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    EFEMP1通過下調(diào)MMP-7表達(dá)抑制肺癌細(xì)胞生長和侵襲

    2015-09-03 01:53:40郎媛媛孟潔宋曉萌陳小軍
    中國肺癌雜志 2015年2期
    關(guān)鍵詞:熒光素酶甲基化克隆

    郎媛媛 孟潔 宋曉萌 陳小軍

    在眾多癌癥中,肺癌的死亡率位居第一位,通常5年生存率低于20%,大多數(shù)患者死于肺癌轉(zhuǎn)移[1]。但是,迄今為止,肺癌的侵襲與轉(zhuǎn)移機(jī)制尚未闡明。Fibulin家族蛋白是一種表達(dá)廣泛的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(extracellular matrix,ECM),迄今為止共發(fā)現(xiàn)七個(gè)成員(fibulin 1-7),它們在結(jié)構(gòu)上具有相似性,都有數(shù)個(gè)重復(fù)的表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域和一個(gè)獨(dú)特的C末端結(jié)構(gòu)域,并且在調(diào)節(jié)細(xì)胞與細(xì)胞間,細(xì)胞與外基質(zhì)間相互聯(lián)系中起重要作用[2]。越來越多的證據(jù)[3]表明fibulin家族蛋白在癌癥侵襲轉(zhuǎn)移過程中也起重要作用,它們在多種癌癥細(xì)胞中表達(dá)異常,可以促進(jìn)或抑制癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。

    包含表皮生長因子的fibulin類細(xì)胞外基質(zhì)蛋白1(EGF containing fibulin-like extracellular matrix protein 1,EFEMP1),即fibulin 3,是一種與細(xì)胞代謝密切相關(guān)的重要細(xì)胞間粘附分子[2,3]。本研究旨在探討EFEMP1影響肺癌細(xì)胞生長和侵襲轉(zhuǎn)移的生物學(xué)作用及其機(jī)制,以期為闡明肺癌侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制及為肺癌的靶向治療提供重要線索。

    1 材料與方法

    1.1 主要試劑和儀器 本研究所用肺癌細(xì)胞系購于ATCC,RPMI-1640培養(yǎng)液、胎牛血清和胰蛋白酶均購自Gibco公司,EFEMP1抗體購自Abcam,基質(zhì)金屬蛋白酶7(matrix metalloproteinase-7,MMP-7)抗體購自EMD BioSciences,實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒購于RT-PCR試劑盒購自Promega公司,基因組DNA提取試劑盒購自Qiagen公司,MSP試劑盒購于ZYMO Research,5-aza-2’-deoxycytidine購于Sigma,Luciferase檢測試劑購于Promega公司,ECL免疫印跡底物試劑盒購自Millipore公司,Transwell培養(yǎng)板購于BD Biosciences,PCR儀:Thermo熒光檢測儀:Perkinelmer。

    1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 本研究所用肺癌細(xì)胞系培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基,外加100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素,置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。去甲基化實(shí)驗(yàn)中,細(xì)胞培養(yǎng)于5 μmol/L 5-aza-2’-deoxycytidine,共培養(yǎng)6天,其中第1、2、3天換新鮮培養(yǎng)液。

    1.3 基因組DNA提取和MSP 肺癌細(xì)胞系基因組DNA用Qiagen公司的QIAamp DNA Blood minikit試劑盒提取。取0.25 μg基因組DNA外加1.0 μg鮭魚精子DNA用ZYMO Rearch公司的EZ DNA Methylation Gold kit進(jìn)行重亞硫酸鹽處理,修飾后的基因組DNA溶于40 μL蒸餾水。用修飾后的基因組DNA做甲基化特異性PCR(methylation-specific PCR,MSP),其中甲基化EFEMP1啟動子用以下引物擴(kuò)增:5’-GTAGヰヰAGGGGATCGTCGC-3’/5’-TCCCCGACACG CTACCTTCG-3’。非甲基化EFEMP1啟動子用以下引物擴(kuò)增:5’-GAGTAGTTTTAGGGGATTGTTGT-3’/5’-TCCCCAA CACACTACCヰCA-3’。

    1.4 Real time-PCR 利用Promega總RNA提取試劑盒提取12孔板中細(xì)胞總RNA,檢測總質(zhì)量,用Invitrogen公司逆轉(zhuǎn)錄酶將10 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄為第一鏈cDNA,用下列引物進(jìn)行MMP-7的touchdown實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增:5’-A A ACTCCCGCGTCATAGA A AT-3’/5’CCCTAGACTGCTACCATCCG-3’。

    1.5 質(zhì)粒和siRNA轉(zhuǎn)染 根據(jù)Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和siRNA轉(zhuǎn)染,構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)EFEMP1細(xì)胞株時(shí),先轉(zhuǎn)染EFEMP1表達(dá)質(zhì)粒,后用0.4 mg/mL G418對A549和H1299進(jìn)行篩選,并用細(xì)胞裂解液進(jìn)行Western blot鑒定。MMP-7 siRNA使用Dharmacon公司合成的MMP- 7877(GCACUGUUCCUCCACUCCA)。

    1.6 克隆形成實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞在12孔板轉(zhuǎn)染EFEMP1或?qū)φ召|(zhì)粒48 h后轉(zhuǎn)入35 mm培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng),同時(shí)培養(yǎng)基中加入終濃度0.4 mg/mL G418進(jìn)行篩選,11 d-14 d后對培養(yǎng)皿中細(xì)胞進(jìn)行結(jié)晶紫染色,并計(jì)數(shù)著色細(xì)胞。

    1.7 基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn) 肺癌細(xì)胞培養(yǎng)于BD公司的6孔transwell培養(yǎng)板,上層培養(yǎng)室的8 μm濾膜覆蓋以1:6稀釋的基質(zhì)膠,每個(gè)培養(yǎng)孔均勻鋪以約2×106個(gè)細(xì)胞,培養(yǎng)36 h后,穿越濾膜到達(dá)培養(yǎng)孔底部的細(xì)胞用福爾馬林固定,并用結(jié)晶紫染色。每孔隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)視野(×200)的細(xì)胞數(shù)。

    1.8 熒光素酶檢測 已構(gòu)建的MMP-7熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒(pBV-Luc載體為母板,通過插入264 bp的MMP-7啟動子區(qū)片段構(gòu)建而成),其與pcDNA或EFEMP1,以及β-gal共轉(zhuǎn)染肺癌細(xì)胞,24 h后收集細(xì)胞,按Promega公司LAR試劑盒說明進(jìn)行處理,并檢測熒光素酶相對表達(dá)活性。

    1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用GraphPad Prism IV軟件進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì),計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)比較組間差異,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 EFEMP1表達(dá)及啟動子區(qū)甲基化分析 Western blot檢測幾種肺癌細(xì)胞系的EFEMP1表達(dá),A549和201T中表達(dá)較低,1288.88T中表達(dá)較高,H1299中幾乎無表達(dá),而穩(wěn)定表達(dá)EFEMP1的H1299細(xì)胞則可檢測到明顯表達(dá)(圖1A)。用MSP檢測A549和H1299全基因組中EFEMP1啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài),由圖1B可見在A549和H1299細(xì)胞中甲基化組均可觀察到條帶,說明在這兩種細(xì)胞系中EFEMP1啟動子區(qū)均有甲基化存在。進(jìn)而用5-aza-2’-deoxycytidine處理細(xì)胞,RT-PCR結(jié)果顯示處理后EFEMP1表達(dá)均升高(圖1C)。

    2.2 克隆形成以及Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) A549和H1299分別轉(zhuǎn)染EFEMP1和對照質(zhì)粒,48 h后消化轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中,并用G418開始篩選,11 d-14 d后結(jié)晶紫染色,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染EFEMP1細(xì)胞組克隆形成數(shù)明顯少于對照組(圖2A)。除了克隆形成外,用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染EFEMP1細(xì)胞組侵襲性也明顯小于對照組(圖2B)。

    2.3 EFEMP1通過抑制MMP-7表達(dá)而降低肺癌細(xì)胞侵襲性 A549和H1299轉(zhuǎn)染EFEMP1,Western blot檢測12 h、24 h的MMP-7表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)比對照組明顯降低,并用實(shí)時(shí)定量PCR檢測MMP-7的相對表達(dá)量(圖3A)。EFEMP1和對照質(zhì)粒分別與MMP-7熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染A549和H1299細(xì)胞,24 h后檢測各組的相對熒光素酶活性,我們發(fā)現(xiàn)EFEMP1會明顯抑制報(bào)告質(zhì)粒的熒光素酶活性(圖3B)。

    圖1 H1299和A549中由于EFEMP1啟動子區(qū)甲基化導(dǎo)致表達(dá)下降。A:不同肺癌細(xì)胞的EFEMP1表達(dá);B:EFEMP1在A549和H1299中甲基化狀態(tài)分析;C:RT-PCR分析5-aza-2’-deoxycytidine處理前后A549和H1299中EFEMP1的表達(dá)。Fig1 Silence of EFEMP1 in lung cancer by promoter hypermethylation. A: EFEMP1 expression in four lung cancer cell lines and EFEMP1-overexpressing H1299;B: EFEMP1 methylation status in A549 and H1299 was analyzed by MSP. NL and IVD were negative and positive controls; C: EFEMP1 expression in A549 and H1299 with or without 5-aza-2’-deoxycytidine treatment was determined by RT-PCR. M: methylation; U:unmethylation; MSP: methylation-specific PCR.

    圖2 EFEMP1的表達(dá)抑制肺癌細(xì)胞的侵襲能力。A:EFEMP1表達(dá)抑制A549和H1299的克隆形成能力;B:基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)分析轉(zhuǎn)染EFEMP1后A549和H1299細(xì)胞的侵襲能力。*:P<0.01 Student’s t-test。Fig2 EFEMP1 expression suppressed lung cancer cell invasion. A: Colony formation of A549 and H1299 cells transfected with EFEMP1 or the control pcDNA vector; B: Matrigel invasion assay was used to analyze the invasion of H1299 and A549 cells with or without EFEMP1 expression. *: P<0.01 Student’s t-test.

    2.4 MMP-7表達(dá)沉默降低肺癌細(xì)胞的侵襲性 用MMP-7 siRNA轉(zhuǎn)染肺癌細(xì)胞A549和H1299,36 h后收集細(xì)胞,Western blot檢測MMP-7的表達(dá)明顯下降(圖4A),同時(shí)基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)檢測MMP-7沉默組細(xì)胞其侵襲性明顯低于對照組(圖4B)。其細(xì)胞克隆形成數(shù)也明顯少于對照組(圖4C)。

    3 討論

    Fibulin家族包括七個(gè)成員[3](fibulin 1-7),是一組細(xì)胞外基質(zhì)蛋白,它們的結(jié)構(gòu)高度同源,具有相似的結(jié)構(gòu)域組成,包括結(jié)構(gòu)域I、II和III。Fibulin家族表達(dá)廣泛,定位于細(xì)胞基底膜、基質(zhì)和ECM等,介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)之間的相互聯(lián)系,在器官和血管形成過程中使ECM正確組織與穩(wěn)定。它們與內(nèi)皮細(xì)胞相互作用,參與組織器官重塑和修復(fù)等機(jī)體正常功能。

    Fibulin蛋白在腫瘤組織中異常表達(dá),與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3]。大量研究表明EFEMP1蛋白在結(jié)腸癌[4]、肝癌[5]、前列腺癌[6]、鼻咽癌[7]等癌癥細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)或缺失,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力提高,然而EFEMP1在腫瘤進(jìn)展中的作用并不完全相同,它的作用依據(jù)細(xì)胞種類和微環(huán)境的不同而表現(xiàn)出不同方式[3,8]。比如在宮頸癌[9]、腦癌[10]和胰腺癌[11]中,EFEMP1表達(dá)明顯上升,對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起到促進(jìn)的作用。

    我們之前和現(xiàn)在的研究結(jié)果證實(shí)EFEMP1在肺癌中常表達(dá)下調(diào)(圖1)[12],EFEMP1在大多數(shù)正常肺組織(80%)中表達(dá),但在約40%的肺癌組織中表達(dá)缺失,造成這種現(xiàn)象的部分原因就是EFEMP1在肺癌細(xì)胞中其啟動子區(qū)甲基化,抑制其正常表達(dá)。

    EFEMP1在肺癌中的啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)可以作為診斷肺癌的一種生物學(xué)指標(biāo)[13]。最新的研究[14]證明血清中的EFEMP1水平可以作為惡性間皮細(xì)胞瘤診斷的重要指標(biāo),因?yàn)樗^正常人水平明顯升高。

    本研究發(fā)現(xiàn)EFEMP1在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)下降對于肺癌侵襲轉(zhuǎn)移起到重要的作用,EFEMP1在肺癌細(xì)胞中可起到抑制生長和侵襲的作用,在EFEMP1表達(dá)缺失的肺癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染EFEMP1可以明顯降低肺癌細(xì)胞的克隆形成能力和侵襲能力(圖3)。EFEMP1在肺癌中抑制癌細(xì)胞生長和侵襲的作用是通過抑制MMP-7的表達(dá)來介導(dǎo),MMP-7在肺癌細(xì)胞的侵襲過程中起重要作用[15,16],其在肺癌中往往高表達(dá),并提示不良預(yù)后[17]。EFEMP1在肺癌細(xì)胞中表達(dá)下降,轉(zhuǎn)染EFEMP1后,MMP-7表達(dá)下調(diào)(圖4),并且EFEMP1在肺癌細(xì)胞中存在啟動子區(qū)甲基化現(xiàn)象。

    圖3 EFEMP1通過下調(diào)MMP-7的表達(dá)抑制肺癌細(xì)胞侵襲。A:EFEMP1轉(zhuǎn)染肺癌細(xì)胞后,Western blot分析12 h、24 h MMP-7的表達(dá),實(shí)時(shí)定量PCR分析MMP-7表達(dá)量變化;B:熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)分析EFEMP1表達(dá)下調(diào)MMP-7報(bào)告質(zhì)粒的熒光素酶表達(dá)。Fig3 EFEMP1 suppressed lung cancer cell invasion by downregulating MMP-7 expression. A: Western blot analysis of MMP-7 expression in A549 and H1299 cells at 12 h and 24 h after transfection with EFEMP1 or the control empty vector. MMP-7 expression was confirmed by real-time PCR; B:Luciferase activities of MMP-7 reporter construct were determined 24 h after transfection with EFEMP1. MMP-7: matrix metalloproteinase-7.

    圖4 MMP-7表達(dá)沉默后降低肺癌細(xì)胞的侵襲性。A:siRNA沉默后,Western blot檢測MMP-7表達(dá);B:siRNA沉默后,基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)分析A549和H1299的侵襲性;C:MMP-7經(jīng)siRNA沉默后,克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測A549和H1299的增殖能力。*:P<0.01 Student’s t-test。Fig4 Silence of MMP-7 expression decreased the invasiveness in lung cancer cells. A: MMP-7 expression was analyzed by Western blot 36 h after siRNA transfection in A549 and H1299; B: Cell invasion was analyzed by Matrigel assay 36 h after siRNA transfection; C: Colony formation of A549 and H1299 cells transfected with MMP-7 siRNA or the siRNA control. *: P<0.01 Student’s t-test.

    Fibulin家族中,與EFEMP1結(jié)構(gòu)相似的fibulin-5在肺癌細(xì)胞中也可以下調(diào)MMP-7的表達(dá)[18],另外除了MMP-7,EFEMP1、fibulin 5在其生物學(xué)功能上還可作用于其他的MMP/TIMP家族蛋白,例如EFEMP1是timp-3的結(jié)合配體[19],fibulin-5在某些腫瘤中可以調(diào)節(jié)MMP-2、MMP-3、timp-1、timp-3等的表達(dá)[20],這些研究結(jié)果說明不同的fibulin家族成員在腫瘤細(xì)胞中都可協(xié)同或獨(dú)自調(diào)節(jié)MMP/TIMP家族蛋白,從而影響腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。本文中,我們并沒有發(fā)現(xiàn)在肺癌細(xì)胞中EFEMP1可以調(diào)控除MMP-7之外的MMP/TIMP家族蛋白(結(jié)果未顯示)。

    我們的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明了EFEMP1蛋白在肺癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中起到抑制作用,并可下調(diào)MMP-7表達(dá),而MMP-7表達(dá)以及MAPK信號通路激活等都是上皮間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition,EMT)過程的重要機(jī)制,腫瘤相關(guān)的MMP蛋白本身可以激活腫瘤EMT過程[21,22],故我們相信EFEMP1在肺癌中的表達(dá)下調(diào),并且上調(diào)MMP-7表達(dá),這些都是肺癌細(xì)胞EMT過程的重要事件。

    總之,我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示了EFEMP1在肺癌中通過抑制MMP-7表達(dá)從而抑制癌細(xì)胞侵襲的生物學(xué)功能,下一步,我們將深入研究該過程的具體分子機(jī)制及信號通路,研究結(jié)果將有助于為肺癌轉(zhuǎn)移的靶向治療提供新的作用靶點(diǎn)。

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