靈芝抗腫瘤作用的免疫學(xué)機(jī)制及其臨床應(yīng)用

林志彬（北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系，北京 100191）

前沿論壇

靈芝抗腫瘤作用的免疫學(xué)機(jī)制及其臨床應(yīng)用

林志彬
（北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系，北京 100191）

靈芝的抗腫瘤作用與其免疫調(diào)節(jié)作用密切相關(guān)。本文在我們的研究工作的基礎(chǔ)上，結(jié)合國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)論述靈芝抗腫瘤作用的免疫學(xué)機(jī)制，包括靈芝促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞功能；促進(jìn)樹突狀細(xì)胞成熟、分化和抗原提呈功能；活化淋巴細(xì)胞、增強(qiáng)細(xì)胞毒T細(xì)胞的功能及促進(jìn)細(xì)胞因子的生成；抑制腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸反應(yīng)；以及靈芝免疫治療的基礎(chǔ)研究等。涉及免疫學(xué)指標(biāo)的靈芝的臨床研究結(jié)果也一并介紹。

靈芝屬；多糖類；抗腫瘤藥，植物；免疫調(diào)節(jié)；腫瘤逃逸；治療應(yīng)用

林志彬，教授，博士生導(dǎo)師。歷任北京醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院副院長(zhǎng)兼基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所所長(zhǎng)和藥理學(xué)系主任，北京醫(yī)科大學(xué)副校長(zhǎng)。先后在美國(guó)芝加哥伊利諾斯大學(xué)做訪問(wèn)學(xué)者、俄羅斯彼爾姆藥學(xué)院任名譽(yù)教授和香港大學(xué)訪問(wèn)教授。歷任國(guó)際藥理學(xué)聯(lián)合會(huì)執(zhí)委會(huì)委員和提名委員會(huì)委員、國(guó)際靈芝研究學(xué)會(huì)主席、中國(guó)科學(xué)技術(shù)協(xié)會(huì)全國(guó)委員會(huì)委員、中國(guó)藥理學(xué)會(huì)理事長(zhǎng)和名譽(yù)理事長(zhǎng)、國(guó)家新藥研究與開(kāi)發(fā)專家委員會(huì)委員、國(guó)家藥典委員會(huì)委員和國(guó)家藥品審評(píng)專家等。任《北京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)》主編和Acta Pharmacol Sin等雜志副主編。長(zhǎng)期從事抗炎、免疫調(diào)節(jié)、內(nèi)分泌和抗腫瘤藥物研究，是國(guó)內(nèi)外著名的靈芝研究學(xué)者。曾獲國(guó)家教委科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)和三等獎(jiǎng)，北京市科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)和三等獎(jiǎng)，教育部提名國(guó)家科技進(jìn)步獎(jiǎng)二等獎(jiǎng)及微生物文教基金會(huì)（臺(tái)北）卓越成就獎(jiǎng)等。1992年享受國(guó)務(wù)院政府特殊津貼。

靈芝是國(guó)內(nèi)外久負(fù)盛名的中藥。2000多年前出版的《神農(nóng)本草經(jīng)》中，將靈芝列為有效無(wú)毒的“上藥”并列出靈芝（赤芝、青芝、白芝、黃芝、黑芝和紫芝）的性味歸經(jīng)與功效。2000年開(kāi)始，《中華人民共和國(guó)藥典》一部收載靈芝〔赤芝，Ganoderma lucidum（Leyss.ex Fr.）Karst.〕和紫芝（Ganoderma sinensis Zhao，Xu et Zhang）子實(shí)體作為法定中藥材?，F(xiàn)代植物化學(xué)、藥理學(xué)、毒理學(xué)和臨床研究表明，靈芝含有多糖、三萜、甾醇和小分子蛋白等多種有效成分，具有廣泛的藥理作用，毒性極低，臨床用于治療多種疾?。?］。

筆者所在研究室自20世紀(jì)70年代開(kāi)始研究靈芝及其有效成分的藥理作用，近20年來(lái)，著重研究靈芝的免疫調(diào)節(jié)作用和抗腫瘤作用及其機(jī)制。大量研究結(jié)果表明，靈芝的抗腫瘤作用與其免疫調(diào)節(jié)作用密切相關(guān)［2］。本文在我們的研究工作基礎(chǔ)上，結(jié)合國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)論述靈芝抗腫瘤作用的免疫學(xué)機(jī)制及其臨床應(yīng)用。

1 靈芝抗腫瘤作用的發(fā)現(xiàn)

Ito等［3］、Kin等［4］、Miyazaki等［5］、Mizuno等［6-7］、Lee等［8］、Sone等［9］、Maruyama等［10］、Furusawa等［11］及Ma［12］先后報(bào)道，靈芝（G.lucidum）子實(shí)體提取物及其所含多糖腹腔注射或灌胃給藥，可顯著抑制小鼠移植性腫瘤的生長(zhǎng)，并認(rèn)為靈芝的體內(nèi)抗腫瘤作用可能是“宿主中介性的”，即通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能而實(shí)現(xiàn)的。為了證明這一假設(shè)，從20世紀(jì)90年代起，我們重復(fù)了靈芝的體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，靈芝子實(shí)體水提取物（G.lucidum extract，GLE）及其靈芝多糖B（G.lucidum polysaccharide B，GL-B）和多糖肽（G.lucidum polysaccharide peptide，GLPP）、破壁孢子多糖（G.lucidum broken spore polysaccharides，GL-BSP）灌胃可明顯抑制小鼠移植性腫瘤S180肉瘤、人肺癌（PG）和Lewis肺癌的生長(zhǎng)，但直接加到體外培養(yǎng)的S180肉瘤、人白血病HL-60細(xì)胞和PG細(xì)胞的培養(yǎng)液中，不能直接抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，也不能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，提示靈芝提取物和多糖在體內(nèi)的抑制腫瘤生長(zhǎng)并非直接細(xì)胞毒作用，而增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫力可能是其中重要的一環(huán)［13-18］。

2 靈芝抗腫瘤作用的免疫學(xué)機(jī)制

2.1 血清藥理學(xué)研究靈芝的宿主中介性抗腫瘤作用

血清藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)是中藥藥理研究的一種方法，即給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物灌服中藥提取物或組分后，取其血清（含藥血清）進(jìn)行體外藥理實(shí)驗(yàn)。含藥血清中可能含所服中藥或其活性代謝產(chǎn)物，也可能含有在中藥作用下產(chǎn)生的內(nèi)源性活性物質(zhì)，并因此產(chǎn)生藥理作用。據(jù)此，我們給小鼠灌胃不同劑量的GLE 5，10和20 g（相當(dāng)生藥）·kg-1或GL-B 50，100和200 mg·kg-1，共10 d，最后一次給藥后1 h取血，無(wú)菌分離血清，經(jīng)56℃，30 min滅活處理后，用微孔濾膜過(guò)濾除菌。將此含藥血清加至體外培養(yǎng)的S180細(xì)胞或HL-60細(xì)胞培養(yǎng)基中，則可明顯抑制兩種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，并可誘導(dǎo)其凋亡［13-15］。

由于未能在含藥血清中檢出靈芝的多糖成分，我們推測(cè)小鼠灌服GLE或GL-B后，血清中可能出現(xiàn)了一種內(nèi)源性抗腫瘤活性物質(zhì)。于是采用生物法和ELISA法檢測(cè)含GLE或GL-B血清的腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和干擾素γ （interferon-γ，IFN-γ）的含量。結(jié)果顯示，不同劑量GLE或GL-B灌胃小鼠，血清中TNF-α的活性和IFN-γ的水平增加，并呈現(xiàn)明顯的劑量依賴關(guān)系［13-15］。已知TNF-α和IFN-γ對(duì)腫瘤細(xì)胞均具有細(xì)胞毒作用，能殺滅腫瘤細(xì)胞，TNF-α在體外可誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡，而IFN-γ還可與TNF-α協(xié)同作用，增強(qiáng)TNF-α誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。因此，含GLE或GL-B血清在體外抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用至少與其中所含TNF-α和IFN-γ有關(guān)，而后二者是在GLE或GL-B作用下由體內(nèi)生成的。

為了在體外模擬血清藥理學(xué)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，又分別在小鼠腹腔巨噬細(xì)胞或脾細(xì)胞培養(yǎng)液中，加入GL-B（50，100和200 mg·L-1）共同培養(yǎng)24 h，然后分別取GL-B與巨噬細(xì)胞或脾細(xì)胞共培養(yǎng)上清液，加至HL-60細(xì)胞培養(yǎng)基中，結(jié)果這兩種共培養(yǎng)上清液可顯著抑制HL-60細(xì)胞增殖和促進(jìn)其凋亡［14-15］。同樣，靈芝菌絲體多糖與小鼠腹腔巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)上清液也可顯著抑制HL-60細(xì)胞增殖，并促其凋亡［16］。進(jìn)一步的研究結(jié)果表明，GL-B能使小鼠腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α mRNA表達(dá)和TNF-α水平增加，也能使小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ mRNA表達(dá)和IFN-γ水平增加［19］。同樣，靈芝菌絲體多糖與小鼠腹腔巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)上清液中TNF-α的水平亦明顯增加［20］。這些結(jié)果均說(shuō)明靈芝多糖確能直接作用于巨噬細(xì)胞和脾細(xì)胞，促其產(chǎn)生TNFα和IFNγ，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。

給小鼠灌胃GLE 5，10和20 g（相當(dāng)生藥）·kg-1，共10 d，也可顯著增加小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TNF-α mRNA表達(dá)和脾細(xì)胞IFNγ mRNA表達(dá)［13］。

Wang等［21］研究也證明，將靈芝子實(shí)體多糖（PS-G）直接加到人白血病細(xì)胞HL-60和U937細(xì)胞培養(yǎng)液中，對(duì)此兩種細(xì)胞增殖均無(wú)抑制作用，也不能誘導(dǎo)其凋亡。但在健康人外周血單核-巨噬細(xì)胞或T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)中加入PS-G，可明顯促進(jìn)巨噬細(xì)胞生成白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β），TNF-α和IL-6，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞生成IFN-γ。當(dāng)PS-G濃度為100 mg·L-1時(shí)，IL-1β，TNF-α和IL-6分別較對(duì)照增加5.1，9.8和29倍。加入20%PS-G與人外周血單核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，MNC-CM）共培養(yǎng)，則可顯著抑制HL-60和U937細(xì)胞增殖，并促進(jìn)其凋亡。此外，在HL-60和U937細(xì)胞培養(yǎng)液中加入20%PS-G與MNC-CM培養(yǎng)液（PS-G-MNC-CM）可誘導(dǎo)HL-60和U937細(xì)胞分化為成熟的可表達(dá)CD14和CD18表面抗原的單核-巨噬細(xì)胞，分化率分別為40%和45%。

Li等［22］亦發(fā)現(xiàn)，靈芝多糖GLB7（5，10，20和40 mg·L-1）能濃度依賴性地誘發(fā)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞IL-1α和TNF-α mRNA的表達(dá)，并增強(qiáng)巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1α和TNF-α活性。

最近我們發(fā)現(xiàn)，GL-BSP（50，100和200mg·kg-1）灌胃給藥，可顯著抑制小鼠S180肉瘤生長(zhǎng)，但對(duì)體外培養(yǎng)的S180或PG細(xì)胞增殖無(wú)直接抑制作用。將灌胃上述劑量GL-BSP的小鼠血清加到體外培養(yǎng)的S180或PG細(xì)胞中，則可劑量依賴性地抑制腫瘤細(xì)胞增殖。研究還發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照血清比較，含GL-BSP血清中IL-2，TNF-α，IFN-γ和一氧化氮（nitrogen monoxide，NO）水平顯著增加，表明含GL-BSP血清抑制S180和PG細(xì)胞增殖與IL-2，TNF-α和IFN-γ等免疫細(xì)胞因子有關(guān)。為了進(jìn)一步證實(shí)含GL-BSP血清中TNF-α和IFN-γ的抗腫瘤活性，我們把經(jīng)過(guò)TNF-α和（或）IFN-γ中和抗體預(yù)處理過(guò)的含GL-BSP血清加入S180或PG細(xì)胞培養(yǎng)液中，結(jié)果其抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用顯著減弱，尤以同時(shí)加入TNF-α和IFN-γ中和抗體的含GL-BSP血清減弱作用更為明顯。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，S180荷瘤小鼠與正常小鼠比較，其自然殺傷細(xì)胞（natural killer cells，NK）細(xì)胞的細(xì)胞毒活性、巨噬細(xì)胞吞噬活性、輔酶A和脂多糖誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞增殖功能明顯降低，CD4+/CD8+比值顯著升高，灌胃GL-BSP則可使這些改變恢復(fù)至接近正?；蛲耆Ｋ健?/p>

這些研究結(jié)果有力證明，GL-BSP的體內(nèi)抗腫瘤作用與其促進(jìn)免疫細(xì)胞因子產(chǎn)生，增強(qiáng)NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的功能有關(guān)［18］。

2.2 靈芝促進(jìn)樹突狀細(xì)胞的成熟和分化，增強(qiáng)其功能

樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DC）是一種抗原遞呈細(xì)胞（antigen presenting cells，APC），能高效地?cái)z取、加工處理和提呈抗原。成熟的DC高表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）-Ⅰ-抗原肽復(fù)合物和MHC-Ⅱ-抗原肽復(fù)合物以及B7-1/CD80，B7-2/CD86，CD40和LFA-3/CD58等共刺激分子，這些分子與T淋巴細(xì)胞結(jié)合并激活T淋巴細(xì)胞。此外，DC高表達(dá)細(xì)胞間黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）/CD54和ICAM-3/CD50等黏附分子，有利于與T淋巴細(xì)胞的進(jìn)一步結(jié)合。抗原提呈是一個(gè)雙向過(guò)程，一方面，DC可誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞活化；另一方面，DC可接受已活化T淋巴細(xì)胞反饋回來(lái)的活化信號(hào)如CD40L而活化，表達(dá)共刺激分子并分泌其他活化因子如IL-12，誘導(dǎo)Th1型應(yīng)答的生成。DC作為激發(fā)T淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)的重要輔助細(xì)胞，在初次抗體反應(yīng)、混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)、促有絲分裂反應(yīng)及抗腫瘤免疫應(yīng)答中均具有重要作用。

2002年，我們首先發(fā)現(xiàn)在小鼠骨髓源性DC體外培養(yǎng)體系中，加入0.8，3.2或12.8 mg·L-1的靈芝多糖（GL-PS，系從赤芝子實(shí)體中提取的含17種氨基酸的多糖，相對(duì)分子質(zhì)量為584.9×103，多糖∶肽=93.51∶6.49。多糖部分是由葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和甘露糖組成），可明顯促進(jìn)DC表面DC11c及I-A/I-E分子的共表達(dá)、明顯增加IL-12 40亞基mRNA和蛋白表達(dá)、促進(jìn)DC誘導(dǎo)的混合淋巴反應(yīng)，表明靈芝多糖能促進(jìn)DC的成熟、分化并增強(qiáng)其功能。在DC誘導(dǎo)P815腫瘤細(xì)胞裂解物沖擊致敏小鼠產(chǎn)生的特異性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞（cytotoxicity T lymphocyte，CTL）模型中，于沖擊致敏階段，加入不同濃度的GL-PS共培養(yǎng)，收集CTL及細(xì)胞培養(yǎng)上清液，以釋放入CTL與P815腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)體系細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）的活性代表CTL的特異性殺傷活性；同時(shí)用RT-PCR法檢測(cè)CTL中IFN-γ及顆粒酶B（granzyme B）的mRNA表達(dá)；用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ蛋白含量；用Western蛋白印跡法檢測(cè)CTL表達(dá)的顆粒酶B蛋白含量。結(jié)果顯示，當(dāng)DC經(jīng)P815腫瘤細(xì)胞凍融抗原沖擊致敏后，其誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTL對(duì)P815腫瘤細(xì)胞具有殺傷作用，GL-PS（0.8，3.2和12.8 mg·L-1）可增強(qiáng)此作用，表現(xiàn)為釋放入培養(yǎng)上清液中的LDH活性顯著增強(qiáng)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，同上濃度的靈芝多糖可明顯增加DC誘導(dǎo)CTL的IFN-γ mRNA表達(dá)，并使培養(yǎng)上清液中IFN-γ蛋白含量增加。我們還發(fā)現(xiàn)，上述濃度的靈芝多糖可明顯增加DC誘導(dǎo)的CTL的顆粒酶B mRNA及蛋白表達(dá)。這些結(jié)果提示，靈芝多糖在DC成熟階段，增強(qiáng)DC對(duì)腫瘤抗原的捕獲、處理、提呈能力，增強(qiáng)DC誘導(dǎo)的特異性CTL的細(xì)胞毒活性。而靈芝多糖促進(jìn)活化CTL的IFN-γ mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)，使IFN-γ生成增加，后者通過(guò)其直接和間接作用發(fā)揮抑瘤作用。顆粒酶為淋巴細(xì)胞絲氨酸蛋白酶類，通常以非活化的酶原形式貯存于CTL和NK胞質(zhì)內(nèi)的細(xì)胞毒顆粒中，并于脫顆粒時(shí)釋出，促進(jìn)CTL及NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。顆粒酶家族中，以顆粒酶B功能最強(qiáng)。靈芝多糖促進(jìn)CTL的顆粒酶B mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)，與其增強(qiáng)CTL的細(xì)胞毒活性有關(guān)［23-24］。

Lin等［25］報(bào)道，具有（1→6）-β-D-葡聚糖分支結(jié)構(gòu)的靈芝多糖（PS-G）（10 mg·L-1）能促進(jìn)人單核細(xì)胞來(lái)源的DC表達(dá)CD80，CD86，CD83，CD40，CD54和人白細(xì)胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）-DR，以及IL-12和IL-10 mRNA及其蛋白表達(dá)，抑制DC的內(nèi)吞活性。PS-G還增強(qiáng)DC刺激T細(xì)胞的活性，促進(jìn)T細(xì)胞分泌IFN-γ和IL-10。由于抗Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）抗體可抑制PS-G誘導(dǎo)的IL-12和IL-10的分泌，提示TLR4參與PS-G對(duì)DC的上述作用。進(jìn)一步研究顯示，PS-G能增加κB抑制劑（inhibitor of κB，IκB）激酶和NF-κB活性，以及IκBa和P38絲裂原激活蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）的磷酸化。而helenalin（NF-κB的抑制劑）以及SB98059（P38 MAPK的抑制劑）可不同程度地阻斷PS-G對(duì)DC表達(dá)CD80，CD86，CD83，CD40，CD54和HLA-DR，以及IL-12和IL-10生成的作用。提示PS-G是通過(guò)NF-κB和P38 MAPK信號(hào)通路，誘導(dǎo)人DC的活化和成熟。

Lin等［26］進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，重組靈芝菌絲體中提取的免疫調(diào)節(jié)蛋白（rLZ-8；由110個(gè)氨基酸殘基組成，相對(duì)分子質(zhì)量為12.4×103）處理人單核細(xì)胞，衍生的DC細(xì)胞表面表達(dá)的CD80，CD86，CD83和HLA-DR增加，IL-12 p40，IL-10和IL-23生成亦增加，DC細(xì)胞的內(nèi)吞減少，TLR4抗體能阻斷IL-12 p40和 IL-10生成的增加。同時(shí)rLZ-8能刺激TLR4或TLR4/MD2-轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞表達(dá)IL-8。進(jìn)一步研究提示，rLZ-8能升高IKK和NF-κB的活性，增加IκBα和MAPK的磷酸化，NF-κB抑制劑菊內(nèi)酯能不同程度地阻斷CD80，CD86，CD83 和HLA-DR的表達(dá)以及IL-12 p40和IL-10的生成。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明rLZ-8增加BALB/c小鼠IgG2a，IFN-γ和IL-2的生成。表明LZ-8促進(jìn)DC細(xì)胞成熟和活化，增強(qiáng)Th1反應(yīng)。Zhou等［27］還發(fā)現(xiàn)，在環(huán)磷酰胺致白血病模型中，rLZ-8增強(qiáng)中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞活性，也增加CD4+T細(xì)胞百分率以及IL-3和IL-4的生成。

Chan等［28］的研究證明，GL-PS也能刺激單核細(xì)胞源性DC成熟。GL-PS和GM-CSF/IL-4共同作用誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞轉(zhuǎn)化為典型的DC細(xì)胞形態(tài)，而GL-PS單獨(dú)作用只能誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞增殖。此外，THP-1轉(zhuǎn)化為DC引起HLA-DR，CD40，CD80 和CD86表達(dá)顯著增高，抗原攝取能力亦增加。然而，它誘導(dǎo)同種異體T細(xì)胞增殖的能力較弱。

Meng等［29］發(fā)現(xiàn)，靈芝多糖GLP能增加小鼠DC表達(dá)CD86，CD40以及MHC-Ⅱ，促進(jìn)DC細(xì)胞表型成熟。GLP下調(diào)DC內(nèi)的酸性磷酸酶活性，減少吞噬，增強(qiáng)抗原提呈，IL-12生成也顯著增加。

Yoshida等［30］報(bào)道，靈芝水溶性提取物（0.01，0.1和1.0 g·L-1）能活化DC，促進(jìn)前炎癥細(xì)胞因子TNF-α和IL-23大量生成，增強(qiáng)IL-23p19轉(zhuǎn)錄以及細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK1/2）磷酸化。IL-23p19啟動(dòng)子活性檢測(cè)和MEK抑制劑U0126反向抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果指出，MEK-ERK信號(hào)通路參與靈芝提取物活化DC。靈芝提取物活化的DC能促進(jìn)CD4+T細(xì)胞增殖，在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中靈芝提取物活化Th17細(xì)胞，生成大量IL-17，同時(shí)亦分泌較多IL-4，提示靈芝提取物不僅促進(jìn)Th17細(xì)胞分化，還促進(jìn)Th2細(xì)胞的分化。進(jìn)一步對(duì)靈芝提取物的主要組分β-葡聚糖（curdlan）和肽聚糖（peptidoglycan，PGN）的研究發(fā)現(xiàn)，β-葡聚糖激活的DC細(xì)胞分泌大量IL-23和IL-10；而PGN誘導(dǎo)TNF-α和IL-23的活性較弱，生成較多的IL-1β。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，給小鼠連續(xù)口服靈芝提取物（每只鼠10 mg），每2日1次，共4周，與對(duì)照組相比，各種消化道相關(guān)淋巴組織中的Th17細(xì)胞百分率均不同程度地增加，F(xiàn)oxp3+調(diào)節(jié)T細(xì)胞也增加。靈芝提取物還增加小腸的IL-17下游分子IL-17A和IL-17F及其誘導(dǎo)的防御素（defensin）生成。結(jié)果表明，靈芝提取物及其所含β-葡聚糖在體內(nèi)外活化DC，生成大量IL-23，誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化。這一作用可能與其在腸道的抗微生物活性有關(guān)。

Yue等［31］發(fā)現(xiàn)，紫芝熱水提取物400 mg·L-1能明顯刺激人外周血單核細(xì)胞增殖。紫芝子實(shí)體的菌柄多糖（50～400 mg·L-1）能濃度依賴性地激活外周血單核細(xì)胞。TNF-α，IL-10和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）生成增加，CD14+單核細(xì)胞百分比增加，單核細(xì)胞源性DC IL-10和IL-12生成增加。

2.3 靈芝增強(qiáng)免疫細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的活性

2.3.1 靈芝增強(qiáng)單核巨噬細(xì)胞活性

單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)（mononuclear phagocyte system，MPS）是體內(nèi)具有強(qiáng)烈吞噬及防御功能的細(xì)胞系統(tǒng)，也是一類抗原提呈細(xì)胞，在特異性免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)與調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。它們共同起源于造血干細(xì)胞，在骨髓中分化發(fā)育，經(jīng)幼稚單核細(xì)胞發(fā)育成為單核細(xì)胞，隨循環(huán)血流進(jìn)入結(jié)締組織和其他器官，轉(zhuǎn)變成巨噬細(xì)胞。除了吞噬細(xì)菌等外來(lái)病原，還可吞噬自身細(xì)胞（如枯否細(xì)胞吞噬紅細(xì)胞）、腫瘤細(xì)胞、抗原抗體復(fù)合物、蓄積的脂質(zhì)等，并可在吞噬外來(lái)抗原后與輔助T細(xì)胞進(jìn)行抗原提呈，釋放刺激免疫系統(tǒng)其他細(xì)胞或其他抗原提呈細(xì)胞的物質(zhì)，活化特異性免疫反應(yīng)。

早在20世紀(jì)80年代初，我們即發(fā)現(xiàn)從靈芝子實(shí)體中提取的靈芝液和靈芝多糖D6均能提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的能力，吞噬百分率和吞噬指數(shù)均較對(duì)照組顯著增高［32］。隨后，高斌和楊貴貞［33］、顧立剛等［34］、Cao等［35］及唐慶九等［36］均報(bào)道，平蓋靈芝（樹舌，Ganoderma applanatum）多糖、薄蓋靈芝（Ganoderma capense）液、GL-PS和靈芝孢子粉堿提多糖均能促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬功能和IL-1的生成。

Hsu等［37-38］的體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，靈芝多糖促進(jìn)人中性粒細(xì)胞吞噬和遷移活性，通過(guò)激活磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）/Akt信號(hào)通路，抑制自發(fā)性Fas介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞凋亡；時(shí)間依賴性地增強(qiáng)人中性粒細(xì)胞蛋白激酶C （protein kinase C，PKC）、P38 MAPK以及酪氨酸激酶Lyn活性，這些作用可能與其促進(jìn)非特異性免疫功能有關(guān)。

Chien等［39］報(bào)道，靈芝水提取物中分離得到的含巖藻糖的多糖肽組分（F3）（10～100 mg·L-1）體外作用于人臍血單核細(xì)胞（mononuclear cells，MNC）培養(yǎng)7 d后，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞表型分析表明，CD14+CD26+單核/巨噬細(xì)胞、CD83+CD1a+DC和CD16+CD56+NK細(xì)胞較對(duì)照組分別增加了2.9，2.3和1.5倍，并且NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性（效應(yīng)細(xì)胞∶靶細(xì)胞=20∶1）提高了31.7%，而B細(xì)胞則無(wú)明顯變化。

唐慶九等［40］報(bào)道，靈芝活性多糖（GLIS）能顯著刺激巨噬細(xì)胞分泌TNF-α和IL-1β，并產(chǎn)生大量的NO，增強(qiáng)小鼠巨噬細(xì)胞對(duì)乳膠顆粒的吞噬功能。對(duì)荷瘤小鼠的巨噬細(xì)胞的上述作用強(qiáng)于正常小鼠。GLIS是一種糖蛋白，其中，碳水化合物＞90%，由8種單糖組成，主要為半乳糖、葡萄糖和甘露糖，比例為2∶4∶1.5，相對(duì)分子質(zhì)量約2×106。

Zhang等［41］報(bào)道，給BALB/c小鼠接種S180肉瘤細(xì)胞，從脾和脛骨/股骨分別分離淋巴細(xì)胞和骨髓衍生的巨噬細(xì)胞，檢測(cè)GLIS對(duì)這些細(xì)胞的影響以及抗腫瘤效果。結(jié)果GLIS能活化荷瘤小鼠脾分離的B淋巴細(xì)胞，促進(jìn)其增殖和生成IgG。同樣GLIS也能活化荷瘤小鼠的骨髓源性巨噬細(xì)胞，并且生成IL-1β，TNF-α和活性氮中間體，如NO。GLIS顯著增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬功能，顯著提高巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞毒性。GLIS可使小鼠肉瘤S180生長(zhǎng)抑制60%。

Wei等［42］發(fā)現(xiàn)，GLPS不僅增強(qiáng)了巨噬細(xì)胞J774A.1表面的TLR4和CD14表達(dá)，以及脂多糖結(jié)合和細(xì)胞內(nèi)吞作用，而且也降低了黏附時(shí)間常數(shù)，提高了結(jié)合相互作用的力常數(shù)。

Watanabe等［43］報(bào)道，在體外THP-1單核細(xì)胞培養(yǎng)中，加入富含赤芝酸（lucidenic acid）的鹿角狀靈芝（antlered form of G.lucidum）提取物（AF）可促進(jìn)TNF-α生成，并可協(xié)同脂多糖誘導(dǎo)TNF-α生成。它還可促進(jìn)脂多糖誘導(dǎo)的P38 MAPK磷酸化，抑制脂多糖誘導(dǎo)的c-Jun N端激酶（N-kinase，JNK）MAPK磷酸化。從AF中純化的赤芝酸-A和赤芝酸-F分別可調(diào)節(jié)JNK和P38 MAPK活性，從而增強(qiáng)脂多糖誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答。

Zhang等［44］發(fā)現(xiàn)，黑靈芝多糖（G.atrum polysaccharides，PSG-1）不能直接殺傷結(jié)腸癌CT26細(xì)胞，而是通過(guò)激活腹腔巨噬細(xì)胞而抑制其增殖。同時(shí)觀察到荷瘤小鼠的脾質(zhì)量指數(shù)和胸腺指數(shù)增加，TNF-α，IL-1β和NO生成增加，并發(fā)現(xiàn)PSG-1作用于TLR-4，并通過(guò)P38 MAPK信號(hào)途徑，激活NF-κB，從而刺激TNF-α的生成。

Huang等［45］從荷S180肉瘤小鼠分離出腹腔巨噬細(xì)胞，并在體外培養(yǎng)，RT-PCR法和ELISA法檢測(cè)巨噬細(xì)胞TNF-α mRNA表達(dá)和生成，在培養(yǎng)液中加入PSG-1可濃度依賴性地促進(jìn)巨噬細(xì)胞的TNF-α mRNA表達(dá)和生成。實(shí)驗(yàn)還證明，PSG-1的這一作用由NF-kB，PI3K/Akt和MAPK信號(hào)通路介導(dǎo)，并被NF-kB，PI3K/Akt和MAPK特異性抑制劑明顯抑制。

李明春等［46］采用激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞胞漿游離Ca2+濃度（［Ca2+］i）的變化，發(fā)現(xiàn)靈芝多糖組分GLB7（20mg·L-1）引起巨噬細(xì)胞中［Ca2+］i明顯升高。用EGTA螯合細(xì)胞外鈣，并用維拉帕米阻斷細(xì)胞鈣通道，然后以GLB7 20 mg·L-1刺激巨噬細(xì)胞，仍可見(jiàn)［Ca2+］i明顯升高，但升高幅度明顯低于未用EGTA和維拉帕米處理。在外液無(wú)鈣介質(zhì)中，相同濃度的GLB7刺激巨噬細(xì)胞，亦能引起［Ca2+］i升高，而后維持在高峰平臺(tái)期。于此期再加入含鈣的緩沖液，可見(jiàn)［Ca2+］i明顯升高，并出現(xiàn)另一更高的平臺(tái)。這些均說(shuō)明，GLB7引起的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞［Ca2+］i升高是由細(xì)胞外鈣內(nèi)流和細(xì)胞內(nèi)鈣釋放共同作用的結(jié)果，并進(jìn)一步證明此作用是通過(guò)IP3受體和蘭尼堿（ryamodine）受體兩種機(jī)制升高［Ca2+］i。GLB7引起巨噬細(xì)胞中［Ca2+］i升高可能與GLB7增強(qiáng)巨噬細(xì)胞功能有關(guān)。他們還采用反相離子對(duì)高效液相色譜法測(cè)定小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中PKC活性，GLB7（40 mg·L-1）能引起小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中PKC活性明顯升高。它還可引起巨噬細(xì)胞中PKC發(fā)生質(zhì)膜轉(zhuǎn)位，并拮抗PKC抑制劑星狀孢子素對(duì)PKC的抑制作用，表明靈芝多糖的免疫增強(qiáng)作用與其增強(qiáng)PKC活性有關(guān)［47］。

我們發(fā)現(xiàn)，GLPP在體內(nèi)外對(duì)叔丁基氫過(guò)氧化物（ter-butylhydroperoxide，tBOOH）和四氧嘧啶所致小鼠腹腔巨噬細(xì)胞氧化損傷有保護(hù)作用。光鏡和電鏡結(jié)果可見(jiàn)，注射GLPP可提高細(xì)胞存活率，明顯改善氧化損傷引起的巨噬細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，如抑制巨噬細(xì)胞膜樣變性和壞死，保護(hù)細(xì)胞膜微絨毛和細(xì)胞器（如線粒體）免遭tBOOH損傷，并使因自由基損傷而降低的巨噬細(xì)胞線粒體膜電位恢復(fù)［48］。另外，我們用四氧嘧啶和tBOOH為氧化劑，分別在小鼠體內(nèi)體外損傷小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，以DCHF-DA為熒光指示劑，用共聚焦顯微鏡觀察巨噬細(xì)胞的熒光變化，并用共聚焦顯微鏡作時(shí)間系列掃描，觀察巨噬細(xì)胞熒光的動(dòng)態(tài)變化，研究GLPP對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞氧自由基的清除作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，靜脈注射四氧嘧啶（75 mg·kg-1）或體外加入tBOOH （7.76×10-5mol·L-1）均可造成小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的氧化損傷，使巨噬細(xì)胞的熒光密度增加。給小鼠灌胃GLPP或?qū)⑵浼尤塍w外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞中，均可使巨噬細(xì)胞熒光密度減少，損傷減輕［49］。共聚焦顯微鏡時(shí)間系列掃描顯示，隨時(shí)間改變，GLPP可減少靜息狀態(tài)下小鼠腹腔巨噬細(xì)胞熒光密度，也可減少12-肉豆蔻酸-13-乙酸佛波醇酯（50 nmol·L-1）誘導(dǎo)的呼吸爆發(fā)狀態(tài)下小鼠腹腔巨噬細(xì)胞熒光密度。結(jié)果表明，GLPP具有抗氧化作用，對(duì)氧化劑損傷小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的自由基有清除作用［50］。

Cheng等［51］應(yīng)用基因芯片技術(shù)比較了赤芝和紫芝的乙醇提取物對(duì)人單核細(xì)胞基因表達(dá)的影響。0.2%赤芝和紫芝提取物與人單核細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，引起差異表達(dá)的基因數(shù)分別為：紫芝提取物1189個(gè)，赤芝醇提物629個(gè)，二者共有的差異表達(dá)的基因167個(gè)。這些基因影響廣泛，主要包括參與細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育（21%）細(xì)胞過(guò)程中的負(fù)調(diào)控（≈16%）細(xì)胞蛋白代謝過(guò)程（≈16%）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（≈14%）以及轉(zhuǎn)錄（≈14%）。紫芝主要作用于與炎癥和免疫反應(yīng)有關(guān)的基因，赤芝則適度地增加了參與大分子代謝的基因表達(dá)。此外，這兩種靈芝的醇提物都不抑制單核細(xì)胞增殖。表1所示為兩種靈芝共同影響的10個(gè)上調(diào)和10個(gè)下調(diào)的常見(jiàn)基因，其中已知功能的基因多數(shù)與介導(dǎo)炎癥和免疫反應(yīng)有關(guān)。表明靈芝作用的方式是復(fù)雜的，不同種靈芝調(diào)節(jié)人類細(xì)胞的不同靶點(diǎn)。

表1 紫芝和赤芝提取物共同影響的20個(gè)常見(jiàn)基因

2.3.2 靈芝增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞活性

NK是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，不僅與抗腫瘤、抗病毒感染和免疫調(diào)節(jié)有關(guān)，而且在某些情況下對(duì)多種靶細(xì)胞有自發(fā)性細(xì)胞毒活性的效應(yīng)，參與超敏反應(yīng)和自身免疫性疾病的發(fā)生。

Won等［52］采用51Cr標(biāo)記的YAC-1細(xì)胞為靶細(xì)胞，與脾NK細(xì)胞（效應(yīng)細(xì)胞）作用后，以靶細(xì)胞釋放51Cr的百分?jǐn)?shù)檢測(cè)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。給正常C3H/HeN小鼠口服、腹腔注射、靜脈注射靈芝水萃取物再經(jīng)乙醇萃取后的醇不溶性成分（GL-AI）可增強(qiáng)脾NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。腹腔注射的最適劑量為20～40 mg·kg-1，劑量過(guò)低或過(guò)高增強(qiáng)作用減弱。與此同時(shí)，給藥小鼠的血清IFN滴度亦明顯增加。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，給C57BL/6小鼠或C3H/HeN小鼠接種黑色素瘤B16-F10和肝肉瘤129P后2周，荷瘤小鼠的脾NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性顯著降低，腹腔注射GL-AI 40 mg·kg-1，可明顯增強(qiáng)荷瘤小鼠NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。Won等［53］給小鼠腹腔注射松杉靈芝（Ganoderma tsugae）水提取物（4～200 mg·kg-1）或不溶于乙醇的靈芝提取組分（GTI，1～50 mg·kg-1），呈劑量依賴性地促進(jìn)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，而溶于乙醇的松杉靈芝提取組分則無(wú)此作用。寧安紅等［54］給予荷瘤小鼠腹腔注射靈芝多糖（1 mg·d-1），連續(xù)7 d，與對(duì)照組比較，明顯提高荷瘤小鼠NK細(xì)胞活性、淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)及血清中TNF-α和IL-2的含量。

小鼠一次性腹腔注射免疫抑制藥環(huán)磷酰胺300 mg·kg-1制備免疫抑制小鼠模型，24 h后分別腹腔注射Gl-PS 2.5，25和250 mg·kg-1，每天1次，連續(xù)7d。與生理鹽水對(duì)照組比較，GL-PS2.5mg·kg-1組免疫抑制模型小鼠，其受抑制的骨髓細(xì)胞、紅細(xì)胞、白細(xì)胞、脾NK以及NKT細(xì)胞數(shù)的恢復(fù)時(shí)間明顯縮短，造模后第5天GL-PS 2.5 mg·kg-1組的CTL活性、第7～9天NK細(xì)胞、淋巴因子激活殺傷細(xì)胞（lymphokine activated killer，LAK）活性以及第12天巨噬細(xì)胞吞噬和細(xì)胞毒活性均顯著升高［55］。

Chang等［56］給BALB/c小鼠腹腔注射單核細(xì)胞型白血病WEHI-3細(xì)胞后，給小鼠連續(xù)口服靈芝提取物（3和6 mg·kg-1）28 d，可見(jiàn)小鼠脾質(zhì)量降低，外周血單核細(xì)胞的吞噬作用和NK細(xì)胞活性增強(qiáng)；靈芝處理組能緩解CD3+和CD19+百分率的降低，抑制Mac-3和CD11b百分率的升高，促進(jìn)Con A刺激的脾細(xì)胞增殖，對(duì)LPS刺激無(wú)顯著影響，提示先導(dǎo)T 和B細(xì)胞被誘導(dǎo)，而巨噬細(xì)胞被抑制。

Tsai等［57］報(bào)道，以酸水解的方法分別獲得靈芝多糖的兩種主要溶于水的組分：肽聚糖GLPS-SF1（相對(duì)分子質(zhì)量約20 ku，葡萄糖∶甘露糖≈4∶1）和寡糖GLPS-SF2（相對(duì)分子質(zhì)量1～5 ku）。這兩種組分（100 mg·L-1）都可誘導(dǎo)人外周血單核細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞表面的CD69表達(dá)，不同程度地促進(jìn)外周血單核細(xì)胞的Th1型細(xì)胞因子IL-12，IL-2，TNF-α和IFN-γ產(chǎn)生。在CD14+單核細(xì)胞，GLPSSF1誘導(dǎo)CD80/CD86共刺激分子和IL-12，TNF-α能力更強(qiáng)；GLPS-SF1能通過(guò)TLR4受體及其信號(hào)通路活化小鼠巨噬細(xì)胞（HeNC2）生成TNF-α。以蛋白酶K水解去除肽鏈后，剩余的GLPS-SF1多糖部分仍具有免疫活性。GLPS-SF2能特異性地活化和促進(jìn)NK細(xì)胞和T細(xì)胞增殖，并能誘導(dǎo)IL-2，IFN-γ以及更高水平的IL-2產(chǎn)生。

2.3.3 靈芝增強(qiáng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞活性

將人外周血淋巴細(xì)胞在體外與多種細(xì)胞因子共培養(yǎng)后，獲得一群異質(zhì)細(xì)胞即細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞（cytokine induced killer cells，CIK），它們具有增殖力強(qiáng)、殺瘤活性高、殺瘤譜廣及對(duì)多藥耐藥腫瘤細(xì)胞同樣敏感等特點(diǎn)，是新一代抗腫瘤過(guò)繼細(xì)胞免疫治療的首選方案。

我們按常規(guī)方法制備的CIK細(xì)胞（在小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)中，加入IFN-γ 1000 kU·L-1+抗CD3抗體50 μg·L-1+IL-2 300 kU·L-1+IL-1 100 kU·L-1，培養(yǎng)15 d，收獲CIK細(xì)胞）。結(jié)果可見(jiàn)，CIK細(xì)胞對(duì)體外培養(yǎng)的YAC-1和P815腫瘤細(xì)胞有明顯的細(xì)胞毒作用。在CIK細(xì)胞培養(yǎng)中，加入GL-PS（100和400 mg·L-1）可明顯降低IL-2和抗CD3單抗的用量（分別為未加多糖的常規(guī)CIK細(xì)胞對(duì)照組的75%和50%），但與常規(guī)CIK細(xì)胞對(duì)照組相似，能誘導(dǎo)和大量擴(kuò)增CIK細(xì)胞，且此CIK細(xì)胞在體外對(duì)YAC-1和P815腫瘤細(xì)胞的殺傷率亦與常規(guī)對(duì)照組無(wú)明顯差異。將此CIK細(xì)胞靜脈輸注給荷S180或荷H22肝肉瘤小鼠后，其體內(nèi)抗腫瘤療效與常規(guī)CIK細(xì)胞治療組比較亦無(wú)差異。我們還發(fā)現(xiàn)，GL-PS在降低抗CD3單抗和IL-2用量50%和75%的條件下，能促進(jìn)CIK細(xì)胞顆粒酶B以及穿孔素mRNA和蛋白的表達(dá)。這表明GL-PS通過(guò)增加顆粒酶B和穿孔素的表達(dá)，從而增強(qiáng)CIK細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的活性。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)還表明，GL-PS對(duì)CIK細(xì)胞的作用經(jīng)由淋巴細(xì)胞表面的補(bǔ)體3型（CR3）受體介導(dǎo)［58-59］。

2.4 靈芝抑制腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸

腫瘤的免疫逃逸是指腫瘤細(xì)胞可通過(guò)多種方式逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)控、識(shí)別與攻擊而繼續(xù)分裂生長(zhǎng)。腫瘤的免疫逃逸機(jī)制復(fù)雜，主要涉及機(jī)體全身或局部免疫功能低下，腫瘤細(xì)胞表面MHC類分子及協(xié)同刺激分子表達(dá)異常，腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生免疫抑制性因子，腫瘤細(xì)胞Fas表達(dá)的抗宿主免疫等。

2.4.1 靈芝促進(jìn)B16F10黑素瘤細(xì)胞MHC-Ⅰ分子和協(xié)同刺激因子的生成

通常，腫瘤抗原肽與腫瘤細(xì)胞表面的MHC-Ⅰ分子結(jié)合形成復(fù)合物，再與T細(xì)胞表面的抗原受體結(jié)合，活化T細(xì)胞并殺傷腫瘤細(xì)胞。這一過(guò)程還需要B7-1和B7-2等協(xié)同刺激分子與T細(xì)胞表面的CD28分子結(jié)合。而惡性腫瘤細(xì)胞常表現(xiàn)為MHC-Ⅰ分子和協(xié)同刺激分子的低表達(dá)或不表達(dá)，這是構(gòu)成腫瘤免疫逃逸的重要機(jī)制。最近，Sun等［60］報(bào)道了GL-PS對(duì)B16F10黑素瘤細(xì)胞MHC-Ⅰ分子和協(xié)同刺激因子的影響。B16F10黑素瘤細(xì)胞MHC-Ⅰ分子和B7-1及B7-2分子表達(dá)不足或不表達(dá)，在B16F10黑素瘤細(xì)胞培養(yǎng)液中加入GL-PS可促進(jìn)這些分子的表達(dá)。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與RPMI 1640培養(yǎng)基對(duì)照組相比，不同濃度GL-PS作用48 h，GL-PS可使B16F10黑素瘤細(xì)胞MHC-Ⅰ分子H-2Kb和H-2DbmRNA表達(dá)增加，也可使B7-1 和B7-2 mRNA表達(dá)增加；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，GL-PS可使H-2Kb，H-2Db，B7-1和B7-2分子表達(dá)增強(qiáng)。此外，GL-PS（200，400和600 mg·L-1）作用下的B16F10黑素瘤細(xì)胞與PHA活化的小鼠脾淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的抗B16F10細(xì)胞毒活性較對(duì)照組明顯提高［60］。

用不同濃度GL-PS作用抗原提呈功能低下的B16F10黑素瘤細(xì)胞，再與淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)與RPMI 1640培養(yǎng)基對(duì)照組相比，GL-PS 200和400 mg·L-1可使淋巴細(xì)胞增殖活性升高，并使淋巴細(xì)胞活化抗原CD69的表達(dá)增強(qiáng)，GL-PS 400 mg·L-1可促進(jìn)淋巴細(xì)胞FasL的表達(dá)及IFN-γ的生成［61］。

上述結(jié)果表明，GL-PS可促進(jìn)B16F10黑素瘤細(xì)胞MHC-Ⅰ分子和協(xié)同刺激因子生成，因而促進(jìn)淋巴細(xì)胞活化，增強(qiáng)淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。

2.4.2 靈芝抑制B16F10黑素瘤細(xì)胞分泌免疫抑制因子

已知腫瘤細(xì)胞可產(chǎn)生多種免疫抑制分子，抑制免疫細(xì)胞的功能，逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的攻擊。IL-10，TGF-β和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）為腫瘤細(xì)胞中常見(jiàn)的免疫抑制分子。

經(jīng)ELISA方法檢測(cè)，B16F10黑素瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-10，TGF-β和VEGF水平顯著高于RPMI 1640培養(yǎng)基對(duì)照，表明B16F10黑素瘤細(xì)胞可分泌這3種免疫抑制因子。收集B16F10黑素瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，加入小鼠脾淋巴細(xì)胞中，用PHA誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞活化，并觀察GL-PS對(duì)其的影響。與未加GL-PS的對(duì)照組相比，GL-PS 0.2～12.8 mg·L-1可使受抑制的淋巴細(xì)胞增殖活性顯著增強(qiáng)和受抑制的穿孔素表達(dá)增加，GL-PS 3.2和12.8 mg·L-1可使受抑制的顆粒酶B表達(dá)增加，GL-PS 0.2～12.8 mg·L-1還可使受抑制的混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)顯著增強(qiáng)［62］。GL-PS 0.2～12.8 mg·L-1還可使受抑制的細(xì)胞活化分子CD71和FasL表達(dá)顯著增加［63］。在小鼠脾單核淋巴細(xì)胞培養(yǎng)中，加入B16F10黑素瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液，可抑制PHA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞IL-2和IFN-γ和TNF-α mRNA表達(dá)和生成，同時(shí)加入GL-PS（0.8～12.8 mg·L-1）則可使3種細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)和生成顯著恢復(fù)［64］。

RT-PCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與未加GL-PS的對(duì)照組相比，GL-PS可使B16F10黑素瘤細(xì)胞的IL-10mRNA，TGF-β1 mRNA，VEGF mRNA表達(dá)顯著減少。ELISA檢測(cè)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，與未加GL-PS的對(duì)照組相比，GL-PS可使B16F10黑素瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中IL-10，TGF-β1和VEGF生成顯著減少［65］。

這些結(jié)果表明，GL-PS可在一定程度上拮抗B16F10黑素瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清誘導(dǎo)的免疫抑制作用，其機(jī)制可能與GL-PS促進(jìn)淋巴細(xì)胞活化和抑制B16F10黑素瘤細(xì)胞分泌免疫抑制因子有關(guān)。

一些研究靈芝抑制腫瘤血管新生的報(bào)道，同樣也證實(shí)靈芝抑制其他腫瘤細(xì)胞表達(dá)與分泌VEGF。

我們發(fā)現(xiàn)，在低氧條件下培養(yǎng)的人肺癌細(xì)胞（PG）可分泌VEGF和GLPP可抑制其分泌［66］。王筱婧等［67］觀察靈芝孢子粉對(duì)裸鼠移植性人肝腫瘤生長(zhǎng)的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)在靈芝孢子粉抑制腫瘤生長(zhǎng)的同時(shí)，VEGF、微血管密度表達(dá)水平顯著降低。Hsu等［68］發(fā)現(xiàn)，松杉靈芝甲醇提取物（GTME）抑制體外培養(yǎng)的人表皮狀癌A-431細(xì)胞增殖，還可增強(qiáng)紫杉醇對(duì)A-431細(xì)胞增殖的抑制作用。與此同時(shí)，抑制EGF受體和VEGF的表達(dá)，并抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的毛細(xì)管形成。EGF可拮抗GTME所致的VEGF表達(dá)的抑制。體內(nèi)給予GTME也能顯著抑制A-431異種移植腫瘤在裸鼠體內(nèi)生長(zhǎng)，并抑制表皮生長(zhǎng)因子受體和VEGF的表達(dá)。郭鵬榮等［69］觀察靈芝多糖對(duì)順鉑抑制荷人膀胱癌T24細(xì)胞裸鼠腫瘤生長(zhǎng)及血管生成作用的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，靈芝多糖抑制體外培養(yǎng)的T24細(xì)胞增殖作用較弱，但與順鉑聯(lián)合給藥則有明顯協(xié)同作用。靈芝多糖（200 mg·kg-1，灌胃）與順鉑（25 mg·kg-1）聯(lián)合，可顯著增強(qiáng)順鉑對(duì)荷T24瘤裸鼠腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用。免疫組化染色結(jié)果顯示，靈芝多糖與順鉑聯(lián)合可抑制VEGF、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）的表達(dá)，抑制腫瘤組織的血管生成，且抑制作用顯著強(qiáng)于單用順鉑。qRT-PCR和Western蛋白印跡法檢測(cè)結(jié)果也顯示，與單用順鉑比較，靈芝多糖聯(lián)合順鉑給藥后，荷瘤裸鼠腫瘤組織中VEGF和bFGF的表達(dá)顯著下降。結(jié)果顯示，靈芝多糖可下調(diào)VEGF和bFGF的表達(dá)，增強(qiáng)順鉑對(duì)T24荷瘤裸鼠腫瘤生長(zhǎng)及血管生成的抑制作用。腫瘤細(xì)胞分泌的免疫抑制分子對(duì)巨噬細(xì)胞的抗腫瘤活性亦有抑制作用。靈芝多糖可拮抗或抵消這種抑制作用。Sun等［70］報(bào)道，在用脂多糖活化巨噬細(xì)胞時(shí)，加入B16F10黑素瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液可抑制巨噬細(xì)胞的活化，再加入不同劑量的GL-PS可拮抗這種抑制作用。與未加GL-PS的對(duì)照組相比，GL-PS（0.2～12.8 mg·L-1）可使受抑制的巨噬細(xì)胞吞噬活性增強(qiáng)，可使受抑制的NO的生成及TNF-α的生成增加，GL-PS還可增強(qiáng)受抑制的TNF-α殺傷L929細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。

2.4.3 靈芝拮抗肺癌患者血清誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞活性抑制

Sun等［71］將不同濃度GL-PS加入受肺癌患者血清抑制的人外周血淋巴細(xì)胞，再用PHA誘導(dǎo)活化淋巴細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)與未加GL-PS的對(duì)照組比較，GL-PS 3.2和12.8 mg·L-1顯著增強(qiáng)受抑制的淋巴細(xì)胞表面細(xì)胞活化抗原CD69的表達(dá)，顯著改善受抑制的淋巴細(xì)胞增殖活性，明顯提高受抑制淋巴細(xì)胞穿孔素和顆粒酶B的水平。

2.5 腫瘤相關(guān)的靈芝多糖抗體研究

Liao等［72］報(bào)道，從靈芝水溶性粗提取物（F3）中，純化出一種富含L-巖藻糖（L-fucose）的多糖組分（FMS），其相對(duì)分子質(zhì)量為35 ku，單糖組成比為L(zhǎng)-巖藻糖（Fuc）∶D-木糖（Xyl）∶D-半乳糖（Gal）∶D-甘露糖（Man）=2∶1.5∶2.5∶3.5，尚含有少量葡萄糖（Glu）和氨基糖（葡萄糖胺和半乳糖胺）。注射FMS可顯著抑制小鼠Lewis肺癌（LLC1）生長(zhǎng)，并減少腫瘤相關(guān)炎癥介質(zhì)如單核細(xì)胞趨化蛋白-1、CXCL1（KC）和粒細(xì)胞集落刺激因子的生成，小鼠的B1 B細(xì)胞（IgMhiIgDloCD11blo）亞群數(shù)增加，提示FMS誘導(dǎo)抗多糖IgM生成。體外實(shí)驗(yàn)表明，注射FMS的小鼠血清對(duì)于表達(dá)Globo H抗原的LLC1細(xì)胞具有抗體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。以多糖微陣列分析FMS誘導(dǎo)生成的抗血清結(jié)果顯示出高度特異性，其抗原結(jié)構(gòu)位于非還原端，（即Fucα1-2Galβ1-3Gal-NAc-R；其中，Gal，GalNAc和R分別代表D-半乳糖，D-N-乙酰氨基半乳糖和還原末端），是典型的Globo H型以及腫瘤相關(guān)的抗原。FMS的組成主要包括1，4-甘露聚糖和1，6-α-半乳聚糖為主鏈，通過(guò)Fucα1-2Gal，F(xiàn)ucα1-3/4Man，F(xiàn)ucα1-4Xyl和Fucα1-2Fuc連接，成為FMS誘導(dǎo)產(chǎn)生IgM的分子基礎(chǔ)，F(xiàn)MC的末端Fuc結(jié)構(gòu)對(duì)其抗體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性是十分重要的。這一發(fā)現(xiàn)提示，靈芝多糖促進(jìn)抗Globo H抗體產(chǎn)生的作用對(duì)Globo H陽(yáng)性的肺癌患者具有潛在的免疫治療價(jià)值。

2.6 靈芝抗腫瘤作用的免疫學(xué)機(jī)制與中醫(yī)“扶正固本”治則

20世紀(jì)70年代，通過(guò)藥理和臨床研究，我們建立了探討靈芝“扶正固本”作用機(jī)制的工作假說(shuō)，提出靈芝的扶正固本作用可能與其增強(qiáng)機(jī)體重要器官系統(tǒng)的功能，減輕各種致病因素對(duì)機(jī)體的損害，改善神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用，加強(qiáng)機(jī)體的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)能力，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定有關(guān)［73］。

中醫(yī)理論認(rèn)為，健康和疾病屬于正邪相爭(zhēng)的不同狀態(tài)，健康是由于“正氣存內(nèi)，邪不可干”；而疾病則是“邪之所湊，其氣必虛”，但治療疾病不一定要徹底消除外邪，只要達(dá)到正氣存內(nèi)，邪不可干即可。靈芝及其有效成分靈芝多糖在體外不能抑制腫瘤細(xì)胞增殖，也不能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，但在體內(nèi)卻有明顯的抗腫瘤作用。為探討其作用機(jī)制，我們?cè)隗w內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用血清藥理學(xué)和細(xì)胞、分子藥理學(xué)相結(jié)合的研究方法，發(fā)現(xiàn)靈芝之所以在體內(nèi)有抗腫瘤作用，是因?yàn)樗茉鰪?qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫功能，包括增強(qiáng)單核巨噬細(xì)胞、DC、NK和CTL細(xì)胞的功能，促進(jìn)細(xì)胞因子如IFN-γ，TNF-α和IL-2等生成，促進(jìn)腫瘤相關(guān)抗體產(chǎn)生，拮抗腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸等。此外，一系列研究還證明，靈芝及其有效成分對(duì)化療藥和放射線引起的胃腸道、肝、腎、骨髓損傷有明顯的保護(hù)作用［1］。通過(guò)這些作用，靈芝扶持了正氣，實(shí)現(xiàn)了正氣存內(nèi)，邪（腫瘤）不可干或扶正祛邪（腫瘤）。

研究結(jié)果闡明了靈芝“扶正固本”作用的實(shí)質(zhì)是增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、改善各種致病因素對(duì)機(jī)體重要器官系統(tǒng)的損害，恢復(fù)機(jī)體的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)。這一結(jié)論與我們的工作假說(shuō)中對(duì)“扶正固本”作用機(jī)制的設(shè)想是一致的，也為用現(xiàn)代科技方法結(jié)合中醫(yī)藥傳統(tǒng)理論研究中藥藥理、詮釋中醫(yī)理論提供了一個(gè)范例［74-75］。

3 靈芝提高腫瘤放化療患者的免疫功能

許多臨床研究均證明，靈芝制劑與化療或放療合用時(shí)，對(duì)一些腫瘤如胃癌、食管癌、肺癌、肝癌、膀胱癌、腎癌、大腸癌、前列腺癌和子宮癌等有較好的輔助治療效果。其療效特點(diǎn)如下：提高腫瘤患者對(duì)化療和放療的耐受性；減輕化療和放療引起的白細(xì)胞減少、食欲缺乏、體質(zhì)量減輕、抗感染免疫力降低、肝腎損傷等嚴(yán)重不良反應(yīng)；提高腫瘤患者的免疫功能，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫力；提高腫瘤患者的生活質(zhì)量，使體質(zhì)增強(qiáng)［1］。本節(jié)僅從在國(guó)內(nèi)外公開(kāi)發(fā)表的20余篇靈芝臨床研究論文中，選擇其中包含免疫指標(biāo)的臨床研究報(bào)道予以介紹。

焉本魁等［76］報(bào)道，Ⅱ～Ⅳ期非小細(xì)胞肺癌（肺腺癌32例，鱗癌15例，鱗腺癌7例，大細(xì)胞癌2例）患者56例，均經(jīng)胸片和肺CT證實(shí)，又經(jīng)病理組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)檢查確診為原發(fā)性非小細(xì)胞性肺癌患者；不能或不愿手術(shù)或術(shù)后肺內(nèi)復(fù)發(fā)、播散；一般情況好，卡氏（Karnofsky）評(píng)分＞60分，預(yù)計(jì)生存時(shí)間＞3個(gè)月；具有影像學(xué)（X線攝片、CT或MRI）可測(cè)的病灶供客觀評(píng)價(jià)，兩組患者治療前病情無(wú)顯著性差異。將56例患者隨機(jī)分為治療組（靈芝口服液+化療組）35例，對(duì)照組（單用化療）21例?；煈?yīng)用順鉑加長(zhǎng)春地辛方案。治療組同時(shí)口服靈芝口服液（靈芝子實(shí)體提取物），每次20 mL，一日3次。所統(tǒng)計(jì)患者必須完成2個(gè)療程治療，未完成治療的或者中途中止或死亡的都判為無(wú)效。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，治療2個(gè)療程后，治療組35例中完全緩解（CR）為2例（5.7%），部分緩解（PR）為21例（60%），穩(wěn)定（NC）為9例（25.71%），進(jìn)展（PD）為3例（8.57%），CR+PR（總緩解率）為23例（65.71%）；對(duì)照組21例中CR 為1例（4.76%），PR為8例（38.14%），NC為10例（47.62%），PD為2例（9.52%），CR+PR為9例（42.85%），兩組比較，有顯著性差異（P＜0.01）。治療組卡氏評(píng)分增加的為24例（68.57%），穩(wěn)定的為7例（20%），下降的為4例（11.43%）；對(duì)照組評(píng)分增加的為9例（42.85%），穩(wěn)定的為8例（38.10%），下降的為4例（19.05%），治療組生活質(zhì)量改善率（68.57%）與對(duì)照組（42.85%）比較有顯著差異。治療組治療前后的各血像指標(biāo)無(wú)明顯變化，而對(duì)照組治療前后紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血紅蛋白和血小板均明顯下降，表明靈芝口服液能減輕化療對(duì)骨髓造血功能的抑制。治療后治療組T3，T4和T8較治療前均有不同程度的升高，對(duì)照組患者治療后T3，T4和T8各有不同程度的降低，提示靈芝口服液能增強(qiáng)腫瘤患者的細(xì)胞免疫功能。

張新等［77］報(bào)道，29例主要為經(jīng)病理診斷為肺癌的Ⅲ～Ⅳ期患者，卡氏評(píng)分＞50，預(yù)計(jì)可存活＞6個(gè)月。隨機(jī)分組，靈芝組口服靈芝片（每片含靈芝提取物55 mg），每日2次，每次2～4片，連用3個(gè)月。對(duì)照組以同樣劑量服用安慰劑。觀察靈芝片和安慰劑對(duì)肺癌患者免疫調(diào)節(jié)、血液流變學(xué)和臨床治療效果等的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，靈芝組血清TNF-α水平由治療前的（17.7±4.3）ng·L-1增至治療后的（28.7± 6.6）ng·L-1；對(duì)照組則分別為14.0±4.9和（19.1± 13.2）ng·L-1。對(duì)照組血清可溶性IL-2受體水平從治療前的（259±275）kU·L-1增至治療后的（501± 291）kU·L-1（P＜0.05），而靈芝組僅從（321±311）kU·L-1增至（372±267）kU·L-1（P＞0.05）。服靈芝后未見(jiàn)血液流變學(xué)的明顯改變，僅見(jiàn)纖維蛋白原明顯下降。未觀察到肝、腎功能損害等嚴(yán)重毒副作用。結(jié)果提示，靈芝對(duì)肺癌患者有免疫調(diào)節(jié)和改善血液高凝狀態(tài)的作用。

王躍輝等［78］將58例非小細(xì)胞肺癌患者隨機(jī)分為試驗(yàn)組和對(duì)照組，試驗(yàn)組29例，在化療同時(shí)口服破壁靈芝孢子粉，每次1 g，一日3次；對(duì)照組29例，單獨(dú)應(yīng)用化療。兩組化療方案相同：紫杉醇135～175mg·m-2，第1天；順鉑20～25mg·m-2，第1～3天，3周方案，連續(xù)4個(gè)周期，于化療前后常規(guī)給予抗過(guò)敏、止吐和保肝輔助治療?；熐凹暗?和4周期化療后進(jìn)行外周血T細(xì)胞亞群（CD3+，CD4+，CD8+，CD4+/CD8+）水平檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，治療后試驗(yàn)組外周血CD3+，CD4+，CD4+/CD8+水平增高，CD8+水平降低；對(duì)照組外周血CD3+，CD4+，CD4+/CD8+水平降低，CD8+水平升高。試驗(yàn)組CD4+/CD8+比值較治療前及對(duì)照組治療后均有顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果提示，破壁靈芝孢子粉可改善非小細(xì)胞肺癌化療患者的T細(xì)胞亞群，提升患者的細(xì)胞免疫功能。

林能俤等［79］將經(jīng)病理學(xué)、細(xì)胞學(xué)和CT檢查證實(shí)的114例癌癥（胃癌、食管癌、肺癌、肝癌、宮頸癌、結(jié)腸癌和膀胱癌）患者隨機(jī)分為化療+靈芝組（66例）和單純化療組（48例）進(jìn)行治療前后對(duì)照和組間比較，觀察靈芝提取物配合化療治療癌癥的療效。治療組：從化療（FAM方案）開(kāi)始及化療后服靈芝提取物膠囊，每次服4粒，每日4次，40 d為1療程。結(jié)果可見(jiàn)，靈芝提取物膠囊配合化療可明顯改善癌癥患者的細(xì)胞免疫功能。治療前、后化療+靈芝組NK細(xì)胞活性分別為51.24±7.90和48.10± 7.90（P＞0.05）；單純化療組分別為51.40±6.62和44.43±7.19（P＜0.05）；化療+靈芝組治療前后CD3，CD4，CD8細(xì)胞亞型（%）無(wú)顯著改變，但單純化療組治療后CD3，CD4，CD8細(xì)胞亞群百分率明顯降低（P＜0.05）?；颊叩闹嗅t(yī)臨床癥狀、生活質(zhì)量亦獲改善。

齊元富等［80］報(bào)道，200例住院胃癌、食管癌、肝癌、大腸癌、胰腺癌、膽囊癌、膽管癌、壺腹周圍癌和胃惡性淋巴瘤腫瘤患者經(jīng)細(xì)胞學(xué)或病理學(xué)診斷（肝癌為臨床診斷），卡氏生活質(zhì)量評(píng)分均＞60分，本次治療前1個(gè)月內(nèi)未經(jīng)過(guò)抗癌治療。試驗(yàn)組（100例）口服靈芝孢子粉膠囊（每粒0.25 g），每次4粒，每日3次。對(duì)照組（100例）口服貞芪扶正沖劑（每包15 g），每次1包，日3次。兩組病例均服藥4周為1個(gè)療程，每例用藥不少于2個(gè)療程。兩組患者均在每療程開(kāi)始當(dāng)日行常規(guī)化療。胃癌、肝癌及大腸癌等用FAM方案，食管癌用CFP方案。4周為1個(gè)周期，連續(xù)應(yīng)用2個(gè)周期。療程結(jié)束后判定療效。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，①近期客觀療效：試驗(yàn)組總有效率（CR+ PR）43%，其中CR 3例、PR 40例、NC 45例、PD 12例；對(duì)照組有效率33%，其中CR 2例、PR 31例、NC 48例、PD 19例。兩組間有顯著差異（P＜0.05）。②生活質(zhì)量變化：試驗(yàn)組卡氏評(píng)分上升≥10分者66例，上、下波動(dòng)在10分以內(nèi)（穩(wěn)定）者23例，減低＞10分者11例；對(duì)照組上升49例，穩(wěn)定19例，下降32例。兩組比較有顯著性差異（P＜0.05）。③體質(zhì)量變化：試驗(yàn)組體質(zhì)量增加≥1.5 kg者68例，上、下波動(dòng)在1.5 kg以內(nèi)（穩(wěn)定）者21例、降低＞1.5 kg者11例；對(duì)照組體質(zhì)量增加45例，穩(wěn)定26例，降低29例。兩組比較有顯著性差異（P＜0.05）。④外周血像變化：試驗(yàn)組治療末白細(xì)胞、血小板恢復(fù)正常者分別為89和92例，低于正常者11和8例；對(duì)照組恢復(fù)正常者分別為93和95例，低于正常者分別為7和5例。兩組比較無(wú)顯著差異（P＞0.05）。⑤免疫功能變化：治療后與治療前比較，試驗(yàn)組CD3+細(xì)胞從（55.35±7.30）%增至（67.23±6.61）%（P＜0.01），CD4/CD8比值從1.35±0.67增至1.58±0.44（P＜0.05），T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率從（60.19±8.05）%增至（65.02±9.64）%（P＜0.05）；對(duì)照組上述免疫指標(biāo)治療前后均無(wú)顯著變化，而試驗(yàn)組治療后與對(duì)照組治療后比較，上述細(xì)胞免疫學(xué)指標(biāo)的改善均有顯著性差異（P＜0.05）。試驗(yàn)組服藥期間未見(jiàn)明顯不良反應(yīng)。結(jié)果表明，靈芝孢子粉膠囊可作為腫瘤化療的輔助治療藥，具有增效、減毒作用。

甄作均等［81］選擇2008年11月至2010年12月該院收治的70例肝癌肝切除患者，采用計(jì)算機(jī)隨機(jī)數(shù)字表法將肝癌患者隨機(jī)分為常規(guī)護(hù)肝治療組（常規(guī)護(hù)肝組）和靈芝孢子粉治療組（靈芝孢子粉組）。另選35例健康體檢者作為健康對(duì)照組。常規(guī)護(hù)肝組術(shù)后1 d開(kāi)始給予復(fù)方甘草酸苷注射液+極化液；靈芝孢子粉組在常規(guī)護(hù)肝治療的基礎(chǔ)上，術(shù)后1 d開(kāi)始口服靈芝孢子粉（每粒0.3 g），每次5粒，一日3次。分別于術(shù)前（或入組時(shí)）及術(shù)后1，7和28 d檢測(cè)外周血T淋巴細(xì)胞亞群（CD4+和CD8+）和NK細(xì)胞。CD4+，CD8+和NK細(xì)胞占淋巴細(xì)胞百分率的比較采用t檢驗(yàn)。結(jié)果，肝癌患者CD4+細(xì)胞百分率（34±7）%較健康對(duì)照組（43±7）%明顯降低（P＜0.05）；肝癌患者CD8+細(xì)胞百分率（30±3）%較健康對(duì)照組（27±3）%明顯升高（P＜0.05）；肝癌患者NK細(xì)胞百分率為（13±4）%較健康對(duì)照組（19±5）%明顯降低（P＜0.05）。術(shù)前常規(guī)護(hù)肝組肝癌患者的CD4+，CD8+及NK細(xì)胞百分率與靈芝孢子粉組比較無(wú)顯著差異。與術(shù)前相比，兩組肝癌患者術(shù)后1 d 的CD4+，CD8+及NK細(xì)胞百分率均顯著降低。靈芝孢子粉組術(shù)后7和28 d的CD4+細(xì)胞百分率與常規(guī)護(hù)肝組比較明顯升高，CD8+細(xì)胞百分率明顯降低，NK細(xì)胞百分率明顯升高。結(jié)果表明肝癌患者術(shù)前及術(shù)后早期細(xì)胞免疫功能受到抑制，術(shù)后早期應(yīng)用靈芝孢子粉可改善患者的細(xì)胞免疫抑制狀態(tài)，有利于維護(hù)機(jī)體的免疫平衡，對(duì)患者術(shù)后的恢復(fù)及預(yù)后具有積極意義。

周吉華和張慶華［82］選擇2012年5月-2013年5月于該院行手術(shù)治療的90例老年宮頸癌（鱗癌、腺癌、腺鱗癌）患者，采用完全隨機(jī)對(duì)照研究，隨機(jī)數(shù)字表法將患者分為對(duì)照組和觀察組。兩組患者的年齡、病理學(xué)分型、臨床分期等一般資料無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。對(duì)照組術(shù)前3周，給予動(dòng)脈介入新輔助化療，BOMP化療方案：平陽(yáng)霉素（博萊霉素）16 mg，長(zhǎng)春新堿1 mg·m-2，絲裂霉素10 mg·m-2，順鉑50 mg·m-2。導(dǎo)管經(jīng)單側(cè)股動(dòng)脈插入對(duì)側(cè)髂內(nèi)動(dòng)脈，灌注50%劑量的化療藥物；選擇至子宮動(dòng)脈，明膠海綿條栓塞至造影處。插管至同側(cè)髂內(nèi)動(dòng)脈，灌入另50%化療藥物，行子宮動(dòng)脈栓塞，壓迫包扎。術(shù)后平臥8 h，對(duì)癥、抗感染。新輔助化療后行宮頸癌根治術(shù)，主要為盆髂區(qū)淋巴清掃術(shù)和廣泛性子宮切除術(shù)。觀察組：在對(duì)照組治療基礎(chǔ)上，術(shù)后給予靈芝孢子粉，即術(shù)后第1天起開(kāi)始口服靈芝孢子粉（每粒0.3 g），每次5粒，1天3次，療程28 d。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血T淋巴細(xì)胞亞群，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)VEGF mRNA。結(jié)果顯示，對(duì)照組與觀察組治療前外周血T淋巴細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞活性及VEGF mRNA無(wú)明顯差異（P＞0.05）；與對(duì)照組比較，觀察組治療后CD8+降低，CD4+和CD4+/ CD8+比值和NK細(xì)胞活性均顯著升高（P＜0.05），VEGF mRNA表達(dá)顯著減少?？梢?jiàn)靈芝孢子能明顯改善老年宮頸癌患者術(shù)后細(xì)胞免疫功能，且減少VEGF的表達(dá)。

Zhao等［83］將48名進(jìn)行內(nèi)分泌治療具有癌相關(guān)性疲勞癥狀的乳腺癌患者被隨機(jī)分為試驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組患者接受口服靈芝孢子粉每次1 g，一日3次，共治療4周。對(duì)照組服用安慰劑治療。在治療前及治療后，患者進(jìn)行癌癥治療相關(guān)疲乏功能評(píng)估表（FACIT-F），焦慮及抑郁量表（HADS），生活質(zhì)量問(wèn)卷表（EORTC QLQ-C30）的評(píng)估。服用靈芝孢子粉前后，檢測(cè)患者血液中的TNF-α和IL-6的水平和肝腎功能。應(yīng)用配對(duì)檢驗(yàn)及回歸分析對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。FACT-F評(píng)估結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，患者接受靈芝孢子粉治療后身體狀況評(píng)分及疲勞程度評(píng)分均明顯升高（分別為P＜0.01 及P＜0.01）。HADS及EORTC QLQ-C30結(jié)果顯示，試驗(yàn)組患者的焦慮及抑郁程度降低及生活質(zhì)量滿意度增高（分別為P＜0.01和P＜0.01）。試驗(yàn)組患者用藥前后血液中TNF-α分別為128.7和71.9ng·L-1，IL-6分別為62.4和37.6 ng·L-1，用藥后血液中TNF-α和IL-6均明顯降低（P＜0.01，P＜0.05）。表明靈芝孢子粉可改善接受內(nèi)分泌治療乳腺癌患者的癌相關(guān)性疲勞，改善患者的抑郁程度，提高生活質(zhì)量。其療效機(jī)制可能與降低引起癌癥疲勞的免疫因子TNF-α和IL-6水平有關(guān)。服用靈芝孢子粉過(guò)程中無(wú)嚴(yán)重不良反應(yīng)發(fā)生。

黃建明等［84］探討了靈芝合劑與抗CD3抗體激活殺傷細(xì)胞（anti-CD3 antibody induced activated killer cell，CD3AK細(xì)胞）合用對(duì)肺癌的臨床療效。CD3AK細(xì)胞擴(kuò)增速度快，細(xì)胞毒活性及體內(nèi)抗腫瘤活性均明顯優(yōu)于LAK細(xì)胞，因而比LAK細(xì)胞更適合于腫瘤的過(guò)繼免疫治療。26例經(jīng)病理證實(shí)為非小細(xì)胞肺癌（鱗癌、腺癌），不愿接受化療、放療的患者。14例接受CD3AK細(xì)胞治療（A組）；12例接受CD3AK細(xì)胞治療同時(shí)服用靈芝合劑（B組）。兩組資料均衡性檢驗(yàn)，無(wú)顯著差異，有可比性?；颊咴谥委熐凹爸委?個(gè)月后采用放射免疫分析法測(cè)定癌胚抗原。靈芝合劑以靈芝、黃芪、黨參為主組方，每日1劑，水煎服。CD3AK細(xì)胞/脂質(zhì)體IL-2療法：采患者外周血，分離、培養(yǎng)CD3AK細(xì)胞，然后回輸給患者。同時(shí)肌注脂質(zhì)體IL-2 10 kU·d-1，30 d為1療程。結(jié)果：26例患者經(jīng)治療后，咳嗽、咯痰、咯血、胸悶等癥狀明顯改善。在接受CD3AK細(xì)胞治療的14例患者中，X線顯示的腫塊影像有8例縮小，6例不變。在接受CD3AK細(xì)胞治療同時(shí)服用靈芝合劑的12例患者中，X線顯示的腫塊影像有7例縮小，5例不變，但兩組患者的“復(fù)發(fā)”（指肺癌的癥狀如咳嗽、咯痰、咯血、胸悶等加重；X線顯示腫塊影較前增大；血清癌胚抗原、唾液酸、β2微球蛋白等生化指標(biāo)升高）時(shí)間有所不同，A組為（7.82±3.59）月，而B組為（13.26±5.5）月，差異有顯著意義（P＜ 0.01）。兩組治療前后血清癌胚抗原含量均有顯著差異，但兩組間差異無(wú)顯著意義。兩組病例的中位生存期以B組較長(zhǎng)，為19.38個(gè)月，A組較短，為15.28個(gè)月。B組的平均生存時(shí)間為（23.5±14.39）個(gè)月，A組為（15.75±8.30）個(gè)月，差異有顯著意義（P＜0.05）?？梢?jiàn)靈芝合劑與CD3AK細(xì)胞合用，可增強(qiáng)CD3AK細(xì)胞對(duì)肺癌的臨床療效。

4 結(jié)語(yǔ)

多年來(lái)，學(xué)術(shù)界重視靈芝的抗腫瘤作用及其機(jī)制的研究，除涉及本文提及的免疫學(xué)機(jī)制外，尚與其抑制腫瘤血管新生［66-68，85-87］，抑制腫瘤細(xì)胞移動(dòng)、黏附［88-92］，抑制腫瘤細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥的多藥耐藥性［93-96］有關(guān)。此外，靈芝醇提取物及其所含三萜類在體外對(duì)腫瘤細(xì)胞有直接殺傷作用［97-104］。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果多是在體外培養(yǎng)的細(xì)胞上獲得，尚需在整體動(dòng)物模型上進(jìn)一步研究。

靈芝用作腫瘤放化療的輔助治療藥，發(fā)揮增效減毒作用，特別是減少放化療的不良反應(yīng)，已為許多臨床研究初步證實(shí)。然而，這僅僅是開(kāi)始，尚有許多事情要做，特別是進(jìn)行符合GCP的多中心、大樣本的臨床研究。

與其他中藥的研究相同，靈芝的抗腫瘤藥理研究有兩種思路，一種是從中找出有效成分，最終成為抗腫瘤藥；另一種是中西醫(yī)結(jié)合研究靈芝輔助治療腫瘤的機(jī)制，探討靈芝扶正固本作用的現(xiàn)代內(nèi)涵，進(jìn)一步詮釋中醫(yī)扶正固本治則。后者是我們多年來(lái)走過(guò)的道路，并為實(shí)踐證明是正確的。

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（本文編輯：齊春會(huì)）

Antitumor effect of Ganoderma（Lingzhi）mediated by
immunological mechanism and its clinical application

LIN Zhi-bin
（Department of Pharmacology，School of Basic Medical Sciences，Health Science Center，Peking University，Beijing 100191，China）

The anti-tumor effect of Ganoderma（Lingzhi）is closely related to immunoregulation. Based on our research and other references，this article discussed the antitumor effect of Ganoderma mediated by immunological mechanism，including promoting the function of mononuclear-macrophages，and natural killers，promoting maturation and differentiation of dendritic cells，increasing its antigen presentation，activating lymphocytes and increasing cytotoxicity of cytotoxin T lymphocyte，promoting production of cytokines，inhibiting tumor escape from immune surveillance.Also，clinical studies with immunological indexes were reviewed.

Ganoderma；polysaccharides；tumor；antineoplastic agents，phytogenic；tumor escape；therapeutic uses

LIN Zhi-bin，E-mail：linzb1937@sina.com

R285，R979.1

A

1000-3002（2015）06-0865-18

10.3867/j.issn.1000-3002.2015.06.001

林志彬，E-mail：linzb1937@sina.com

（2015-10-29接受日期：2015-11-06）