豬圓環(huán)病毒2型分子生物學(xué)研究進(jìn)展

李富強(qiáng)　王利麗　李秀麗

摘 要：豬圓環(huán)病毒 2 型 （PCV2）是引起豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病 （PCVAD） 的主要病因。目前流行的 PCV2 被分為PCV2a 和 PCV2b 兩個(gè)亞群。北美和其他國家 PCVAD 的暴發(fā)通常與主要基因型從PCV2a轉(zhuǎn)變?yōu)镻CV2b 有關(guān)。本文對圓環(huán)病毒2型的分子結(jié)構(gòu)及其表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，最后對分子差異和致病性進(jìn)行了討論。

關(guān)鍵詞：豬圓環(huán)病毒2型；分子結(jié)構(gòu)；致病性；

中圖分類號(hào)：S852.65 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.09.013

Progress on Molecular Biology of PCV2

LI Fu-qiang，WANG Li-li， LI Xiu-li

（Tianjin Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science，Tianjin 300384，China）

Abstract：Porcine circovirus type 2 （PCV2） was the main cause of porcine circovirus virus associated disease （PCVAD）.PCV2a and PCV2b，two subgroups of PCV2，were epidemic recently. In North America and other countries ，PCVAD outbreaks were usually related to main genotype from PCV2a into PCV2b.In this paper， the molecular structure of the porcine circovirus virus type 2 and the research progress of its expression product biological activities were summarized， and finally discussed the relation of molecular differences and pathogenicity were discussed.

Key words： porcine circovirus type 2； molecular structure； pathogenicity

20世紀(jì)70年代，Tischer等報(bào)道PK-15（ATCC-CCL3）細(xì)胞系受到某種病毒污染，生化分析表明該病毒基因組為環(huán)狀單鏈DNA，故命名為豬圓環(huán)病毒。早期試驗(yàn)性感染表明，PK-15感染病毒后沒有引發(fā)具有臨床癥狀的疾病。直到20世紀(jì)90年代，加拿大出現(xiàn)一種名為PMWS的新型衰竭性疾病。利用PCV特異性單克隆抗體進(jìn)行電鏡和免疫組化試驗(yàn)，證實(shí)感染豬的組織中存在圓環(huán)病毒。經(jīng)PCR擴(kuò)增后分析序列，發(fā)現(xiàn)該病毒與早期感染PK-15細(xì)胞系的病毒約有70%的相似性，因此人們用PCV1和PCV2來區(qū)別PK-15細(xì)胞系污染病毒和PMWS病例分離株。

1 病毒結(jié)構(gòu)及病原生物學(xué)特性

豬圓環(huán)病毒2型屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，單股負(fù)鏈環(huán)狀不分節(jié)無囊膜DNA病毒?；蚪M全長約1 767～1 768 bp，衣殼蛋白呈二十面體對稱[1]。

對于PCV2的生物學(xué)特性和理化特性與PCV1相似。與福爾馬林、酒精、碘酒和雙氯苯雙胍己烷室溫下作用10 min，病毒滴度會(huì)下降。對苯酚、季胺類化合物、氫氧化合物等較敏感[2]，不凝集人、猴、豬、兔、小鼠及雞的紅細(xì)胞[3]。PCV2體外培養(yǎng)不能在豬胎腎原代細(xì)胞、恒河猴腎細(xì)胞、BHK-21細(xì)胞上生長，可在PK-15細(xì)胞中生長但不引起細(xì)胞病變。自然宿主為家豬和野豬，豬科以外動(dòng)物不易感染PCV2。傳播途徑主要為接觸感染，感染動(dòng)物的糞便、尿液、唾液及精液均含有病毒[4]。

2 基因結(jié)構(gòu)及病毒蛋白生物學(xué)活性

PCV2基因組由11個(gè)開放閱讀框（ORFs）組成，其中ORF1和ORF2為兩個(gè)主要閱讀框。目前的研究主要集中在ORF1，ORF2，ORF3，ORF4和ORF5 五個(gè)閱讀框。

ORF1靠近PCV2基因組起始位點(diǎn)，位于正鏈方向，ORF1基因全長945 nt，編碼314個(gè)氨基酸，翻譯成復(fù)制酶蛋白R(shí)ep和Rep。Rep由整個(gè)ORF1翻譯而成。分子質(zhì)量36 ku，含3個(gè)N -糖基化位點(diǎn)。研究表明，位于蛋白23-25位aa（NPS）、256-258aa（NQT）的N-糖基化位點(diǎn)發(fā)生突變能夠降低病毒復(fù)制，286-288aa（DAT）的N-糖基化位點(diǎn)發(fā)生突變能夠促進(jìn)病毒復(fù)制[5]。Rep蛋白含有3個(gè)保守基列，是典型滾環(huán)復(fù)制相關(guān)位點(diǎn)。此外，還有一個(gè)莖-環(huán)結(jié)構(gòu)區(qū)[6]。Rep由ORF1轉(zhuǎn)錄子在mRNA第417～799處的剪切位點(diǎn)剪接而成，含有178個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量為20.4 ku。RepC端的68個(gè)氨基酸來自不同的ORFs[7]。PCV2病毒的復(fù)制需要Rep和Rep蛋白互相作用共同啟動(dòng)，結(jié)合位點(diǎn)位于ORF1和ORF2之間的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)區(qū)[8]。

ORF2位于反義鏈方向，編碼233或234個(gè)氨基酸的病毒衣殼蛋白（CP），亦稱為結(jié)構(gòu)蛋白（Cap）。CP上面存在著病毒的主要抗原決定簇，是PCV2病毒與細(xì)胞受體黏附的主要區(qū)域，也是研制PCV2病毒疫苗的首選區(qū)域。Cap蛋白N端1-41位為核定位信號(hào)肽序列，其中第12～18位和第34～41位氨基酸對Cap蛋白在細(xì)胞核的定位過程中起重要作用[9]。第65～87位，113～139位，163～183位，193～207位氨基酸4個(gè)區(qū)域與抗原免疫反應(yīng)相關(guān)[10]。

Khayat等[11]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)70位ASP、71位Met、77位Asn和78位Asp是第65～87位抗原免疫反應(yīng)相關(guān)區(qū)域的關(guān)鍵殘基；113位Glu、115位Asp和127位Asp是113～139位抗體免疫反應(yīng)相關(guān)區(qū)域的抗體識(shí)別的重要位點(diǎn)；203位Glu、206位Ile和207位Tyr是193～207位區(qū)域的抗體識(shí)別位點(diǎn)。Trible等[12]鑒定了163～183位區(qū)域的與疾病相關(guān)的免疫功能表位，丙氨酸掃描發(fā)現(xiàn)Y-173、F-174、Q-175和K-179是重要的抗體識(shí)別位點(diǎn)。

ORF3重疊于ORF1負(fù)鏈內(nèi)，編碼105個(gè)氨基酸，方向與ORF2相同。Liu等[13]通過檢測ORF3功能缺失病毒在PK-15細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制拷貝發(fā)現(xiàn)ORF3不參與病毒復(fù)制，但是參與激活caspase-8和caspase-3途徑，在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡中有重要作用。研究表明ORF3蛋白同Pirh2相互作用能夠使腫瘤抑制因子p53蛋白的表達(dá)量升高，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14-15]。Liu[16]進(jìn)一步試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ORF3蛋白功能缺失體無法造成小鼠的微觀病變，并且對CD4和CD8、CD8細(xì)胞的弱化功能減弱。同時(shí)ORF3蛋白免疫小鼠后血清中IL-4的質(zhì)量濃度顯著升高，IL-10、IL-12、IFN-gamma的質(zhì)量濃度沒有明顯變化，說明ORF3蛋白在PCV2誘發(fā)的體液免疫中發(fā)揮著一定的作用[17]。

ORF4重疊于ORF3內(nèi)，全長約180 bp，轉(zhuǎn)錄方向與ORF3相同但采用不同起始密碼子[18]。李增魁等[19]體外表達(dá)ORF4蛋白發(fā)現(xiàn)其有一定的細(xì)胞毒性。He等[20]構(gòu)建拯救出了PCV2-ORF4缺失體病毒（PCV2△），并和野生型病毒（wPCV2）分別感染細(xì)胞和小鼠。結(jié)果表明，PCV2△感染細(xì)胞后能夠提高caspase-3、8、9的活性，證明ORF4與凋亡抑制相關(guān)。PCV2△感染的小鼠體內(nèi)出現(xiàn)CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+CD8+T淋巴細(xì)胞嚴(yán)重減少，說明PCV2△比wPCV2具有更強(qiáng)的致病力，表示ORF4基因是PCV2致病的負(fù)調(diào)控基因。

ORF5基因全長180 nt，與ORF1轉(zhuǎn)錄方向相同。Lv等[21]對PCV2bORF5基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，發(fā)現(xiàn)其與病毒復(fù)制和細(xì)胞凋亡無關(guān)。通過構(gòu)建真核表達(dá)載體表達(dá)ORF5基因蛋白研究其生物功能顯示，綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記的ORF5蛋白集中于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，具有減弱蛋白酶體，延長細(xì)胞周期S期，抑制肺泡巨噬細(xì)胞生長的作用。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)ORF5能誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)活化NF-КB信號(hào)，上調(diào)IL-6、IL-8和COX-2的表達(dá)。細(xì)胞蛋白GPNMB、CYP1A1、YNHAB、ZNF511和SRSF3通過酵母雙雜交系統(tǒng)（yeast two-hybrid assay）與ORF5蛋白相互作用。

3 基因亞型分類

國際病毒分類學(xué)委員會(huì)（International Committee on Taxonomy of Viruses ，ICTV）對種以下不進(jìn)行分類，Grau-Roma等[22]基于不同PCV2全基因組序列錯(cuò)配比率（即遺傳距離P）提出了一種PCV2全基因組分型方法，即當(dāng)遺傳距離p超過0.02時(shí)，認(rèn)定為不同亞型。這種方法在病毒學(xué)上已經(jīng)被廣大學(xué)者廣泛接受。Segalés等[23]對196份PCV2 ORF2序列的錯(cuò)配比率與其頻率構(gòu)建直方圖發(fā)現(xiàn)，在不同遺傳距離處有兩個(gè)頻率高峰，兩個(gè)頻率高峰之間，位于p=0.035處有一處頻率低谷。因此，PCV2 ORF2序列的遺傳距離超過0.035時(shí)即判定為不同基因亞型。應(yīng)用這兩種方法對GeneBank上的序列進(jìn)行分析，均能得到3種相同的基因亞型。對于Wang等[24]對中國分離株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生樹分析時(shí)，并沒有應(yīng)用以上兩種方法，Cortey等[25]對Wang提交的序列比對后認(rèn)為Wang提出的新的基因型PCV2d和PCV2e的命名不成立，它們應(yīng)分別屬于PCV2b和PCV2a兩種亞型。Olvera等[26]按照上述方法將PCV2a細(xì)分為5個(gè)進(jìn)化枝（p=0.015 8），命名為PCV群II A-E，PCV2b細(xì)分為3個(gè)進(jìn)化枝（p=0.023 4），命名為PCV群I A-C。

4 分子差異與致病力

PCV2a基因組全長1 768 bp，PCV2b基因組全長1 767 bp，在核苷酸水平上有95%相同。PCV2a在1 487～1 473位為ACCAACAAAAT，PCV2b在1 486～1 472位為TCAAACCCCCG。氨基酸序列為86-TNKISI和86-SNPRSV[27]。目前尚無報(bào)道表明該段序列差異與病毒致病性或毒力相關(guān)。

PCV2a和PCV2b在全球范圍內(nèi)存在，2000年以前PCV2a為主要的致病基因亞型，2000年以后轉(zhuǎn)變?yōu)镻CV2b。但研究表明，單一的PCV2a或單一的PCV2b病毒在試驗(yàn)動(dòng)物上不能很好的復(fù)制出相應(yīng)的PWMS，需要與PRRSV等其他病原微生物混合感染才能達(dá)到預(yù)期效果。Cortey等[28]對西班牙PCV2a和PCV2b的歷年檢測頻率進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，認(rèn)為PCVAD的爆發(fā)與PCV2a到PCV2b的基因亞型轉(zhuǎn)化有關(guān)。Harding等[29]試驗(yàn)性的將PCV2a和PCV2b兩兩排列組合，按攻毒順序分成2a/2a、2a/2b、2b/2a、2b/2b 4組，分別感染SPF豬，兩次攻毒間隔一周，發(fā)現(xiàn)PCV2a和PCV2b無論以何種順序組合都能復(fù)制出PCVAD。Khaiseb等[30]對發(fā)病和亞臨床狀態(tài)豬的組織進(jìn)行原位雜交試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)發(fā)病豬的組織表現(xiàn)為細(xì)胞同時(shí)感染兩種基因亞型；亞臨床狀態(tài)豬僅感染一種基因亞型，這進(jìn)一步證明了PCV2a和PCV2b相互作用能夠促進(jìn)疾病的發(fā)生和發(fā)展。

5 展 望

豬圓環(huán)病毒的發(fā)現(xiàn)與發(fā)展僅僅幾十年的時(shí)間，但已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)廣泛存在的疾病。由于常見持續(xù)性消瘦、衰竭而亡，病程較長，只是偶然出現(xiàn)大規(guī)模爆發(fā)大量死亡的情況，因此，飼養(yǎng)管理人員及部分科研人員對該病不予重視。這不僅造成了大量的經(jīng)濟(jì)損失，養(yǎng)殖成本增高，也造成了PCV2病毒的傳播與變異?，F(xiàn)階段對于PCV2的各開放閱讀框的功能還未完全明了，致病機(jī)理和逃脫免疫的機(jī)制目前尚存爭議，因此，對于PCV2基因各開放閱讀框功能的研究可能對闡述PCV2的致病機(jī)理和免疫逃脫機(jī)制提供依據(jù)。

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