基于MicroRNAs及其靶基因的化學預防藥物對腫瘤抑制的作用

蔣艷輝 綜述 宋鑫 校審

當前，腫瘤是引起全球死亡的頭號殺手。中國作為人口最多的國家，正面臨著來自腫瘤的嚴峻挑戰(zhàn)[1]。盡管近年來手術、放療和化療手段，對腫瘤的治療起到了一定效果，但是腫瘤發(fā)病率仍呈現上升趨勢，且放化療的毒副作用、耐藥以及腫瘤轉移嚴重阻礙了腫瘤患者總生存率和生活質量。因而加強對腫瘤的預防及尋求安全有效的藥物治療腫瘤引起了人們極大關注。研究顯示化學預防藥物不僅可用于腫瘤預防[2,3]，也可在腫瘤的治療上發(fā)揮作用[4,5]，但其對腫瘤抑制作用的生物學機制尚未完全清楚，臨床上可應用的化學預防藥物甚少。因此，闡明化學預防藥物對腫瘤抑制的具體生物學機制極為重要。近期大量的研究發(fā)現，腫瘤化學預防藥物可通過影響miRNAs及其靶基因的表達發(fā)揮抗腫瘤活性作用（圖1）。這些研究為闡明化學預防藥物對腫瘤抑制的具體生物學機制提供了新的思路，也為臨床的應用提供了依據。

圖1 化學預防藥物對miRNAs及其靶基因的調控機制Fig 1 Modulation of miRNAs and their targets by anti-cancer chemopreventive agent. MicroRNAs: miRNAs; DIM: 3,3-diindolylmethane; EGCG:epigallocatechin gallate; ATRA: all-trans-retinoic-acid.

1 化學預防藥物

腫瘤化學預防是指利用天然或合成的化學制劑阻止、減緩或逆轉腫瘤的發(fā)生發(fā)展，以達到降低腫瘤的發(fā)生率和死亡率的方法[6]?；瘜W預防藥物一般是指用于腫瘤化學預防的藥物，分為天然藥物和人工合成藥物兩大類。到目前為止，已發(fā)現可能具有腫瘤預防作用的藥物96達到數百種，其中這些化合物主要是食物來源的天然化合物，常見如白蘆藜醇、吲哚類、姜黃素等；此外還包括一些傳統(tǒng)的人工合成藥物如非甾體類抗炎藥物、他汀類藥物等。近年來大量的研究表明，化學預防藥物不僅可用于腫瘤預防[2,3]，也可在腫瘤的治療中發(fā)揮作用[4]，而其防治腫瘤極為重要作用機制之一是影響miRNAs及其靶基因表達。一方面，化學預防藥物影響miRNAs及其靶基因表達抑制腫瘤細胞的增殖[7]、誘導凋亡[8]、轉移[9]和增加化療藥物敏感性發(fā)揮治療腫瘤的作用；另一方面，化學預防藥物影響miRNAs及其靶基因的表達阻斷致癌物活性[10]、減輕炎性反應[11]及干預癌前疾病[12]預防腫瘤發(fā)生。

2 MicroRNAs（miRNAs）簡介

miRNAs是在真核生物中發(fā)現的一類內源性的具有調控功能的非編碼RNA，其長度約為22個核苷酸。成熟的miRNAs是由較長的初級轉錄物經過一系列核酸酶的剪切加工而產生，隨后組裝進RNA誘導的沉默復合體（RNA-induced silencing complex, RISC），通過堿基互補配對的方式識別靶mRNA，并根據互補程度的不同指導沉默復合體降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻譯[13]。目前已明確的人類miRNAs有2,600多種（miRBase; http://www.mirbase.org/），大量的研究證實，這些miRNAs不僅參與個體發(fā)育、細胞凋亡、增殖及分化等正常生命活動[14-16]，更在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起到至關重要的作用[17,18]。同時，這些研究也揭示了miRNAs有望成為腫瘤預防和治療中干預的新靶點。

3 天然的化學預防藥物與miRNAs

3.1 白藜蘆醇 白藜蘆醇（Resveratrol）是一種從葡萄、花生等水果中提取出來的植物抗毒素，他以不同機制發(fā)揮抗腫瘤的活性如誘導DNA損傷[19]、調控信號轉導[20]，而通過調控miRNAs及其靶基因表達對腫瘤抑制是其最為重要的作用方式之一。

3.1.1 白藜蘆醇調控miRNAs及其靶基因對腫瘤的治療作用 研究[8]發(fā)現，白藜蘆醇在PANC-1、CFPAC-1和MIAPaca-2三株胰腺癌細胞中均可通過抑制miR-21靶向調控B淋巴細胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2, BCL-2）誘導腫瘤細胞凋亡。與此相應的是，研究人員在膀胱癌細胞系T24和5637中也發(fā)現同樣的調控機制[21]。另有研究[22]發(fā)現，白藜蘆醇可誘導結腸癌細胞中miR-34a的表達，且miR-34a可靶向下調E2F轉錄因子3（E2F transcription factor 3, E2F3）及其下游的去乙?；窼irt1（Sirtuin type 1）的表達抑制腫瘤細胞的增殖。此外，在肺癌H460細胞中，白藜蘆醇可誘導miR-200c的表達，而上調的miR-200c能靶向抑制RECK（reversion-inducingcysteine-rich protein with kazal motifs）基因的表達，從而激活JNK信號通路和內質網應激，最終抑制腫瘤細胞的增殖[7]。最近的一項研究[9]表明，在肺癌A549細胞中，白蘆藜醇可通過抑制miR-520h介導的信號級聯放大效應降低下游的FOXC2表達進而抑制腫瘤細胞遷移和侵襲，并且在肺癌臨床樣本中得到了相同的結論。可見，白藜蘆醇具有顯著抗腫瘤活性，在多種腫瘤中顯示了它通過影響miRNAs及其靶基因表達進而發(fā)揮抗腫瘤的作用，這為白藜蘆醇應用于腫瘤的治療提供了依據。

3.1.2 白藜蘆醇調控miRNAs對腫瘤的預防作用 有研究[10]利用白蘆藜醇抑制雌二醇誘導雌性ACI小鼠成乳腺癌的研究中發(fā)現：服用白蘆藜醇小鼠的乳腺癌發(fā)病率低于對照組，而組織芯片顯示：miR-21、miR-129、miR-204和miR-489表達量在腫瘤組織中較正常組織高。同時，檢測到與乳腺癌發(fā)生密切相關的DNA甲基轉移酶3B（DNA methyltransferase 3b, DNMT3b）在腫瘤組織中表達顯著低于正常組織。進一步研究證實：白蘆藜醇通過影響miR-21、miR-129、miR-204和miR-489與DNMT3b的表達抑制乳腺癌的發(fā)生，但DNM3b與上述幾個miRNAs的調控關系有待進一步研究。此項研究為乳腺癌的預防提供了新思路。白蘆藜醇通過誘導具有抗炎性作用的miR-101b和miR-455表達，顯著地抑制右旋糖酐硫酸酯鈉（DDS）誘導Apc(Min/+)小鼠結腸炎和息肉發(fā)生[11]，而結腸炎和息肉被認為是結腸癌的重要病因[23]。因此，白蘆藜醇可能通過介導miR-101b和miR-455預防結腸癌發(fā)生，但尋找與miR-101b和miR-455相應的靶基因有待進一步研究。

綜上所述，白藜蘆醇通過作用于miRNAs及其靶基因的表達對腫瘤抑制具有巨大潛力，但未來還應開展大量的臨床實驗進一步驗證白蘆藜醇對腫瘤抑制作用。

3.2 吲哚類 吲哚-3-甲醇（Indole-3-carbinol, I3C）是來源于十字花科蔬菜，在體內代謝產物是3,3'-二吲哚甲烷（3,3-diindolylmethane, DIM），I3C和DIM可通過調控細胞周期、細胞增殖和細胞凋亡等發(fā)揮腫瘤抑制的作用[24,25]。

3.2.1 吲哚類調控miRNAs及其靶基因對腫瘤的治療作用 研究人員[24]發(fā)現，在乳腺癌MCF-7細胞中DIM可增加miR-21的表達，重要的是，上調的miR-21通過降解細胞分裂周期25同源物A（cell division cycle 25 homolog A,CDC25A）的表達進而抑制腫瘤細胞的增殖。而在胰腺癌中研究發(fā)現，BR-DIM（生物合成的DIM）可通過抑制miR-221表達來減少對人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten, PTEN）和調控細胞周期進程的p27(kip1)、p57(kip2)基因以及p53上調凋亡調控因子（p53 up-regulated modulator of apoptosis, PUMA）基因作用，從而抑制腫瘤細胞的增殖和遷移[25]。值得關注的是，Paik等[26]研究顯示，I3C可通過調控miR-21的表達增加吉西他濱對胰腺癌的化療敏感性，大大提高了吉西他濱的療效。

3.2.2 吲哚類調控miRNAs及其靶基因對腫瘤的預防作用Melkamu等[27]用I3C抑制乙烯基氨基甲酸酯誘導A/J系小鼠成瘤過程研究結果顯示：服用乙烯基氨基甲酸酯加I3C的小鼠成瘤率低于僅服用乙烯基氨基甲酸酯的對照組，而miRNA芯片顯示：實驗中miR-21、miR-31、miR-130a、miR-146b和miR-377的表達顯著低于對照組，但都高于正常組織。進一步研究發(fā)現，miR-21可靶向降解程序性細胞死亡4（programmed cell death 4, PDCD4）進而誘導細胞增殖。因此，以上研究表明I3C可通過調控癌基因miR-21來防致癌物的成瘤作用，而深入研究I3C調控miRNAs及其靶基因的機制將對I3C預防腫瘤的發(fā)生具有重要的指導意義。

3.3 姜黃素 姜黃素（Curcumin）是姜科姜黃屬植物的天然產生的多酚，近期研究[28-31]發(fā)現，姜黃素在多種腫瘤中可通過影響miRNAs及其靶基因發(fā)揮抑制腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲和誘導細胞凋亡作用，并且還可增加化療藥物的敏感性。

3.3.1 姜黃素調控miRNAs及其靶基因對腫瘤的治療作用在乳腺癌中，姜黃素處理乳腺癌MCF-7細胞后miR-15a和miR-16表達顯著上升，且二者共同靶向作用于Bcl-2基因進而引起腫瘤細胞凋亡[28]。此外，姜黃素在乳腺癌MDAMB-231細胞系中可上調miR-181b發(fā)揮抑制腫瘤細胞增殖和誘導凋亡的作用，進一步研究[29]發(fā)現，上調的miR-181b還可靶向作用趨化因子CXCL1抑制了腫瘤細胞的遷移。在視網膜母細胞瘤中，姜黃素處理視網膜母細胞瘤細胞能顯著上調miR-22表達，而上調miR-22可靶向作用于表皮生長因子受體3（Erb-b2 receptor tyrosine kinase 3,ErbB3）進而抑制腫瘤細胞增殖和遷移[30]。在鼻咽癌中，Gao等[31]研究發(fā)現，姜黃素通過抑制鼻咽癌HONE1細胞中miR-125a-5p靶向作用于TP53基因來抑制腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲。以上的研究顯示了姜黃素對腫瘤的抑制作用潛力巨大。

值得關注的是，姜黃素還可通過調控miRNAs的表達增加化療藥物的療效。研究[32]發(fā)現用姜黃素處理肺癌A549細胞系，miR-186*表達顯著下調，進一步研究證實，miR-186*是通過靶向調控caspase家族蛋白酶Caspase-10誘導肺癌細胞凋亡。令人感興趣的是，相同的結論在人肺腺癌耐藥細胞株A549/DDP也得以驗證[33]。另一項研究中，Noratto等[34]證實在結腸癌HT-29和SW-480細胞中，類姜黃素可通過誘導miR-27a-ZBTB10-Sp信號軸增加5-氟尿嘧啶的化療敏感性，大大提高了5-氟尿嘧啶對結腸癌細胞的殺傷作用。這些研究為改善化療藥物的耐藥提供了新的思路。

3.3.2 姜黃素調控miRNAs及其靶基因對腫瘤的預防作用 Hassan等[12]研究發(fā)現，姜黃素可通過抑制四氯化碳（CCL4）誘導小鼠肝纖維化及肝硬化，進一步研究發(fā)現，miR-199和miR-200在這此過程中發(fā)揮著關鍵作用。而另一項研究中，姜黃素也可通過上調miR-29b靶向作用DNA 甲基轉移酶3b（DNA methyltransferase 3b, DNMT3b）降低PTEN基因的DNA甲基化水平進而抑制肝纖維化及肝硬化[35]。重要的是，肝硬化屬于肝癌的高危因素[36]，這一定程度說明姜黃素可預防肝癌的發(fā)生。

姜黃素對腫瘤的防治有著巨大潛力，但在體內的低生物活性限制了它的抗腫瘤效果。因此，對于如何提高姜黃素的體內活性有待于進一步研究。

在構建教學環(huán)境的過程中，為了激發(fā)出學生對課堂的興趣，則可以將“游戲場”這一概念應用在其中。在此過程中將學生作為教學的中心，使其感受到學習的樂趣，進而激發(fā)出學生對課堂的學習興趣。在該種教學情境中，學生能夠主動參與到學習中，教師能夠將實際生活場景與知識相互結合，最終達到培養(yǎng)學生批判性思維的目的。在此過程中，在正式上課之前，教師需要預測課堂中可能會出現的問題，對學生的情緒展開適當調節(jié)，這種方式能夠使學生在課堂中始終保持較高的積極性。

3.4 染料木黃酮 染料木黃酮（Genistein）是一種大量存于大豆中并已被廣泛研究具有化學預防作用的異黃酮[37]。大量的研究顯示了染料木黃酮在前列腺癌[38]、腎癌[39]和胰腺癌[40]中可通過miRNAs及其靶基因抑制細胞增殖、侵襲、遷移和誘導細胞凋亡。

3.4.1 姜黃素調控miRNAs及其靶基因對腫瘤的治療作用在前列腺癌中，研究證實染料木黃酮可調控miR-1296、miR-34a和miR-1260b的表達來影響腫瘤細胞的增殖。Majid等[38]發(fā)現，染料木黃酮在前列腺癌PC-3細胞系中可誘導miR-1296的表達，且上調的miR-1296可通過抑制微小染色體維持蛋白2（minichromosome maintenance complex component 2, MCM2）的表達抑制腫瘤細胞增殖。而Xia等[41]研究發(fā)現，染料木黃酮能誘導前列腺細胞中miR-34a的表達，并靶向下調Notch-1基因抑制增殖并誘導細胞凋亡。另有研究[42]發(fā)現，染料木黃酮可上調的前列腺癌PC3 和DU145細胞中miR-34a的表達，重要的是，miR-34a可下調HOX轉錄反義RNA（HOX transcript antisense RNA,HOTAIR）而抑制細胞增殖、遷移、侵襲和誘導凋亡。新近研究[43]顯示，染料木黃酮還可下調前列腺癌細胞中miR-1260b的表達抑制腫瘤細胞增殖和侵襲?？梢?，染料木黃酮可通過對miR-1296、miR-34a、miR-1260b及其靶基因的調控對前列腺癌起治療作用。

除了前列腺癌，染料木黃酮還在其他多種惡性腫瘤中調控miRNAs及其靶基因發(fā)揮治療的作用。在腎癌中，染料木黃酮通過調控miR-1260b表達抑制Wnt信號通路進而抑制細胞增殖，侵襲并促細胞凋亡[39]。在胰腺癌中，染料木黃酮通過抑制miR-223的表達上調泛素連接酶FBW7進而抑制細胞增殖和誘導細胞凋亡[40]。在另一項研究[44]中，染料木黃酮可通過調控miR-27a的表達抑制細胞的增殖、遷移并誘導細胞凋亡。

3.5 表沒食子兒茶素沒食子酸酯 表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate, EGCG）是來自綠茶的多酚，研究證實其在人類多種腫瘤中具有抗癌的特性。

EGCG調控miRNAs及其靶基對腫瘤的治療作用：在人惡性神經母細胞瘤中，Chakrabarti研究小組[45,46]證實，EGCG可引起惡性神經母細胞瘤SH-SY5Y和SK-N-DZ細胞中miR-92、miR-93和miR-106b的下調，同時也上調miRNAs（miR-7-1、miR-34a和miR-99a），進一步研究發(fā)現，上調的miR-7-1可顯著誘導神經母細胞瘤細胞的凋亡。在肝癌中，研究[47]發(fā)現EGCG可誘導肝癌HepG2細胞中miR-16的表達，而上調的miR-16可靶向抑制Bcl-2基因進而誘導肝癌細胞的凋亡。在肺癌中，EGCG可通過介導肺癌H1299和H460細胞中缺氧誘導因子1-α（hypoxia inducible factor 1 alpha, HIF1α）誘導抑癌作用miR-210的表達來抑制腫瘤細胞增殖[48]。以上研究表明，EGCG主要是通過影響miR-7-1、miR-16和miR-210表達發(fā)揮其抗腫瘤活性。

此外，EGCG也能影響miRNA的表達提高化療藥物的敏感性。研究[49]發(fā)現在肺癌A549細胞系中，EGCG可通過抑制miR-98-5p來提高化療藥順鉑的敏感性和提高抑癌基因p53的表達發(fā)揮抗腫瘤作用。未來可用EGCG和順鉑聯合治療肺癌，這樣可減少肺癌患者順鉑耐藥的程度。

4 合成化學預防藥物與miRNAs

4.1 塞來昔布 塞來昔布（Celecoxib）是全球首個選擇性非甾體抗炎鎮(zhèn)痛藥，具有抗炎、鎮(zhèn)痛等作用。近期研究[52]發(fā)現，塞來昔布處理結腸癌HT-29細胞系可抑制腫瘤細胞增殖，進一步研究發(fā)現，這與28個異常表達的miRNAs如顯著上調的miR-552、miR-96等，和顯著下調的miR-145*、miR-571等密切相關。Saito等[53]在胃癌中研究證實，miR-29c在胃癌組織中表達低于正常的胃粘膜組織，而服用塞來昔布miR-29c顯著表達，進一步研究發(fā)現，miR-29c靶向抑制癌基因Mcl-1（myeloid cell leukemia-1）的表達進而誘導癌細胞的凋亡。以上結果表明塞來昔布可作用miRNAs發(fā)揮抗腫瘤特性，今后更多的基礎和臨床研究可能利用塞來昔布治療腫瘤。

4.2 硫化舒林酸 硫化舒林酸（Sulindac sulfide）屬于NSAIDs的一員，大量研究[54-56]顯示，NSAIDs中舒林酸硫化物具有抑制腫瘤細胞增殖和誘導細胞凋亡作用，但很少報道它能抑制腫瘤轉移的作用。而近期的一項研究[57]顯示，硫化舒林酸在結腸癌HCT116細胞中可通過抑制核轉錄因子kappa B（nuclear factor of kappa B, NF-κB）來影響4個已證實具有抑制腫瘤侵襲的miRNAs（miR-10b、miR-17、miR-21和miR-9）的表達進而抑制腫瘤細胞的轉移。以上的研究提示，miRNAs在功能上參與舒林酸硫化物的抗侵襲和轉移活性，但其具體調控的靶基因有待進一步研究。因此，未來硫化舒林酸可能通過作用于miRNAs來發(fā)揮抗腫瘤作用。

4.3 阿司匹林 阿司匹林（Aspirin）也是NSAIDs的一種，作為一種可降低結直腸癌發(fā)病率及病死率的藥物引起人們的關注，但對其具體的機制未完全闡明。研究[58]發(fā)現，在人骨肉瘤U2OS細胞中，阿司匹林可通過抑制NF-kB的活性來誘導miR-34a過表達進而促進腫瘤細胞凋亡。最近的一項研究[59]發(fā)現，在結腸癌中發(fā)現阿司匹林能抑制miR-21的表達，而下調miR-21可通過激活β-catenin/TCF4信號進而抑制癌細胞的增殖。上述研究說明，阿司匹林通過影響miRNAs及其靶基因表達發(fā)揮抗腫瘤作用，也為理解阿司匹林預防腫瘤提供了新思路。

4.4 阿伐他汀 阿伐他?。ˋtorvastatin）是他汀藥物的一種，目前主要用于降低高膽固醇，其所能抑制的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶現亦已被認為在腫瘤發(fā)展中起著一定作用。研究[60]發(fā)現，在前列腺癌PC3細胞中，阿伐他汀以一種劑量和時間依賴性的方式抑制腫瘤細胞的增殖，進一步研究發(fā)現，阿伐他汀通過誘導miR-182表達和抑制Bcl-2基因發(fā)揮抑制腫瘤細胞增殖的作用，而Bcl-2被鑒定為miR-182潛在的靶基因。此項研究提示了阿伐他汀可影響miR-182及其靶基因Bcl-2表達抑制腫瘤增殖。雖然這只是細胞水平的研究，但在一定程度揭示了阿伐他汀具有抗腫瘤的作用。

4.5 二甲雙胍 二甲雙胍（Metformin）是一種用于治療2型糖尿病的口服降糖藥，而近期大量的流行病學研究提示二甲雙胍可降低惡性腫瘤的發(fā)生和死亡率，其可能機制是通過影響一些抑制腫瘤干細胞效應的miRNAs和致癌功能的miRNAs表達來發(fā)揮抗腫瘤作用。研究發(fā)現在乳腺癌中，miRNAs如let-7表達下降引起細胞持續(xù)進展性的去分化效應（如上皮細胞間質化）使之發(fā)生“干細胞化”樣改變[61]，而腫瘤干細胞對腫瘤的增殖、轉移及復發(fā)具有重要作用。二甲雙胍可通過上調惡變前的細胞let-7的表達可逆轉這一效應，可阻斷腫瘤細胞的細胞轉變及腫瘤干細胞的形成[62]。在胰腺癌中，二甲雙胍可誘導胰腺癌細胞中部分miRNAs如let-7a、let-7b、miR-26a、miR-101、miR-200b和miR-200c表達，進一步研究[63]發(fā)現，通過轉染使miR-26a的再表達降低了腫瘤干細胞特異性基因的表達水平。此外，二甲雙胍存在計量依賴性方式誘導胰腺癌細胞中miR-26a、let-7c、miR-192表達，而上調的miR-26a可通過靶作用高遷移率族蛋白A1（high mobility group protein, HMGA1）抑制細胞增殖、侵襲、遷移和誘導細胞凋亡，并且相同的結論在裸鼠異種移植模型中也得以驗證[64]。近期研究[65]發(fā)現，在肺癌A549細胞和NCI-H358細胞中二甲雙胍可抑制miR-222的表達，下調的miR-222可減少對靶基因P27、P57和PTEN的降解，進而抑制腫瘤細胞增殖。可見，二甲雙胍通過影響miRNAs的表達發(fā)揮抗腫瘤活性。

5 結語與展望

化學預防藥物與miRNAs是近年來的研究熱點。化學預防藥物通過影響miRNAs及其作用的靶基因表達發(fā)揮的抗腫瘤特性，揭示了化學預防藥物對腫瘤抑制的具體生物學作用機制。由于上述化學預防藥物在細胞水平和動物水平證實具有較好的抗腫瘤效果，大批化學預防藥物在治療腫瘤的臨床試驗已經開展。因此，化學預防藥物在腫瘤的防治研究工作中具有巨大潛力。綜上，化學預防藥物通過影響miRNAs及其靶基因表達作為腫瘤防治的新方法可提高腫瘤患者總生存率和生活質量，為腫瘤預防帶來了新的希望。