鄰苯二甲酸酯暴露的大鼠尿液生物標志物研究

柳春紅,張明明,賴玉婷,褚 玥,李健俊,方敏婷（.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東 廣州 50642；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)廣東省食品質(zhì)量安全重點實驗室,廣東 廣州 50642）

鄰苯二甲酸酯暴露的大鼠尿液生物標志物研究

柳春紅1,2*,張明明1,賴玉婷1,褚 玥1,李健俊1,方敏婷1（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東 廣州 510642；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)廣東省食品質(zhì)量安全重點實驗室,廣東 廣州 510642）

建立了檢測尿液中鄰苯二甲酸酯類化合物（PAEs）共同水解產(chǎn)物鄰苯二甲酸（PA）的分析方法；通過雄性成年SD大鼠代謝試驗,檢測了鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）和鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）單獨暴露、以及聯(lián)合暴露條件下大鼠尿液中PA總量,并分析了PA與暴露總量之間的關(guān)系.結(jié)果顯示,隨著暴露劑量的增大,尿液中排出的PA總量也不斷增大；DBP單獨暴露、DEHP單獨暴露以及兩者聯(lián)合暴露時尿液PAEs代謝物平均排泄總量占攝入量的百分比分別為65.04%、55.00%和38.35%；大鼠尿液中PA的摩爾總量與DBP、DEHP、以及兩者聯(lián)合暴露的摩爾量之間的相關(guān)系數(shù)分別為0.92（P＜0.01）、0.56（P＜0.01）、0.93（P＜0.01）.尿液水解后的PA能夠反映PAEs類物質(zhì)的總暴露水平,將來可能作為一種潛在的暴露生物標志物用于人群的PAEs暴露監(jiān)測.

鄰苯二甲酸酯；單獨暴露；聯(lián)合暴露；生物標志物；鄰苯二甲酸

鄰苯二甲酸酯（PAEs）作為增塑劑廣泛應(yīng)用于塑料材質(zhì)中.環(huán)境和食品包裝材料中的 PAEs可通過消化道、呼吸道和皮膚等途徑進入人體或其他生物體,其主要危害表現(xiàn)為生殖、發(fā)育毒性以及其他毒性,并可通過尿液、乳汁、血液和精液等途徑排出體外［1-5］.進入人體的PAEs通過Ⅰ相反應(yīng)迅速代謝為它們相應(yīng)的單酯（一級代謝產(chǎn)物）,能否進一步代謝為單酯的氧化產(chǎn)物則取決于側(cè)鏈的長短.短鏈的 PAEs主要經(jīng)酯水解為單酯排泄到尿液,長鏈的 PAEs被簡單地水解為單酯后,大部分經(jīng)烷基側(cè)鏈氧化形成單酯的氧化產(chǎn)物（二級代謝產(chǎn)物）.單酯和單酯的氧化產(chǎn)物經(jīng)過Ⅱ相反應(yīng)與葡萄糖醛酸結(jié)合,結(jié)合和未結(jié)合的代謝物大部分都能從尿中排出［6-8］.因此,尿中代謝產(chǎn)物的含量能夠間接反映個體PAEs的攝入量.

生物標志物是指示污染物危害效應(yīng)的生物信號,可衡量環(huán)境污染物的暴露及效應(yīng)的生物反應(yīng)［9-11］.生物標志物包括接觸標志物（或暴露標志物）、效應(yīng)標志物和易感標志物,其中接觸標志物可定量確定個體的暴露水平. 各種生物樣本中,尿液由于取樣方便,被認為是比血液更好的生物標志物來源.如新近研究發(fā)現(xiàn),人群尿液中 1-羥基芘的濃度可以很好的反應(yīng)當?shù)厝巳好媾R的空氣中芘的污染狀況［12］.在PAEs的暴露評估中,一方面由于不同的暴露途徑以及眾多來源的暴露,一般很難估計個體每日 PAEs的攝入量［13］；另一方面,由于環(huán)境中的PAEs無處不在,在分析PAEs含量的過程中也就避免不了樣品的再次污染［14］.為了克服上述不足,近年來,國外有學(xué)者以 PAEs的尿液代謝產(chǎn)物作為暴露標志物進行檢測分析, 如Fromme等［15］研究發(fā)現(xiàn),DEHP各種代謝產(chǎn)物與暴露量之間的相關(guān)系數(shù)在0.69～0.80之間,以二級代謝產(chǎn)物鄰苯二甲酸（2-乙基-5 羥基己基）酯（5OH-MEHP）的相關(guān)系數(shù)最強,一級代謝產(chǎn)物鄰苯二甲酸單（2-乙基己基）酯（MEHP）的相關(guān)系數(shù)最弱；而鄰苯二甲酸（正）二丁酯（DBP或DnBP）、鄰苯二甲酸二異壬酯（DiNP）攝入則分別與其代謝產(chǎn)物鄰苯二甲酸正丁酯（MnBP）無相關(guān)、鄰苯二甲酸異壬酯（MiNP）弱相關(guān).這類研究主要是針對一種 PAEs暴露的代謝物進行檢測,但實際上在環(huán)境與食品中更多見的是多種PAEs同時并存,如果以代謝產(chǎn)物作為標志物進行檢測,則需要對各類PAEs的代謝產(chǎn)物一一檢測才能最終判斷是否有 PAEs的暴露.在這種情況下,迫切需要能夠覆蓋所有 PAEs類化合物的暴露監(jiān)測方法.鑒于此,本文建立并評價了以潛在生物標志物鄰苯二甲酸（PA）為基礎(chǔ)的 PAEs暴露總量的分析方法.由于PAEs尿液代謝產(chǎn)物類型與母體側(cè)鏈長短有關(guān)［16］,因此本研究分別選擇短鏈的 DBP和長鏈DEHP作為代表,將尿中不同類型的PAEs代謝產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)化為PA,建立尿液中PAEs代謝物總量的測定方法；通過檢測分析DBP和DEHP單獨暴露、以及兩者聯(lián)合暴露的大鼠尿液 PA含量與DBP、DEHP暴露量之間的關(guān)系,評價PA作為暴露標志物的可行性,為將來開展大規(guī)模人群暴露提供監(jiān)測工具.

1　材料與方法

1.1實驗動物及分組處理

清潔級成年雄性SD大鼠80只,體重（230± 30）g,由廣東省實驗動物中心提供,合格證號為SCXK（粵）2008-0002.大鼠適應(yīng)性飼喂 1周后按體重隨機分為10組,正常對照組,DBP單獨暴露高、中、低劑量組,DEHP單獨暴露高、中、低劑量組、DBP+DEHP高、中、低劑量組,每組8 只,組間體重?zé)o顯著性差異（P＞0.05）.

采用一次性灌胃方式染毒,染毒前禁食 12h.根據(jù)GB15193.16-2014《國家食品安全標準 毒物動力學(xué)試驗》的規(guī)定,實驗中每個劑量水平應(yīng)使其受試物或受試物的代謝產(chǎn)物足以在排泄物中測出,結(jié)合本項目前期研究,DBP3個組單獨染毒的劑量分別設(shè)置為：300,100,30mg/（kg?bw）；DEHP3個組單獨染毒的劑量分別為 450, 150, 50mg/（kg?bw）；DBP+DEHP3個組聯(lián)合染毒的劑量 分 別 為 ：DBP 300+DEHP450, DBP100+ DEHP150, DBP30+DEHP50mg/（kg?bw）,正常對照組給予等體積的玻璃瓶裝芝麻油.飼養(yǎng)條件控制在濕度 50%～70%及溫度 （21±2）,12h℃光照, 12h黑暗,定量添加足量的飼料,自由飲水和攝食.受試動物于染毒后第4d稱重,斷頸椎處死.

1.2儀器與試劑

Waters2414-2487-1529高效液相色譜儀（美國Waters公司）；HH-SH-4型電熱恒溫水浴鍋（上海悅豐儀器儀表有限公司）；MILLIPORE去離子水機（美國密理博公司）；5417R型冷凍離心機（德國EPPENDORF公司）；SPX-250-BD型號恒溫振蕩培養(yǎng)箱（廣州市宇晨實驗室設(shè)備）；β-葡糖苷酸酶（≥17000U/mL,美國sigma公司）.

1.3尿液樣品的采集及前處理［17］

尿液采集：收集大鼠染毒前尿液及染毒后24,48,72,96h的尿液,于4℃條件下12000r/min離心15min,取上清液分裝,置于-20℃冰箱保存.

尿液代謝物轉(zhuǎn)成PA的處理：取尿液1mL（若已冰凍,則取出凍存尿樣,室溫下解凍,混合均勻）加入15μLβ-葡糖苷酸水解酶,37℃恒溫震蕩12h；酶解后, 12000r/min離心取上清,加入10mL甲醇混勻后,加 15mL濃度為 2mol/L的 NaOH溶液,85℃水浴加熱 8h,期間不斷補充甲醇,最后將甲醇蒸干,取出后冷卻；用1：1硫酸將皂化液酸化, 調(diào) pH值至 1～2,邊加熱邊震蕩,漩渦 2min,靜置20min；加入3倍體積的正己烷萃取,振搖數(shù)分鐘,靜置20min,取正己烷層；加入3倍體積的乙酸乙酯,振搖數(shù)分鐘,靜置 20min,取乙酸乙酯層,剩余液體中再加入3倍體積的乙酸乙酯,2次萃取液,于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中蒸發(fā)至盡干； 2mL甲醇溶解,過0.22μm有機濾膜后進行高效液相色譜分析.

1.4DBP及DEHP代謝物總量測定的色譜條件

XB-C18色譜柱（4.6×250mm,5μm）；流動相：甲醇和磷酸鹽緩沖溶液（25mmol/L,pH=2.5）；流速：1mL/min；紫外吸收波長：230nmm；梯度洗脫：0-5min,甲醇比例由 10%升至 25%,5～20min,甲醇比例由25%升至30%,20～25min,甲醇比例由30%升至 80%,25～30min,甲醇比例由 80%降至10%；柱溫：40；℃進樣量：10μL.

1.5標準曲線的制作

用鄰苯二甲酸標準儲備液配制成PA濃度分別為0.05,1,5,10,25,50,100mg/L的標準溶液.分別吸取 10μL注入高效液相色譜進行分析,以保留時間定性、峰面積定量,制作PA標準物質(zhì)峰面積-質(zhì)量濃度標準曲線.

1.6統(tǒng)計方法

采用EXCEL數(shù)據(jù)庫錄入數(shù)據(jù),用SPSS（13.0版本）統(tǒng)計軟件進行實驗數(shù)據(jù)的處理和分析,數(shù)據(jù)統(tǒng)計描述以平均值±SD形式表示, 采用單因素方差分析（one-way ANOVA）,LSD進行多重比較,P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

2　結(jié)果與討論

2.1標準品和尿液樣本的色譜分離圖

由圖1可見,鄰苯二甲酸的保留時間7.7min左右,峰型穩(wěn)定,基線平穩(wěn),無雜質(zhì)干擾峰,分離效果良好,9min內(nèi)即可完成測定.

2.2標準曲線和檢出限

鄰苯二甲酸標準物質(zhì)峰面積-質(zhì)量濃度標準曲線如圖 2所示,線性回歸方程為：Y=63331X +47465,R2=0.9995,線性范圍 0.05～100mg/L,最低檢測限（S/N=3）為0.02μg/mL.依據(jù)圖2峰面積及線性回歸方程，推算圖2中PA濃度為3.13μg/mL.

圖1　標準品及尿液中鄰苯二甲酸的高效液相色譜圖Fig.4　High Performance Liquid chromatogram of phthalic acid standard and phthalic acid in urine

2.3大鼠尿液中PAEs代謝動力學(xué)

由表1可見,不論是DBP、DEHP單獨暴露,還是DBP和DEHP聯(lián)合暴露,隨著大鼠暴露劑量的增加,尿液中 PA總摩爾濃度也隨之增加.本次實驗中灌胃前尿液中也有 PA檢出,但各組間含量無顯著性差異,推測其來源可能與塑料代謝籠飼養(yǎng)有關(guān).由于PAEs的污染普遍存在,提示今后試驗應(yīng)采用全不銹鋼代謝籠,盡力避免實驗過程中的一切可能污染.

通過計算大鼠每日尿液中PAEs代謝物總摩爾量與實際攝入DBP或/和DEHP摩爾總量的比值,得到DBP或/和DEHP排泄率,見表2.由表2可知,DBP、DEHP單獨染毒以及DBP和DEHP聯(lián)合染毒各劑量組的大鼠尿液中PAEs代謝物排泄率呈現(xiàn)相同的趨勢：即隨著時間的延長,PAEs尿液中的排泄率逐漸降低,且大部分 PAEs代謝物在 24h隨尿液排出體外,48h尿液中有少部分排出,而72h以及96h尿液中PAEs代謝物排泄率極低；同時,隨著染毒劑量的增加,代謝量增加,但是尿中PAEs排泄率逐漸降低.

圖2　鄰苯二甲酸標準曲線Fig.4　Standard curve of phthalic acid for quantification

排泄是外來化合物及代謝產(chǎn)物向機體外轉(zhuǎn)運的過程,是物質(zhì)代謝在機體全過程中的最后一個環(huán)節(jié),排泄的方式有很多種,但主要途徑是通過腎臟隨尿液排出和經(jīng)過肝臟隨同膽汁并混入糞便中排出.以前研究表明,DBP進入后可迅速被小腸的酯酶水解為單丁基鄰苯二甲酸鹽（MBP）,24h內(nèi)約55%經(jīng)尿液排出、29%經(jīng)糞便排出,沒有蓄積性［18］,其半衰期小于24h.Akira等［19］研究發(fā)現(xiàn),大鼠經(jīng)口攝入的DBP,48h后90%隨尿液排出體外,糞便中的含量較少,可認為體內(nèi)沒有蓄積性.本文DBP單獨暴露結(jié)果顯示,尿液中3個劑量組的平均排泄總量為攝入量的 65.04%,其中在灌胃 24h內(nèi)代謝最快,占攝入量的的57.49%,占4d平均累計代謝量的88.39%,與上述研究成果一致,說明尿液是 DBP排泄的主要途徑.口服 DEHP24h后,約67%的DEHP代謝至尿液中,說明DEHP的半衰期也小于 24h；一項雄性獼猴的灌胃試驗中,分別用100,500mg 14C-DEHP/kg2個劑量灌胃（每個劑量2只動物）,結(jié)果顯示,24h大部分代謝物都排泄出去了,96h后僅有0.2%潴留在組織中,低劑量動物尿液排泄率分別為20%、55%,高劑量動物排泄率為4% 和13%［20］.本實驗DEHP單獨染毒時,尿液中平均排泄總量為攝入量的55.00%,其中24h的代謝量占44.84%,占4d平均累計代謝量的81.53%,說明DEHP在體內(nèi)被迅速吸收、代謝和排泄；同時隨著染毒劑量的增加,排泄率逐漸降低,與上述獼猴實驗結(jié)果一致.關(guān)于DBP和DEHP聯(lián)合染毒時的排泄情況缺乏相關(guān)的報道研究.本實驗兩者聯(lián)合染毒時,尿液中平均排泄率為38.35%,其中24h排泄率為30.77%,占4d平均累計排泄量的80.23%,說明當DBP與DEHP聯(lián)合暴露時,尿液中平均排泄率及 24h排泄率比單獨染毒時降低,其中與DBP比降低幅度更大.

表1　DBP、DEHP單獨及聯(lián)合暴露組大鼠尿液中PA摩爾濃度（μmol/mL）Table 1　The molar concentration of the urine PA for DBP、DEHP and combined exposure （μmol/mL）

表2　不同時間各劑量組大鼠尿液中PAEs排泄率（%）Table 1　Excretion rates of PAEs in rat urine for different dose groups （%）

2.4尿液中PA濃度與PAEs暴露量的關(guān)系

為分析尿液中 PAEs排泄率與攝入量的劑量關(guān)系,以尿液處理后鄰苯二甲酸PA的量（摩爾數(shù)）為X軸,PAEs攝入量（摩爾數(shù)）為Y軸,采用逐步回歸分析擬合線性回歸方程,結(jié)果如表3.相關(guān)分析中,相關(guān)系數(shù) r＜0.4為低度相關(guān),0.4＜r＜0.7為中度相關(guān), r＞0.7為高度相關(guān)［21］.因此,從相關(guān)系數(shù)大小來看,尿液中鄰苯二甲酸的摩爾總量與DBP單獨暴露、以及兩者聯(lián)合暴露的摩爾量之間均呈強相關(guān)，與DEHP單獨暴露的摩爾量之間則為中等相關(guān).

表3　大鼠尿液PA濃度與PAEs攝入量之間的相關(guān)性Table 1　The correlation of PAEs intake with phthalic acid in rat urine

3　結(jié)語

DBP、DEHP單獨暴露以及DBP+DEHP聯(lián)合暴露的大鼠實驗結(jié)果表明,隨著暴露劑量的增大,尿液中排出的代謝物水解物 PA總量也不斷增大；回歸分析結(jié)果顯示,大鼠尿液中PA的摩爾總量與DBP、DEHP、以及兩者聯(lián)合暴露的摩爾量之間均具有良好的相關(guān)性,相關(guān)系數(shù)分別為0.92（P＜0.01）,0.56（P＜0.01）,0.93（P＜0.01）.本研究所確定以尿液水解后的PA作為PAEs暴露的生物標志物,可很好地反映鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)的外暴露水平,即尿液鄰苯二甲酸將來可能作為一種潛在的生物標志物用于人群的PAEs暴露監(jiān)測或暴露評估研究.根據(jù)國內(nèi)外一般人群尿液代謝產(chǎn)物檢測水平數(shù)據(jù),本項目代謝產(chǎn)物水解物 PA檢測限可以滿足人群尿樣的含量分析,但仍需要繼續(xù)提高方法的敏感性.

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Urine biomarker of exposure to phthalate in rat.

LIU Chun-hong1,2*, ZHANG Ming-ming1, LAI Yu-ting1, CHU Yue1, LI Jian-jun1, FANG Min-ting1（1.College of Food Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China；2.The Key Laboratory of Food Quality and Safety of Guangdong Province, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China）.

China Environmental Science, 2015,35（9）：2868～2873

A high performance liquid chromatographic （HPLC） method was developed for the determination of phthalic acid （PA） in urine after alkaline hydrolysis of the phthalate metabolites to PA. The content of the total PA in male adult SD rat urine was measured after separated or combined exposure to dibutyl phthalate （DBP） and di 2-ethyl hexyl phthalate （DEHP）, and then the relationships between exposed PAEs molar quantities and the molar concentration of the urine PA were analyzed by linear regression. The results showed that the total amount of urine PA increased as the exposure increased. The mean percentage of PAEs intake excreted in the urine was found to be 65.04% for DBP exposure alone and 55.00% for DEHP exposure alone and 38.35% for combined exposure to the two. The contents of urinary PA were well correlated with PAEs exposure levels with the correlation coefficient being 0.92 for DBP（P＜0.01）, 0.56 for DEHP （P＜0.01） and 0.93 for combined DPB and DEHP （P＜0.01）. The findings suggested that PA in urine after alkaline hydrolysis of the phthalate metabolites could evaluate the total exposure level of PAEs, which may be a valid exposure biomarker of PAEs used in risk surveillance of human exposure to PAEs in future.

phthalate；separated exposure；combined exposure；biomarker；phthalic acid

X503.22

A

1000-6923（2015）09-2868-06

2015-02-12

廣東省科技計劃項目（2012B090600005）；農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估專項（GJFP2014011）

*責(zé)任作者, 教授, liuch@scau.edu.cn

柳春紅（1968-）,女,湖北武漢人,教授,博士,主要從事營養(yǎng)及食品安全研究.發(fā)表論文60余篇.