超聲波輔助法提取葡萄籽中原花青素工藝的研究

蘇　芳，顧明廣，馮獻起（燕京理工學(xué)院 化工與材料工程學(xué)院，河北 三河 065201）

超聲波輔助法提取葡萄籽中原花青素工藝的研究

蘇芳，顧明廣，馮獻起
（燕京理工學(xué)院 化工與材料工程學(xué)院，河北 三河 065201）

提高釀酒后葡萄籽的綜合利用率，探究在不同提取條件下超聲波輔助法對葡萄籽中原花青素提取工藝的影響。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過正交試驗對提取工藝條件進行優(yōu)化。結(jié)果表明，最佳提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取時間20 min，超聲功率90 W，提取溫度50℃，料液比1∶20（g∶mL），在此最優(yōu)條件下，葡萄籽中原花青素的提取率為3.98%。

超聲波輔助法；葡萄籽；原花青素；提取

葡萄籽中含有油脂、不飽和脂肪酸，油脂中含有K、Zn、Fe、Ca等二十多種礦物質(zhì)和A、D、K等多種維生素［1］。其中葡萄籽油、多酚類物質(zhì)、葡萄籽蛋白等是可以被很好地利用到保健或醫(yī)藥成分中的物質(zhì)［2-5］。多酚類物質(zhì)在葡萄籽中含量約為4%［6］，重要成分為三種單體多酚和大量聚合多酚［7］。而聚合多酚中的原花青素是主要物質(zhì)［8］。早期對于葡萄籽的提取多數(shù)集中在葡萄籽油［9-12］和多糖［13］的范圍內(nèi)。至今，人們從葡萄籽和皮中分離出了具有較強的抗氧化性和清除自由基能力［14］原花青素。

原花青素的提取方主要有溶劑浸提法、酶解提取法，微波及微波輔助法、超臨界萃取法等。超聲波輔助法利用超聲波具有的機械效應(yīng)、空化效應(yīng)和熱效應(yīng)，通過增大介質(zhì)分子的運動速度、增強介質(zhì)的穿透力以提取生物有效成分的方法，從而達到提高提取效率、縮短提取時間的目的［15］。

為了充分利用釀酒后的葡萄籽，對葡萄籽中原花青素的提取有待進一步研究和考察。本試驗運用超聲波輔助法，對于葡萄籽中的原花青素提取工藝進行研究，考察了乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間、超聲功率、提取溫度和料液比等因素對葡萄籽中原花青素提取率的影響，并通過單因素試驗和正交試驗確定最優(yōu)工藝條件。對葡萄籽中原花青素提取提供參考，促進天然資源的綜合利用。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

釀酒后葡萄籽：購于燕郊市場；原花青素標(biāo)準(zhǔn)品（純度99%）：上海融禾醫(yī)藥科技有限公司；香蘭素、甲醇（均為分析純）：天津市福晨化學(xué)試劑廠；無水乙醇（分析純）：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；硫酸、丙酮（均為分析純）：北京化工廠。

1.2儀器與設(shè)備

FA1604N電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；SK3200HP超聲波清洗器：上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司；DHG-9240電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；UV-1100紫外可見分光光度計：北京萊伯泰科儀器有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；R201D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：河南省予華儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取原花青素標(biāo)準(zhǔn)品25 mg，用無水乙醇溶解并定容至50 mL，得到0.5 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。精確移取1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL，分別用無水乙醇定容至10 mL，得質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL、0.10 mg/mL、0.15 mg/mL、0.20 mg/mL、0.25 mg/mL、0.30 mg/mL的原花青素標(biāo)準(zhǔn)溶液。取干凈試劑瓶依次加入1 mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液、5 mL 3%香草醛-甲醇溶液、5 mL體積比為30%硫酸-甲醇溶液（量取30 mL98%濃硫酸用甲醛稀釋并冷卻，于100 mL容量瓶中定容），混合后避光并在30℃水浴里反應(yīng)15 min，并在最大吸收波長處測定不同質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)樣的吸光度值，繪制原花青素的標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時擬合出回歸方程。

1.3.2供試液的制備

將一定量的葡萄籽烘干至質(zhì)量恒定、粉碎，取1 g的葡萄籽粉末和一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，在不同條件下進行超聲波提取后進行離心，得上清液，再次洗滌沉淀、離心、合并上清液、過濾后進行定容至50 mL，得到供試液。

1.3.3樣品中原花青素的測定

將供試液稀釋一定倍數(shù)，取稀釋后的待測液1 mL，依次加入3%的香草醛-甲醇溶液5 mL，體積比30%硫酸-甲醇溶液各5 mL，混合后于30℃水浴中避光反應(yīng)15 min，并以1 mL水代替待測液，作為空白對照，在其最大吸收波長處測定其吸光度值。對照原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算提取液中原花青素的質(zhì)量濃度c，原花青素提取率的計算公式如下：

式中：n為提取液稀釋倍數(shù)；c為提取液中原花青素質(zhì)量濃度，mg/mL；V為提取液體積，mL；m為葡萄籽粉末質(zhì)量，mg。

1.3.4單因素試驗

分別考察料液比（1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40 （g∶mL））、乙醇體積分?jǐn)?shù)（40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%）、提取時間（10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60min）、超聲功率（70W、80W、90W、110W、120W、130W）和提取溫度（20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃）對葡萄籽中原花青素提取率的影響。

1.3.5優(yōu)化正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、提取時間（B）、超聲功率（C）和提取溫度（D）為影響因素，以原花青素提取率為評價指標(biāo)（Y），采用正交表L9（34）進行正交試驗，正交試驗因素與水平見表1。

表1　原花青素提取工藝優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for proanthocyanidins extraction process optimization

2　結(jié)果與分析

2.1原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

2.1.1測定波長的確定

將原花青素標(biāo)準(zhǔn)溶液在波長400～600 nm進行紫外光譜掃描，原花青素吸光度值-波長曲線見圖1。

圖1　原花青素標(biāo)準(zhǔn)品紫外掃描結(jié)果Fig.1 Ultraviolet scanning results of proanthocyanidins standard

由圖1可知，原花青素最大吸收波長為500 nm，因此，確定原花青素在香草醛顯色劑的作用下，以500 nm作為工作波長。

2.1.2原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

以原花青素質(zhì)量濃度（c）為橫坐標(biāo)，以吸光度值（A）為縱坐標(biāo)，繪制原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖2所示。

圖2　原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of proanthocyanidin

由圖2可知，原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為A= 1.598c+0.092 8，相關(guān)系數(shù)R=0.998 3。結(jié)果表明，在0.05～0.30 mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，原花青素質(zhì)量濃度和吸光度值線性關(guān)系良好。

2.2單因素試驗結(jié)果

2.2.1料液比對原花青素提取率的影響

以體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇作為溶劑，在提取溫度為25℃，提取時間20 min，超聲功率130 W的條件下，考察不同料液比對原花青素提取率的影響，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，隨著料液比的提高，提取率升高，當(dāng)料液達到1∶20（g∶mL）時，提取率已經(jīng)達到穩(wěn)定水平，此時提取率為2.728%；當(dāng)料液比＞1∶20（g∶mL）時，原花青素提取率增加不明顯。當(dāng)提取液量達到一定程度時，這時提取物中的原花青素已經(jīng)基本溶出，再增加溶劑，提取率也不會有太明顯的增長。相反，隨著溶劑用量的增加，不僅浪費提取液，還會為后續(xù)的濃縮、提純等工作增加工作量。因此，選擇料液比1∶20（g∶mL）為宜。

圖3　料液比對原花青素提取率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on proanthocyanidins extraction rate

2.2.2乙醇對原花青素提取率的影響

在料液比1∶20（g∶mL），提取溫度為25℃，提取時間20min，超聲功率130W的條件下考察不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇對原花青素提取率的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4　乙醇體積分?jǐn)?shù)對原花青素提取率的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on proanthocyanidins extraction rate

由圖4可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，原花青素的提取率呈現(xiàn)一個先上升后下降的過程。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%～70%時，提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而增高；在乙醇體積分?jǐn)?shù)達到70%時，提取率達到最大，為2.736%；乙醇體積分?jǐn)?shù)＞70%，提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而降低。這是由于原花青素為極性化合物，體積分?jǐn)?shù)70%乙醇水溶液的極性達到了其最佳溶解效果，能更好地將原花青素從葡萄籽中溶出。因此，選擇體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇為宜。

2.2.3提取時間對原花青素提取率的影響

以體積分?jǐn)?shù)70%乙醇作為溶劑，在料液比1∶20（g∶mL），提取溫度為25℃，超聲功率130 W的條件下考察不同提取時間對原花青素提取率的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5　提取時間對原花青素提取率的影響Fig.5 Effect of extraction time on proanthocyanidins extraction rate

由圖5可知，提取時間為10～30 min，隨著提取時間的延長，原花青素提取率迅速增加；當(dāng)提取時間30 min時，原花青素提取率達到最高，為2.91%；之后隨著提取時間的增長，提取率逐漸降低。其原因是，在較短的時間內(nèi)，原花青素向外擴散量隨時間的延長而增多，但到了一定時間后，原花青素遷移達到平衡，此時提取率隨時間增加不明顯；時間過長，提取物中會積存大量的熱量，導(dǎo)致原花青素的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，提取率開始下降。因此，選擇提取時間20min為宜。

2.2.4超聲功率對原花青素的影響

以體積分?jǐn)?shù)70%乙醇作為溶劑，在料液比1∶20（g∶mL），提取溫度為25℃，提取時間20 min的條件下考察超聲功率對原花青素提取率的影響，結(jié)果如圖6所示。

圖6　超聲功率對原花青素提取率的影響Fig.6 Effect of ultrasonic power on proanthocyanidins extraction rate

由圖6可知，超聲功率為70～90 W時，原花青素的提取率隨著超聲功率的增大而增大；當(dāng)超聲功率為90W時，原花青素提取率達到最大，為3.17%；隨著超聲功率繼續(xù)增大提取率反而降低。通常情況下，提取功率的提升，會細(xì)胞振蕩劇烈，利于原花青素的擴散，提取量越多，但原花青素的熱穩(wěn)定性并不太強，所以超聲功率過大時提取物中會產(chǎn)生大量的熱聚集，導(dǎo)致原花青素受熱分解，提取率下降；另一方面，超聲功率過大也會使其他組分析出，可能會影響最終的提取率，導(dǎo)致提取率降低。因此，選擇超聲功率90 W為宜。

2.2.5提取溫度對原花青素提取效果的影響

以體積分?jǐn)?shù)70%乙醇作為溶劑，在料液比1∶20（g∶mL），提取時間20 min，超聲功率130 W的條件下考察不同提取溫度對原花青素提取率的影響，結(jié)果如圖7所示。

圖7　提取溫度對原花青素提取率的影響Fig.7 Effect of extraction temperature on proanthocyanidins extraction rate

由圖7可知，隨著提取溫度的升高，原花青素提取率呈先增大后下降的趨勢。當(dāng)提取溫度為20～50℃，原花青素提取率隨溫度增加而提高；當(dāng)提取溫度為50℃時，原花青素提取率達到最大，為3.38%；提取溫度＞50℃，會造成提取率的明顯下降，其原因是溫度升高有利原花青素擴散，提取率隨之升高；但是原花青素的熱穩(wěn)定性較差，溫度過高又會影響原花青素的熱穩(wěn)定性，而影響提取效果。因此，選擇提取溫度50℃為宜。

2.3提取工藝優(yōu)化正交試驗分析

表2　原花青素提取工藝優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for proanthocyanidins extraction process optimization

由表2分析可知，極差越大說明該因素對試驗影響越大，影響原花青素提取率的因素主次關(guān)系為A＞B＞D＞C，即乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取時間＞提取溫度＞超聲功率。正交試驗結(jié)果得葡萄籽中原花青素提取條件為A2B2C2D2，即乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取時間20 min，超聲功率90 W，提取溫度50℃。在此最佳條件下進行驗證試驗，原花青素提取率平均值為3.98%。

3　結(jié)論

本研究采用超聲波輔助法提取葡萄籽中原花青素，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過正交試驗對提及工藝條件進行優(yōu)化，結(jié)果表明，原花青素最佳提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取時間20min，超聲功率90W，提取溫度50℃，料液比1∶20（g∶mL），在此最優(yōu)條件下，葡萄籽中原花青素的提取率為3.98%。

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Extraction processing of proanthocyanidins from grape seeds by u1trasonic assisted method

SU Fang，GU Mingguang，F(xiàn)ENG Xianqi
（Schoo1 of Chemica1 and Materia1s Engineering，Yanching Institute of Techno1ogy，Sanhe 065201，China）

To improve the comprehensive uti1ization of grape seeds after grape brewing，the effects of u1trasonic assisted method on proanthocyanidins from grape seeds were investigated under the different extraction conditions.On the basis of sing1e factor experiments，the extraction conditions were optimized by orthogona1 experiments.The resu1ts showed that the optimum extraction conditions were ethano1 concentration 70%，extraction time 20 min，u1trasonic power 90 W，extraction temperature 50℃，so1id-1iquid ratio 1∶20（g∶m1）.Under the conditions，the extraction rate of proanthocyanidins from grape seeds was 3.98%.

u1trasonic assisted method；grape seeds；proanthocyanidins；extraction

TQ91

A

0254-5071（2015）12-0113-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.12.025

2015-11-03

蘇芳（1979-），女，講師，碩士，研究方向為精細(xì)化學(xué)。