià)值，為開發(fā)擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的這一類新藥積累了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

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Effect of a novel indole-3-derivate indirubin on human HepG2 cells and underlying mechanism

TAN De-fei1，GUO Wen-jie1，XIA Juan1，GUAN Ting-wei1，GAO Jing1，YAO Qi-zheng2
（1.School of Pharmacy，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013；2.School of Pharmacy，China Pharmaceutical University，Nanjing Jiangsu 210009，China）

R749.16

A

1671-7783（2015）01-0038-05

10.13312/j.issn.1671-7783.y140246

談德斐（1987—），女，碩士研究生；高靜（通訊作者），教授，博士，E-mail:jinggao@ujs.edu.cn

2014-09-17 ［編輯］劉星星