金銀花中綠原酸的雙水相萃取及抗氧化能力研究

胡佳欽，向　福，2*，石長(zhǎng)萍，吳　偉，方元平，2（.黃岡師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 黃州 438000；2.大別山特色資源開發(fā)湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 黃州 438000；3.湖北理工學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，湖北 黃石 435003）

金銀花中綠原酸的雙水相萃取及抗氧化能力研究

胡佳欽1，向福1，2*，石長(zhǎng)萍1，吳偉2，3，方元平1，2
（1.黃岡師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 黃州 438000；2.大別山特色資源開發(fā)湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 黃州 438000；3.湖北理工學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，湖北 黃石 435003）

為合理利用大別山金銀花資源，以羅田縣的金銀花及其莖、葉為試驗(yàn)材料，利用雙水相體系萃取綠原酸，并研究了其抗氧化活性。結(jié)果表明：50 mL丙酮/磷酸氫二鉀（K2HPO4）雙水相體系萃取綠原酸的最佳條件為酮水比8.5∶1.5（V/V），磷酸氫二鉀添加量3 g，水提液綠原酸質(zhì)量濃度22.9 g/L。在此條件下，綠原酸含量為56.27%，收率為98.46%，且其綠原酸的羥基自由基清除能力較強(qiáng)，從而為大別山金銀花資源的開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

雙水相；金銀花；綠原酸；羥基自由基清除；抗氧化活性

金銀花（Lonicera japonica）藥用歷史悠久，是臨床常用的中藥之一，具有較高的使用價(jià)值［1］。綠原酸（ch1orogenic acid）是金銀花的主要藥效成分和評(píng)價(jià)成分，具有抗氧化、降血脂、降血糖、調(diào)節(jié)免疫、保護(hù)心腦血管的功能［2-5］。目前，從金銀花中分離純化綠原酸的主要方法有大孔樹脂吸附法、水提石灰乳沉淀法、超濾法、正丁醇分離法、β-環(huán)糊精包埋法、水提醇沉法、石灰硫酸法、異戊醇法和改良的醋酸乙酯法等［6-10］，這些分離純化方法存在綠原酸含量低、耗時(shí)長(zhǎng)、操作繁瑣、有機(jī)溶劑殘存、環(huán)境不友好、生物相容性低等問(wèn)題，難以適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)［11］。同時(shí)，綠原酸高溫下不穩(wěn)定，易失活。

雙水相萃取（aqueous two-phase extraction，ATPE）是一種新型溶劑萃取的分離提純技術(shù)，提取過(guò)程能有效保護(hù)天然產(chǎn)物的生物活性［12］，且有選擇性強(qiáng)、易于放大的特點(diǎn)，適合大規(guī)模生產(chǎn)、操作簡(jiǎn)單、生物親和性好、經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便、快速高效且不存在有機(jī)溶劑殘存問(wèn)題［13-14］，有效提高了天然活性物質(zhì)分離純化的安全性和提取效率。

為便于產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用，本實(shí)驗(yàn)以羅田縣的金銀花及其莖葉為實(shí)驗(yàn)材料，基于酮水比、磷酸氫二鉀加入量和水提液綠原酸質(zhì)量濃度3個(gè)因素，探討丙酮/K2HPO4雙水相體系萃取綠原酸的最佳條件，并研究其抗氧化活性，從而為大別山金銀花資源的開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

金銀花（花莖葉整株采收）：羅田縣開發(fā)區(qū)金銀花基地，陰干，粉碎備用；綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%）：上海如吉生物科技有限公司；維生素C（vitaminC，VC）標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99.99%）：上海麥克林生化科技有限公司；丙酮（分析純）、磷酸氫二鉀（分析純）：天津凱通化學(xué)試劑有限公司；羥自由基清除能力測(cè)定試劑盒：北京索萊寶科技有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

Varian Cary 100 Scan紫外可見分光光度計(jì)：美國(guó)Varian公司；Ax-205 METTLER TOLEDO電子天平：瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)；RE-4205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；DZKW-D-2電熱恒溫水浴鍋：北京西城區(qū)醫(yī)療器械廠。1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1金銀花水提液制備

根據(jù)參考文獻(xiàn)［15］中提取綠原酸的方法，稱取10 g金銀花粉末，用體積分?jǐn)?shù)60%乙醇按料液比1∶3.5（g∶mL）浸提過(guò)夜，再按料液比1∶20（g∶mL）的沸水，水浴攪拌10 min，冷卻至室溫抽濾，在70℃濃縮至50 mL左右，制得金銀花水提液。

1.3.2綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

準(zhǔn)確稱取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品10mg，用超純水定容至100 mL，制得綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液用紫外分光光度計(jì)于波長(zhǎng)200～500 nm處掃描，確定檢測(cè)波長(zhǎng)為322 nm。

分別吸取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL、3.5 mL、4.0 mL、4.5 mL、5.0 mL于10 mL容量瓶中定容，在波長(zhǎng)322 nm處測(cè)定吸光度值。綠原酸在0.005～0.050 g/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與吸光度值呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=0.052 4x+0.003 8，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 4。

1.3.3雙水相體系萃取單因素試驗(yàn)

準(zhǔn)確量取一定體積的金銀花水提液置于50 mL錐形瓶中，按比例加入一定體積的丙酮和一定質(zhì)量的磷酸氫二鉀，振蕩，使其充分混勻，靜置過(guò)夜后分離上下兩相，測(cè)體積計(jì)算相比R，并在波長(zhǎng)322 nm處測(cè)其吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程計(jì)算綠原酸質(zhì)量濃度和分配系數(shù)K。相比、分配系數(shù)和綠原酸收率的計(jì)算公式如下：

式中：R為相比；VA、VB分別為上、下相體積，mL；K為分配系數(shù)；CA、CB分別為上、下相中綠原酸質(zhì)量濃度，g/L；Y為綠原酸收率，%。

1.3.4雙水相體系萃取條件正交試驗(yàn)優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，對(duì)影響雙水相萃取主要因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，以綠原酸收率Y為考察指標(biāo)，確定50 mL雙水相體系萃取綠原酸的最佳條件。正交試驗(yàn)因素與水平如表1所示。

表1　萃取條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素和水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for extraction conditions optimization

1.3.5抗氧化能力檢測(cè)

分別配制綠原酸質(zhì)量濃度為0.15g/L、0.30g/L、0.45 g/L、0.60 g/L和0.75 g/L的金銀花水提液、上相萃取液、綠原酸標(biāo)品溶液，并以相同質(zhì)量濃度的VC作為陽(yáng)性對(duì)照，參照說(shuō)明書混勻后，在37℃溫育60 min，將對(duì)照管、測(cè)定管、空白管樣液在波長(zhǎng)536 nm處測(cè)定吸光度值，每管重復(fù)3次，羥自由基清除率計(jì)算公式如下：

式中：D為羥自由基清除率，%；OD1為測(cè)定管的吸光度值；OD2為對(duì)照管的吸光度值；OD3為空白管的吸光度值。

2　結(jié)果與分析

2.1雙水相萃取綠原酸單因素試驗(yàn)

2.1.1酮水比對(duì)雙水相萃取綠原酸的影響

酮水比即丙酮和水的體積比，直接影響雙水相萃取效果。水量過(guò)多無(wú)法形成雙水相體系，過(guò)少則鹽不能完全溶解；丙酮量太少也無(wú)法形成雙水相，太多則會(huì)導(dǎo)致鹽的析出。在50mL雙水相體系中考察了酮水體積比分別為7.0∶3.0、7.5∶2.5、8.0∶2.0、8.5∶1.5、9.0∶1.0時(shí)雙水相萃取綠原酸的效果，結(jié)果如圖1所示。

圖1　酮水比對(duì)雙水相萃取綠原酸的影響Fig.1 Effect of acetone water volume ratio on aqueous two-phase extraction of chlorogenic acid

由圖1可知，當(dāng)酮水比在7.0∶3.0～8.5∶1.5時(shí)，分配系數(shù)K穩(wěn)定在1.00～1.54范圍波動(dòng)，綠原酸收率則持續(xù)增加到88.63%。當(dāng)酮水比為9.0∶1.0時(shí)，此時(shí)雙水相體系下相渾濁，導(dǎo)致分配系數(shù)K和收率Y分別急劇下降到0.05和39.57%。因此，丙酮/K2HPO4雙水相體系中，酮水比不僅影響雙水相的穩(wěn)定性，也是影響綠原酸萃取效果的重要因素，酮水比越大，上相對(duì)綠原酸的富集效率越高，但酮水比太大則體系不穩(wěn)定，在酮水比為8.5∶1.5時(shí)，雙水相體系構(gòu)建最穩(wěn)定，綠原酸收率最高，因此選擇酮水比8.5∶1.5進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.1.2磷酸氫二鉀加入量對(duì)雙水相萃取綠原酸的影響

在酮水比8.5∶1.5條件下，在50 mL雙水相體系分別加入2 g、3 g、4 g、5 g、6 g K2HPO4，探討K2HPO4加入量對(duì)雙水相體系萃取綠原酸的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2　磷酸氫二鉀添加量對(duì)雙水相萃取綠原酸的影響Fig.2 Effect of K2HPO4addition on aqueous two-phase extraction of chlorogenic acid

由圖2可知，分配系數(shù)K和綠原酸收率Y均隨著K2HPO4加入量的增加出現(xiàn)先升后降的變化趨勢(shì)，在K2HPO4添加量為3 g時(shí)均達(dá)到最高值，分別為2.75和94.36%。因此K2HPO4加入量可以明顯影響雙水相體系萃取綠原酸的效果，50 mL丙酮/K2HPO4雙水相體系萃取金銀花中綠原酸的K2HPO4最佳添加量為3 g。

2.1.3綠原酸質(zhì)量濃度對(duì)雙水相萃取綠原酸的影響

配制綠原酸質(zhì)量濃度分別為5.7g/L、11.5g/L、17.2 g/L、22.9 g/L、28.7 g/L的金銀花水提液構(gòu)建50 mL雙水相體系，酮水比8.5∶1.5，加入K2HPO43 g，分配系數(shù)K、及綠原酸收率Y的變化結(jié)果如圖3所示。

圖3　綠原酸質(zhì)量濃度對(duì)雙水相萃取綠原酸的影響Fig.3 Effect of chlorogenic acid content on aqueous two-phase extraction of chlorogenic acid

由圖3可知，分配系數(shù)K和綠原酸收率Y隨著金銀花水提液中綠原酸質(zhì)量濃度的增加而增加，在綠原酸質(zhì)量濃度為22.9 g/L時(shí)達(dá)到最大，分別比為12.26和98.46%。隨著綠原酸質(zhì)量濃度繼續(xù)增加，分配系數(shù)K和綠原酸收率Y則開始下降，這可能是由于金銀花水提液中綠原酸質(zhì)量濃度超過(guò)了雙水相萃取能力（如28.7 g/L），上相所能萃取容納的綠原酸達(dá)到飽和，多余的綠原酸仍保留在下相，從而導(dǎo)致分配系數(shù)和綠原酸收率的降低。因此，選擇選擇金銀花水提液中綠原酸質(zhì)量濃度22.9 g/L進(jìn)行下一步研究。

2.2雙水相萃取綠原酸正交優(yōu)化試驗(yàn)

為進(jìn)一步優(yōu)化雙水相體系萃取條件，選取酮水比（A）、磷酸氫二鉀添加量（B）和綠原酸質(zhì)量濃度（C）為影響因素，以綠原酸收率（Y）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行3因素3水平正交優(yōu)化試驗(yàn)，結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2　萃取條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果及分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for extraction conditions optimization

表3　正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表2可知，各因素對(duì)綠原酸萃取的影響次序?yàn)椋篈＞B＞C，即酮水比＞磷酸氫二鉀加入量＞綠原酸質(zhì)量濃度。雙水相萃取綠原酸的最佳條件為A3B2C2，即在50 mL雙水相體系中，酮水比為8.5∶1.5，K2HPO4加入量為3 g，綠原酸質(zhì)量濃度為22.9 g/L。由表3可知，酮水比對(duì)雙水相萃取綠原酸提取影響達(dá)到顯著水平（P＜0.05），其他因素對(duì)結(jié)果影響均不顯著。

2.3驗(yàn)證試驗(yàn)

在正交試驗(yàn)最佳萃取條件下，驗(yàn)證所得綠原酸收率為98.46%，大于正交表中最高綠原酸收率96.39%。為驗(yàn)證其萃取作用，將金銀花水提液經(jīng)濃縮干燥，測(cè)定綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，平均值為16.20%。在A3B2C2最佳萃取條件下，上相萃取液經(jīng)濃縮干燥，測(cè)定綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，平均值為56.27%。丙酮/K2HPO4雙水相體系萃取后，所得金銀花提取物中綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加了2.47倍，表明該雙水相體系對(duì)綠原酸的萃取和純化作用明顯。

2.4抗氧化能力評(píng)價(jià)

以VC為陽(yáng)性對(duì)照，檢測(cè)0.15 g/L、0.31 g/L、0.46 g/L、0.62 g/L和0.77 g/L等系列綠原酸質(zhì)量濃度下金銀花水提液、雙水相上相萃取液、綠原酸標(biāo)品溶液的羥基自由基清除能力，結(jié)果如圖4所示。

羥基自由基作用于體內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸、脂類等生物分子，造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能受損，進(jìn)而導(dǎo)致體內(nèi)代謝紊亂引起疾?。?6］。羥基自由基清除能力是樣品抗氧化能力的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)之一。由圖4可知，3種含不同質(zhì)量濃度綠原酸的樣液，以綠原酸標(biāo)品溶液羥基自由基清除率最低，隨著綠原酸質(zhì)量濃度的增加，樣品液羥基自由基清除能力增強(qiáng)。質(zhì)量濃度增加到0.75g/L時(shí)，水提液羥基自由基清除率最高，為98%；其次是上相萃取液，為82%；綠原酸標(biāo)品溶液最低，為78%，但均比VC羥基自由基清除率高。因此，金銀花綠原酸提取物具有較強(qiáng)的羥基自由基清除能力。

圖4　綠原酸樣品的羥自由基清除能力Fig.4 Scavenging hydroxyl radical activity of chlorogenic acid samples

金銀花水提液中黃酮類、酚類、多糖類等抗氧化物質(zhì)的存在，強(qiáng)化了其低濃度時(shí)的羥自由基清除能力［17］，使得綠原酸質(zhì)量濃度為0.15g/L時(shí)，水提液羥自由基清除率優(yōu)勢(shì)明顯，是VC標(biāo)準(zhǔn)品液的6.6倍。隨著綠原酸質(zhì)量濃度的增加，上相萃取液和綠原酸標(biāo)品溶液的羥自由基清除率與水提液的差距逐漸縮小，使得水提液羥自由基清能力雖然最強(qiáng)，但優(yōu)勢(shì)減弱，僅為VC標(biāo)準(zhǔn)品液的1.9倍，而上相萃取液和綠原酸標(biāo)品液的羥自由基清除率基本相近，分別為VC標(biāo)準(zhǔn)品液的1.6倍和1.5倍。這是由于雙水相選擇性萃取富集了水提液中綠原酸，其羥自由基清除率與綠原酸標(biāo)品液接近，但由于仍存在黃酮類等物質(zhì)，使其羥自由基清除率略高于綠原酸標(biāo)品溶液。

3　結(jié)論

試驗(yàn)以羅田縣的金銀花及其莖葉為試驗(yàn)材料，建立了50 mL丙酮/K2HPO4雙水相體系選擇性萃取金銀花中綠原酸的工藝，最佳條件為酮水體積比8.5∶1.5，K2HPO4添加量3 g，水提液中綠原酸質(zhì)量濃度22.9 g/L。此條件下綠原酸收率為98.46%，含量為56.27%。

雙水相對(duì)金銀花綠原酸的萃取和純化作用明顯，所得綠原酸具有較強(qiáng)的清除羥基自由基的作用，對(duì)大別山金銀花資源的合理開發(fā)和科學(xué)利用具有現(xiàn)實(shí)意義和應(yīng)用前景。

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Aqueous two-phase extraction and antioxidant activity of ch1orogenic acid in honeysuck1e

HU Jiaqin1，XIANG Fu1，2*，SHI Changping1，WU Wei2，3，F(xiàn)ANG Yuanping1，2
（1.Co11ege of Life Sciences，Huanggang Norma1 University，Huangzhou 438000，China；2.Hubei Co11aborative Innovation Center for the Characteristic Resources Exp1oitation of Dabie Mountains，Huangzhou 438000，China；3.Schoo1 of Medicine，Hubei Po1ytechnic University，Huangshi 435003，China）

For reasonab1e uti1ization of Dabie Mountains honeysuck1e resources，using the f1owers，branches and 1eaves of honeysuck1e as test materia1s，the ch1orogenic acid was extracted by aqueous two-phase system，and the antioxidant activity was researched.Resu1ts indicated that the optimum extraction conditions of ch1orogenic acid in 50 m1 acetone and K2HPO4aqueous two-phase system were ketone-water ratio 8.5∶1.5（V/V），K2HPO4addition 3 g，water extract ch1orogenic acid content 22.9 g/L.Under the conditions，the content and yie1d of ch1orogenic acid was 56.27%and 98.4%，respective1y.The ch1orogenic acid had a good capacity of scavenging hydroxy1 radica1，which provided a theoretica1 basis for the deve1opment and app1ication of Dabie Mountains honeysuck1e resources.

aqueous two-phase；honeysuck1e；ch1orogenic acid；hydroxy1 radica1 scavenging；antioxidant activity

TS210.9

A

0254-5071（2015）12-0109-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.12.024

2015-10-26

湖北省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（2014CFA129）

胡佳欽（1994-），男，本科生，研究方向?yàn)樘烊恢参镔Y源利用。

向福（1977-），男，副教授，博士，研究方向?yàn)樘烊恢参镔Y源利用。