柑橘精油對致草莓腐爛的菌種的抑菌效果研究

張文勇，陳瑛瑛，趙潤柱（太原工業(yè)學院環(huán)境與安全工程系，山西 太原 030008）

柑橘精油對致草莓腐爛的菌種的抑菌效果研究

張文勇，陳瑛瑛，趙潤柱
（太原工業(yè)學院環(huán)境與安全工程系，山西 太原 030008）

從自然腐爛的草莓中分離純化得到兩株革蘭氏陽性細菌（標記為B1和B2）及一株青霉菌，研究了柑橘精油對這三種菌株的抑制效果，并分析了三種菌株的最低抑菌濃度，以及不同貯存時間和pH對柑橘精油的抑菌效果影響。結(jié)果表明，柑橘精油對細菌B1、B2和青霉菌均有抑制作用；柑橘精油對三種菌株的最低抑菌濃度為1.25%；貯存時間對柑橘精油的抑菌效果有一定影響，在貯存6 d后柑橘精油的抑菌作用趨于穩(wěn)定；pH對柑橘精油的抑菌效果影響較大，最佳的作用pH值為5。

柑橘精油；細菌；霉菌；抑菌性

草莓果實鮮紅多汁，富含多種維生素、有機酸和礦物質(zhì)，深受不同人群的喜愛，但由于其表皮柔軟，極易受到機械損傷和微生物［1-2］侵染而腐爛變質(zhì)，造成巨大的經(jīng)濟損失。目前，我國草莓多采用低溫貯存或使用化學藥劑保鮮，但是低溫貯存成本較高，而化學藥劑會有部分藥劑成分殘留在食用的草莓中，隨著人們食品安全意識的提高，引起大眾的擔心，且化學藥劑的使用也會對環(huán)境造成污染，限制了其應用，所以選擇環(huán)境友好的生物保鮮劑成為當下研究熱點。

植物精油是一種公認安全的植物次生代謝產(chǎn)物，憑借其廣譜抑菌性［3-5］、無毒、來源廣等優(yōu)點受到廣大研究者的追捧。其中的柑橘精油主要存在于柑橘類果實的外果皮細胞中，約占柑橘鮮質(zhì)量的0.5%～2.0%［6］。當下的柑橘皮主要以遺棄的方式處理，若能對柑橘類果皮加以合理的開發(fā)，無疑將會解決資源的浪費問題。目前雖有一些關(guān)于柑橘類精油抗菌活性的研究［7-8］，以及一些關(guān)于柑橘類精油用于蜜桔等果蔬的保鮮方面的報道［9-10］，但相關(guān)報道還較少，且缺乏一定的系統(tǒng)性。該實驗以草莓為研究對象，從腐爛的草莓中分離出不同的菌株，探究了柑橘精油對引起草莓腐爛的微生物的抑制情況，以期為草莓的常溫保鮮提供一種方法，為柑橘精油在草莓保鮮的實際應用方面提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1實驗材料

柑橘果皮：太原市尖草坪區(qū)榮華大藥房；次氯酸鈉、牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、葡萄糖等均為分析純：生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.2實驗菌種

實驗所用的菌種均從自然腐爛的草莓中提取分離得到。

1.1.3培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3g，蛋白胨5 g，NaC1 3 g，瓊脂20 g，去離子水1 L。

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g（切成小塊，煮爛過濾），葡萄糖20 g，瓊脂20 g，去離子水1 L。

1.2儀器與設備

YLN203型雙目生物顯微鏡：北京市亞力恩機電研究所；BCD-318WSL型海爾冰箱：青島海爾股份有限公司；SHP-250型生化培養(yǎng)箱：上海森信實驗儀器有限公司；BJ-CD型超凈工作臺：上海博迅實業(yè)有限公司。

1.3方法

1.3.1柑橘精油的提取

實驗所用的柑橘精油的提取參照文獻［11］，采用傳統(tǒng)的水蒸汽蒸餾法提取獲得。即取曬干的柑橘皮300 g剪碎至邊長約4 mm的顆粒，裝入一圓底燒瓶中，用水蒸氣蒸餾60 min，得到油水混合物，分層后得到柑橘精油置于2 mL EP管，4℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2致草莓腐爛的菌種的分離純化

取自然發(fā)病的草莓，分別挑取腐爛草莓表面的微生物，采用劃線分離法分別接種于無菌的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和馬鈴薯培養(yǎng)基上，細菌置于37℃培養(yǎng)，霉菌置于28℃培養(yǎng)，重復劃線分離直至獲得純菌種。細菌經(jīng)過革蘭氏染色鏡檢，獲得的兩種細菌均為革蘭氏陽性菌，但其生長的菌落顏色不一樣，分別標記為B1（白色）與B2（香檳色）。霉菌采用乳酸石炭酸棉藍染液［12］進行染色鏡檢，結(jié)合其菌株平板生長的顏色，結(jié)果得知分離到的霉菌為青霉菌。所有獲得的純菌株4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3柑橘精油的抑菌效果研究

參照文獻［13］，采用濾紙片擴散法進行柑橘精油的抑菌效果表征，其中的濾紙片直徑為5.50 mm。

（1）細菌懸浮液的制備

取純化的2株細菌分別于37℃活化12 h，采用血球計數(shù)法，用無菌水將其濃度分別調(diào)至1×107CFU/mL，備用。

（2）孢子懸浮液的制備

取純化的青霉菌于試管斜面28℃活化48 h，加入5 mL無菌水振蕩溶解孢子，使用血球計數(shù)板計數(shù)，用無菌水將其濃度調(diào)至1×107CFU/mL，備用。

（3）抑菌圈直徑測定

在滅菌后的圓形濾紙片中間滴加8μL100%柑橘精油，同時取無菌水作為對照，細菌培養(yǎng)24 h，霉菌培養(yǎng)48 h后測定抑菌圈直徑，分析柑橘精油對3種菌種的抑制效果。

（4）最低抑菌濃度［14］的研究

在滅菌后的圓形濾紙片中間分別滴加8 μL體積分數(shù)為5.00%、2.50%、1.25%、0.83%的柑橘精油，測定不同體積分數(shù)柑橘精油所對應的抑菌圈直徑。

（5）不同貯存時間的柑橘精油的抑菌效果研究

在滅菌后的圓形濾紙片中間分別滴加8 μL已貯存0、3 d、6 d、9 d、12 d的100%柑橘精油，測定不同貯存時間的柑橘精油所對應的抑菌圈直徑，分析提取的柑橘精油在貯存期內(nèi)抑菌效果的變化情況。

（6）pH值對柑橘精油抑菌效果的影響

用HC1和NaOH制備pH值分別為3、5、7、9的溶液，在溶液中滴加含量為100%的柑橘精油制備成含量為5%的不同pH值的柑橘精油。在滅菌后的圓形濾紙片中間分別滴加8μL不同pH值的柑橘精油，分析不同pH環(huán)境對柑橘精油抑菌效果的影響。

1.3.4數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)使用軟件SPSS 19.0進行差異顯著性分析。

2　結(jié)果與分析

2.1抑菌圈直徑的測定結(jié)果

采用濾紙片擴散法測定柑橘精油對3種菌種的抑菌效果，其實驗結(jié)果見圖1和表1。從表1可知，3種菌株形成的抑菌圈直徑不同，說明柑橘精油對不同種類的菌株表現(xiàn)出不同程度的抑制效果。其中柑橘精油對青霉菌的抑制最強，其抑菌圈直徑為15.63 mm，為3種菌中最大，對細菌的抑制效果低于青霉菌，同時在兩種細菌中，對細菌B2的抑制作用要強于B1。抑菌圈直徑的實驗結(jié)果說明可以采用柑橘精油作為果蔬的保鮮劑，延緩果蔬的保鮮。

圖1　柑橘精油對不同菌種的抑菌效果Fig.1 Inhibitory effect of citrus essential oils on different strains

表1　柑橘精油對菌種的抑菌直徑Table 1 Inhibitory diameters of citrus essential oils on different strains

2.2最低抑菌濃度的測定結(jié)果

柑橘精油最低抑菌濃度（minima1 inhibitory concentration，MIC）的測定采用逐漸降低柑橘精油體積分數(shù)的方式進行，結(jié)果見表2。從表2可以看出，隨著柑橘精油體積分數(shù)的下降，3種菌種的抑菌圈直徑均開始減小，其中青霉菌的抑菌圈直徑減小的最快，說明青霉菌對柑橘精油的含量最為敏感，其次為細菌B2，細菌B1對柑橘精油含量的敏感度最低。在柑橘精油含量為0.83%時，基本觀察不到3種菌種的抑菌圈，因此認為，柑橘精油對這三種菌的最低抑菌濃度為1.25%。

表2　柑橘精油對菌種的最低抑菌濃度Table 2 Minimal inhibitory concentration of citrus essential oils on different strains

2.3不同貯存時間對柑橘精油的抑菌效果影響的測定

提取得到的柑橘精油貯存不同時間后對三種菌種的抑制效果見表3，從表3可看出，在貯存的前期，柑橘精油的抑菌效果與精油貯存的時間呈負相關(guān)關(guān)系，在柑橘精油貯存的前6 d，隨著貯存時間的延長，細菌的抑菌效果逐漸減弱，霉菌的變化不大。6 d后柑橘精油對3種菌種的生長抑制效果差異不顯著，即柑橘精油的抑菌效果趨于穩(wěn)定。3種菌的抑菌圈直徑穩(wěn)定在9.00 mm、10.75 mm和13.00 mm左右。分析其原因，可能為提取的柑橘精油在貯存前期有一些易揮發(fā)性的組分發(fā)生了揮發(fā)，而這些組分的含量與柑橘精油的抑菌效果有一定的關(guān)系，隨著貯存時間的延長，貯存的柑橘精油成分趨于穩(wěn)定，所以抑菌效果也基本不發(fā)生改變?？梢娫诟涕倬唾A存6 d后抑菌作用趨于穩(wěn)定，在用于果蔬的保鮮過程中，要想使柑橘精油發(fā)揮較好的保鮮效果，傳統(tǒng)法提取的柑橘精油不易貯存時間太長。

表3　不同貯存時間對柑橘精油抑菌效果的影響Table 3 Effect of different storage time on the antibacterial effect of citrus essential oils

2.4不同pH值對柑橘精油抑菌效果的影響

不同pH值的柑橘精油對3種菌的抑菌效果結(jié)果如表4所示。由表4可知，柑橘精油的抑菌效果與其所處的環(huán)境pH有密切關(guān)系。當柑橘精油溶解的pH值發(fā)生改變時，其抑菌效果發(fā)生改變。但是對于不同的微生物，柑橘精油發(fā)揮最佳抑菌的pH值不同，當柑橘精油在pH值為7時，對細菌B1的抑制作用最明顯，抑菌圈直徑達到最大為9.08 mm；對于細菌B2，當柑橘精油在pH為3和9時，對其的抑制作用最為明顯，抑菌圈直徑分別可達到10.50 mm和10.17 mm；而在pH值為5時，對青霉菌的抑菌效果最突出，抑菌圈直徑達到了12.25 mm?？紤]到在果蔬保鮮中只能使用同一pH值的精油，綜合柑橘精油對3種菌抑制效果的顯著性水平來看，當柑橘精油所處的環(huán)境pH值為5時，對3種菌的綜合抑制效果最好。

表4　不同pH對柑橘精油抑菌效果的影響Table 4 Effect of different pH on the antibacterial effect of citrus essential oils

3　結(jié)論

從自然發(fā)病的草莓中分離出2株細菌和1株霉菌，通過生態(tài)學特征觀察和顯微鏡鏡檢實驗確定2株細菌均為革蘭氏陽性菌，1株霉菌為青霉菌。

通過測定柑橘精油對于上述3株菌的抑菌圈直徑，參照文獻［15］關(guān)于微生物對抑制劑敏感性的定義，本實驗結(jié)果可將柑橘精油對3種菌的抑制度劃分為：對細菌B1有低度抑制作用，對細菌B2有中度抑制作用，對青霉菌有高度抑制作用。

在此前提下，該實驗探究了不同性質(zhì)的柑橘精油對細菌B1、B2和青霉菌的抑菌效果。得到的最終結(jié)果為：柑橘精油對3種菌種的最低抑菌濃度為1.25%；提取的柑橘精油在貯存的前6 d，其抑菌效果隨貯存時間的延長而減弱，在貯存6 d以后，其抑菌效果趨于穩(wěn)定，抑菌效果基本不發(fā)生變化；柑橘精油所處的pH環(huán)境對其抑菌效果影響很大，其pH為偏酸性時柑橘精油發(fā)揮的抑菌效果最好，此外相同pH的柑橘精油對不同微生物的抑制效果也不同，綜合3種菌最終的抑制效果，得出最佳的柑橘精油作用pH值為5。

綜上，柑橘精油對草莓腐爛的主要病原微生物有一定的抑制作用，通過本實驗的研究結(jié)果，可以認為柑橘精油在草莓采后的貯藏保鮮領(lǐng)域有很大的應用價值，但是關(guān)于柑橘精油具體成分對病原微生物的抑制作用還有待進一步的研究。

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Antibacteria1 effect of citrus essentia1 oi1s against strawberry spoi1age microbes

ZHANG Wenyong，CHEN Yingying，ZHAO Runzhu
（Department of Environment and Safety Engineering，Taiyuan Institute of Techno1ogy，Taiyuan 030008，China）

Two strains of gram-positive bacteria B1 and B2，and one strain ofPenici11iumfrom the surface of natura1 rotted strawberries were iso1ated. The antibacteria1 effect of citrus essentia1 oi1s on three strains were studied，the minima1 inhibitoryconcentrations（MIC）of three strains were measured，and the effect of different storage time and pH on the antibacteria1 effect of citrus essentia1 oi1s were ana1yzed.The resu1ts showed that citrus essentia1 oi1s had inhibitory effect on bacteria B1 and B2 and penici11ium；the MIC of three strains was 1.25%；different storage time of citrus essentia1 oi1s had a certain inf1uence on its antibacteria1 activity，and the antibacteria1 activity tended to be stab1e from the 6 d of storage time.The antibacteria1 effect of citrus essentia1 oi1s was affected great1y by pH，and the optima1 pH was pH 5.

citrus essentia1 oi1s；bacterium；mo1d；antibacteria1 effect

TS209

A

0254-5071（2015）12-0097-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.12.021

2015-10-19

太原工業(yè)學院院級青年基金項目（2015LQ03）

張文勇（1988-），男，助教，碩士，研究方向為食品貯藏。