吉非替尼可能通過(guò)EGFR啟動(dòng)子甲基化誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞繼發(fā)性耐藥

王起龍 李敏 胡成平

分子靶向治療在肺癌的臨床治療中表現(xiàn)出了良好的應(yīng)用前景。表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidemal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI）研究[1,2]結(jié)果顯示，TKI治療效果顯著的患者存在基因突變，以19外顯子缺失和21外顯子的突變?yōu)橹?。然而隨著EGFR-TKI治療方案的臨床推廣，耐藥問(wèn)題逐漸出現(xiàn)，成為了新的研究熱點(diǎn)。大多數(shù)EGFR突變陽(yáng)性的非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）患者在初始治療大約6個(gè)月-12個(gè)月后會(huì)出現(xiàn)耐藥，從而導(dǎo)致TKI失效；而部分患者即使攜帶EGFR活化突變，仍對(duì)TKI不敏感。

臨床發(fā)現(xiàn)的耐藥主要包括原發(fā)性耐藥和繼發(fā)性耐藥兩大類(lèi)，原發(fā)性耐藥的主要機(jī)制為原發(fā)性耐藥突變、次級(jí)藥物暴露程度，細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡障礙等。繼發(fā)性耐藥則主要包括了EGFR的二次突變、藥物暴露程度，異常小分子激活EGFR通路、組織學(xué)類(lèi)型轉(zhuǎn)化等機(jī)制[3-5]。TKI繼發(fā)性耐藥已被認(rèn)為有多重途徑，以上幾種機(jī)制均是在基因水平解釋TKI繼發(fā)性耐藥。目前大量的證據(jù)表明基因二次突變是藥物繼發(fā)性耐藥機(jī)制的重要組成部分。然而，基因組學(xué)在相對(duì)較快的耐藥以及藥物應(yīng)答可逆性方面的解釋仍然顯得不那么充分。研究[5,6]證實(shí)，部分耐藥患者靶點(diǎn)基因未發(fā)現(xiàn)突變，也有一些患者旁路被激活。提示除基因組學(xué)機(jī)制外可能還存在其他繼發(fā)性耐藥機(jī)制。

表觀遺傳學(xué)是重要遺傳學(xué)分支學(xué)科，主要研究表觀遺傳變異。表觀遺傳變異是指在基因的DNA序列沒(méi)有改變，基因功能卻發(fā)生可遺傳的變化，并最終導(dǎo)致生物表型發(fā)生變化。甲基化則是表觀遺傳學(xué)研究中基因組DNA一種主要的表觀遺傳修飾形式，可調(diào)節(jié)基因組功能。DNA甲基化過(guò)程主要通過(guò)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase,DNMT）來(lái)催化。有研究表明：多種肺腺癌細(xì)胞株進(jìn)行比較，對(duì)TKI敏感性高的細(xì)胞株EGFR啟動(dòng)子區(qū)域甲基化程度低，而敏感性低的細(xì)胞株對(duì)應(yīng)甲基化程度高[7]。我們推斷吉非替尼可能誘導(dǎo)PC9細(xì)胞對(duì)其產(chǎn)生繼發(fā)性耐藥，以及EGFR啟動(dòng)子甲基化可能在該過(guò)程中起到作用，以期為肺腺癌耐藥提供新的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺腺癌PC9細(xì)胞株（對(duì)EGFR-TKI敏感）和耐藥細(xì)胞株P(guān)C9/GR0（對(duì)EGFR-TKI耐藥）購(gòu)自廣州肺癌研究所；液體RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；MTT購(gòu)自南京凱基生物科技有限公司；5-Azadc（DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。總RNA抽提試劑Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本東洋紡公司；EGFR探針引物和GAPDH探針引物購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；吉非替尼粉劑購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司，溶解于DMSO，制成實(shí)驗(yàn)相應(yīng)濃度1,000倍的溶液，分裝保存于-20 ℃冰箱中備用，實(shí)驗(yàn)時(shí)用培養(yǎng)液稀釋至目標(biāo)濃度，使終溶液中DMSO體積分?jǐn)?shù)低于0.1%。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將PC9細(xì)胞株培養(yǎng)于含有10%胎牛血清培養(yǎng)液中，接種于培養(yǎng)瓶，放于37 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。次日換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每?jī)商旄鼡Q一次細(xì)胞培養(yǎng)液（含有10%胎牛血清的RPMI-1640），長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶后進(jìn)行消化傳代，待傳代至3代后，80%貼壁的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。5-Aza-dc干預(yù)吉非替尼耐藥細(xì)胞株P(guān)C9/GR取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC9/GR細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)，0.25%胰蛋白酶消化成細(xì)胞懸液，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，分組如下：實(shí)驗(yàn)組：培養(yǎng)PC9/GR細(xì)胞，加入1 μmol/L 5-Aza-dc干預(yù)72 h，參考研究[8]；對(duì)照組：同期培養(yǎng)不加藥的肺癌PC9/GR細(xì)胞，加入等容積的DMSO，作為5-Aza-dc干預(yù)前狀態(tài)。待細(xì)胞貼壁后，對(duì)照組每24 h更換培養(yǎng)液一次，而實(shí)驗(yàn)組均每24 h更換含相應(yīng)濃度5-Aza-dc的培養(yǎng)液一次。

1.3 MTT法檢測(cè)PC9細(xì)胞半數(shù)抑制濃度 集對(duì)數(shù)期的細(xì)胞，調(diào)整懸浮液中細(xì)胞的濃度，每孔加入100 μL懸浮液，鋪板使待測(cè)細(xì)胞調(diào)密度至8,000/孔（邊緣孔使用無(wú)菌PBS填充）。5%CO2、37 ℃孵育，至細(xì)胞單層貼壁（96孔板），加入濃度梯度藥物吉非替尼（0 μmol/L, 0.01 μmol/L, 0.1 μmol/L,1 μmol/L, 10 μmol/L, 100 μmol/L）。5%CO2、37 ℃條件下孵育48 h，使用倒置顯微鏡下觀察。終止培養(yǎng)，然后小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。這時(shí)每孔中快速加入150 μL DMSO，置于搖床上振蕩10 min，充分溶解結(jié)晶物。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀吸光度（optical delnsity, OD）550 nm處測(cè)量各孔的吸光值。

使用改良寇式法進(jìn)行結(jié)果的計(jì)算，可得出細(xì)胞的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration, IC50）。具體公式為：lgIC50=Xm-I[P-(3-Pm-Pn)/4]。

1.4 耐藥細(xì)胞株P(guān)C9/GR的制備 肺腺癌細(xì)胞株P(guān)C9（對(duì)EGFR-TKI敏感）購(gòu)自廣州呼吸病研究所。經(jīng)過(guò)傳代培養(yǎng)之后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，使用逐步提升濃度體外誘導(dǎo)法誘導(dǎo)其產(chǎn)生耐藥。首先使用MTT法測(cè)定吉非替尼對(duì)敏感細(xì)胞PC9的IC50為（0.01±0.002）μmol/L，然后使用含有0.01 μmol/L吉非替尼的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)48 h，之后更換不含有吉非替尼的培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d-7 d，至細(xì)胞能夠穩(wěn)定生長(zhǎng)并傳代2次，此時(shí)再次測(cè)定IC50。然后使用含有0.02 μmol/L吉非替尼的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)48 h，之后更換含有0.01 μmol/L吉非替尼的培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d-7 d，至細(xì)胞能夠穩(wěn)定生長(zhǎng)并傳代2次，此時(shí)再次測(cè)定IC50。以此類(lèi)推，逐漸提升藥物濃度梯度為0.01 μmol/L、0.02 μmol/L、0.05 μmol/L、0.1 μmol/L、0.2 μmol/L、0.4 μmol/L、1 μmol/L、1.6 μmol/L、3 μmol/L。直至最后，細(xì)胞在含有3 μmol/L吉非替尼的培養(yǎng)基中可以穩(wěn)定生長(zhǎng)，最后檢測(cè)此時(shí)處理后的吉非替尼的IC50值，將其命名為PC9/GR，并與所購(gòu)買(mǎi)的PC9/GR0進(jìn)行對(duì)比，以驗(yàn)證其是否達(dá)到吉非替尼耐藥標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 BSP法檢測(cè)甲基化水平 取敏感株及耐藥株細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，72 h后回收，提取細(xì)胞DNA，使用亞硫酸鹽進(jìn)行甲基化修飾，之后再純化亞硫酸鹽修飾的DNA，然后以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。甲基化特異性引物：上游5’-GTTATAGGGGTAGTGGGATATT-3’，下游5’-TAAACAAACTAACCR AACC TTA-3’。PCR反應(yīng)體系包括10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP Mix 0.5 μL，PCR Primer（igf2 F/igf2 R）0.5 μL/0.5 μL，Template 1 μL，rTaq 0.5 μL，ddH2O 19.5 μL定容至25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。將PCR產(chǎn)物與T載體進(jìn)行連接，之后進(jìn)行大腸桿菌的轉(zhuǎn)化、重組菌的鑒定。使用BiQ Analyzer分析軟件對(duì)DNA序列和測(cè)序序列進(jìn)行比對(duì)。

1.6 逆轉(zhuǎn)錄PCR 取所培養(yǎng)的不同階段細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，72 h后回收。Trizol法提取細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀擴(kuò)增，GAPDH為內(nèi)參。實(shí)時(shí)熒光定量PCR：反應(yīng)體系20 μL體系中，SYBR qPCR Mix 10 μL，上下游引物Mix 1.2 μL（6 pmol），50X ROX reference 0.4 μL（ABI 7500RT-PCR儀器用0.4 μL），cDNA 4 μL，滅菌蒸餾水4.4 μL補(bǔ)齊體系。反應(yīng)條件：95 ℃ 60 s預(yù)變性。95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。每組設(shè)置3個(gè)平行復(fù)孔，以△Ct值對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行中每組重復(fù)3次以上，使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料的檢測(cè)結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，兩組均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，率的比較采用卡方檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EGFR基因啟動(dòng)子甲基化與PC9細(xì)胞吉非替尼耐藥的相關(guān)性

2.1.1 PC9及PC9/GR細(xì)胞形態(tài)學(xué) 倒置顯微鏡鏡下見(jiàn)人肺癌細(xì)胞PC9（吉非替尼敏感細(xì)胞）（圖1A）與PC9/GR（吉非替尼耐藥細(xì)胞）（圖1B）形態(tài)呈上皮細(xì)胞狀，以貼壁方式生長(zhǎng)，貼壁后呈長(zhǎng)梭形，形態(tài)無(wú)明顯區(qū)別。

2.1.2 PC9及PC9/GR細(xì)胞對(duì)吉非替尼的耐藥性

2.1.2.1 吉非替尼對(duì)PC9細(xì)胞增殖的影響 根據(jù)公式求出吉非替尼干預(yù)PC9細(xì)胞以及PC9/GR細(xì)胞48 h的半數(shù)抑制濃度IC50分別為（0.01±0.002） μmol/L、（3.95±0.23） μmol/L（表1、表2）。

2.1.2.2 PC9/GR細(xì)胞對(duì)吉非替尼的耐藥程度及誘導(dǎo)過(guò)程PC9/GR對(duì)吉非替尼的耐藥指數(shù)為吉非替尼對(duì)PC9/GR細(xì)胞的IC50除以吉非替尼對(duì)PC9細(xì)胞的IC50

經(jīng)過(guò)吉非替尼逐步提升濃度體外誘導(dǎo)法干預(yù)肺癌敏感細(xì)胞株P(guān)C9，吉非替尼對(duì)于PC9細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度隨誘導(dǎo)濃度的上升而不斷上升（圖2）。最終經(jīng)過(guò)3 μmol/L吉非替尼干預(yù)后所得的PC9細(xì)胞根據(jù)上述公式算得耐藥指數(shù)為395。由于其耐藥指數(shù)大于300，且與所購(gòu)買(mǎi)的耐藥細(xì)胞株P(guān)C9/GR0的耐藥指數(shù)（378）進(jìn)行比較，耐藥程度一致，成功建立模型，命名為PC9/GR細(xì)胞，確定為耐吉非替尼的肺癌細(xì)胞株，進(jìn)行下一步的肺癌研究。

2.1.3 PC9及PC9/GR細(xì)胞的EGFR基因啟動(dòng)子甲基化水平檢測(cè) 研究檢測(cè)了位于人類(lèi)EGFR基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平，這一區(qū)域共檢測(cè)出83個(gè)甲基化位點(diǎn)進(jìn)行比較。每個(gè)樣本經(jīng)過(guò)亞硫酸氫鹽處理后挑選10個(gè)左右克隆測(cè)序，結(jié)果所示，發(fā)生異常甲基化位點(diǎn)的甲基化水平變化PC9：59%；PC9/GR：74%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖3）。

2.1.4 PC9及PC9/GR細(xì)胞的EGFR基因表達(dá) 經(jīng)過(guò)0.8 μmol/L及3 μmol/L吉非替尼處理得到的PC9/GR細(xì)胞株mRNA表達(dá)較未經(jīng)過(guò)吉非替尼處理的敏感細(xì)胞株P(guān)C9明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖4）。

2.2 5-Aza-dc干預(yù)PC9/GR細(xì)胞株TKI敏感性的逆轉(zhuǎn)

2.2.1 經(jīng)5-Aza-dc處理后PC9/GR細(xì)胞形態(tài)學(xué) 在倒置顯微鏡鏡下見(jiàn)人肺腺癌耐藥細(xì)胞PC9/GR細(xì)胞（圖5A）形態(tài)呈上皮細(xì)胞狀，貼壁方式生長(zhǎng)，貼壁后呈長(zhǎng)梭形，經(jīng)5-Aza-dc處理后（圖5B）形態(tài)無(wú)明顯區(qū)別。

圖 1 人肺腺癌細(xì)胞PC9（吉非替尼敏感細(xì)胞）（A）及人肺腺癌細(xì)胞PC9/GR（吉非替尼耐藥細(xì)胞）（B）Fig 1 Human lung adenocarcinoma cell PC9 (gefitinib sensitive) (A)and human lung adenocarcinoma cell PC9/GR (gefitinib resistant) (B)

圖 2 不同濃度（μmol/L）吉非替尼誘導(dǎo)PC9細(xì)胞株耐藥過(guò)程中IC50（μmol/L）Fig 2 The half maximal inhibitory concentration (IC50) (μmol/L) of PC9 cell in the process of gefitinib resistance

2.2.2 經(jīng)5-Aza-dc處理后PC9/GR細(xì)胞的耐藥指數(shù)的變化 吉非替尼干預(yù)PC9細(xì)胞的IC50為（2.55±0.14）μmol/L（表3）。對(duì)照組未經(jīng)5-Aza-dc處理的PC9/GR細(xì)胞的IC50為（3.87±0.034）μmol/L（表4）。兩者相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖 3 PC9細(xì)胞株EGFR啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平（A）及PC9/GR細(xì)胞株EGFR啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平（B）Fig 3 The methylation of EGFR promoter in PC9 cells (A) and the methylation of EGFR promoter in PC9/GR cells (B)

圖 4 不同耐藥程度PC9細(xì)胞EGFR mRNA水平Fig 4 The epidermal growth factor receptor (EGFR) mRNA level of PC9 cell

3 討論

圖 5 人肺腺癌耐藥細(xì)胞PC9/GR細(xì)胞（A）和5-Aza-dc處理后人肺腺癌耐藥細(xì)胞PC9/GR細(xì)胞（B）Fig 5 Human lung adenocarcinoma cell PC9/GR (A) and human lung adenocarcinoma cell PC9/GR after treated with 5-Aza-dc (B)

表 1 吉非替尼對(duì)PC9細(xì)胞增殖的影響Tab 1 Influence of gefitinib to PC9's proliferation

表 2 吉非替尼對(duì)PC9/GR細(xì)胞增殖的影響Tab 2 Influence of gefitinib to PC9/GR's proliferation

表 3 吉非替尼對(duì)干預(yù)組PC9/GR細(xì)胞增殖的影響Tab 3 Influence of gefitinib to PC9/GR's proliferation in experiment group

表 4 吉非替尼對(duì)對(duì)照組PC9/GR細(xì)胞增殖的影響Tab 4 Influence of gefitinib to PC9/GR's proliferation in control group

本實(shí)驗(yàn)選用吉非替尼藥物濃度遞增的方法來(lái)進(jìn)行耐藥細(xì)胞模型的建立，最終結(jié)果顯示其耐藥性達(dá)到了耐藥標(biāo)準(zhǔn)，且與購(gòu)買(mǎi)的耐藥細(xì)胞相比具有良好的一致。耐藥肺癌細(xì)胞株P(guān)C9/GR的IC50較敏感株P(guān)C9的IC50明顯升高，這種細(xì)胞模型優(yōu)點(diǎn)在于更貼近臨床患者產(chǎn)生耐藥的過(guò)程，其造模時(shí)間約為4個(gè)月（第28代細(xì)胞），與臨床出現(xiàn)耐藥的時(shí)間大致吻合。

實(shí)驗(yàn)表明，PC9/GR細(xì)胞株甲基化水平與PC9細(xì)胞株相比，異常甲基化升高。TKI耐藥的肺癌細(xì)胞其EGFR啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平較TKI敏感的肺癌細(xì)胞更高。在多種腫瘤已經(jīng)證實(shí)，DNA啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化狀態(tài)和腫瘤耐藥可能相關(guān)。Scartozzi等[9]進(jìn)行52例結(jié)直腸癌的EGFR基因甲基化水平和EGFR單克隆抗體治療敏感性之間關(guān)系的分析，結(jié)果顯示，EGFR基因出現(xiàn)甲基化患者的疾病控制率和客觀緩解率均顯著低于EGFR基因未甲基化患者。Montero等[10]研究表明，存在有EGFR基因甲基化的乳腺癌細(xì)胞株CAMA1和MB453對(duì)吉非替尼敏感性低。EGFR表達(dá)量的變化可能是甲基化水平變化的一個(gè)影響結(jié)果。不同種類(lèi)肺癌細(xì)胞株的EGFR mRNA表達(dá)水平和啟動(dòng)子甲基化水平存在差別，產(chǎn)生差異的分子機(jī)制尚不明確。另外，同一種細(xì)胞的EGFR啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平也可能有多種途徑調(diào)控，甲基化也可能影響EGFR表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，耐藥株細(xì)胞EGFR基因的mRNA表達(dá)量較敏感株高，與某些研究的不同種肺癌細(xì)胞株的結(jié)果相異，推測(cè)啟動(dòng)子甲基化不是影響EGFR mRNA表達(dá)的唯一原因。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示經(jīng)去甲基化藥物5-Aza-dc處理之后，耐藥細(xì)胞株P(guān)C9/GR對(duì)吉非替尼的敏感性有所回升，提示去甲基化藥物5-Aza-dc作用于PC9/GR后，可以使其耐藥性在一定程度上逆轉(zhuǎn)，吉非替尼對(duì)PC9的抑制增殖作用加強(qiáng)。研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合使用去甲基化藥物5-Aza-dc可以增強(qiáng)原TKI不敏感肺腺癌細(xì)胞株H1650、H1299對(duì)吉非替尼的敏感性。同樣類(lèi)似的結(jié)果可以在其余腫瘤的治療中發(fā)現(xiàn)。張曉偉等的研究提示，DNA甲基化和鼻咽癌細(xì)胞紫杉醇的耐藥形成有關(guān)，使用5-aza-dc對(duì)鼻咽癌紫杉醇敏感細(xì)胞以及紫杉醇耐藥細(xì)胞的增殖均有一定的抑制作用，而紫杉醇耐藥細(xì)胞對(duì)其表現(xiàn)出更高的敏感性。經(jīng)5-aza-dc處理之后的耐藥細(xì)胞對(duì)紫杉醇藥物的敏感性明顯上升，從而可以部分程度逆轉(zhuǎn)鼻咽癌對(duì)紫杉醇的化療耐藥[11]。5-Aza-dc是一種常用的去甲基化藥物，其臨床藥物已經(jīng)被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)使用于血液系統(tǒng)惡性腫瘤治療當(dāng)中，在多種實(shí)體瘤的應(yīng)用同時(shí)正在臨床研究中，然而，由于其在各臨床研究中所用劑量普遍較高，副作用較大，實(shí)體瘤的研究中并未得到預(yù)想的結(jié)果。然而，低劑量的應(yīng)用方法被一些研究者認(rèn)同。本試驗(yàn)采用低劑量干預(yù)[8,12]，結(jié)果顯示在一定程度上吉非替尼藥物敏感性恢復(fù)。

總之，PC9細(xì)胞株繼發(fā)性TKI耐藥后，其EGFR啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平升高。使用去甲基化藥物5-Aza-dc干預(yù)后，其對(duì)吉非替尼的敏感性在一定程度上恢復(fù)，其繼發(fā)性耐藥的出現(xiàn)可能與EGFR啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平升高有關(guān)。