延胡索藥材及飲片的UPLC質(zhì)量控制方法*

羅琛艷，李　浩，肖　洋，段金芳，劉　影，竇志英

延胡索藥材及飲片的UPLC質(zhì)量控制方法*

羅琛艷，李浩，肖洋，段金芳，劉影，竇志英

（天津中醫(yī)藥大學，天津300193）

［目的］檢測延胡索藥材及飲片中有效成分的含量，建立延胡索藥材和飲片的超高液相色譜法（UPLC）質(zhì)量控制方法。［方法］采用UPLC檢測方法，ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），乙腈（B）-0.1%甲酸水溶液，調(diào)pH值至5.0（A），流速：0.3 mL/min，柱溫：45℃，進樣量：5 μL；梯度洗脫。以延胡索乙素和去氫紫堇堿的含量為指標對延胡索的水提液進行檢測。［結(jié)果］樣品中延胡索乙素的含量在0.229 1～0.775 5 mg/g之間，去氫紫堇堿的含量在0.781 0～2.931 0 mg/g之間，不同樣品延胡索乙素和去氫紫堇堿的含量差異很大。［結(jié)論］UPLC法的靈敏度更高、檢測速度更快，適用于組分多、成分復雜的中藥材的分析及質(zhì)量的評價。

延胡索；UPLC；延胡索乙素；去氫紫堇堿

延胡索為罌粟科植物延胡索（Corydalis yanhusuo W.T.Wang）的干燥塊莖［1］。能“行氣中血滯，血中氣滯，專治一身上下諸痛”，止痛效果明顯且無成癮性［2］，應用廣泛。延胡索主要的藥效成分為生物堿，已經(jīng)鑒定近40個生物堿，其中延胡索乙素的止痛效果最佳［3-5］，去氫紫堇堿對心血管系統(tǒng)作用明顯［6-8］，但生物堿的檢測、定量較復雜且耗時。超高液相色譜（UPLC）法分析法精度高［9］，目前已廣泛應用于代謝組學、藥物分析、環(huán)境、食品以及化妝品［10-16］等，在中藥分析方面運用逐漸增多。延胡索的UPLC檢測方法較少，實驗建立延胡索藥材、飲片中延胡索乙素和去氫紫堇堿的UPLC快速定量法，為延胡索的質(zhì)控、制劑、代謝組學以及復方研究等奠定基礎(chǔ)。

1　儀器、試藥和樣品

UPLC超高效液相色譜儀（Waters公司），醋（天津市天立獨流老醋股份有限公司），甲醇（色譜純/天津市化學試劑批發(fā)公司），甲酸（色譜純/天津市化學試劑批發(fā)公司），氨水（分析純/天津市化學試劑批發(fā)公司），乙腈（Sigma公司），水（杭州娃哈哈集團有限公司）；延胡索乙素（中國藥品生物制品檢定所，批號110726-201011），去氫紫堇堿（Zhongxin Innova Laboratories，CAS：30045-16-0）。

2　樣品信息

樣品信息見表1。

3　實驗方法

3.1色譜條件Waters公司ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）。檢測波長：280 nm。流動相：乙腈（B）-0.1%甲酸水溶液，氨水調(diào)pH值至5.0（A）。流速：0.3 mL/min。柱溫：45℃。進樣量：5 μL。梯度洗脫：0～9 min，15%～29%B；9～15 min，29%～40%B；15～16 min，40%～50%B；16～16.1 min，50%～15%B。見圖1、圖2。

3.2標準品溶液的制備精密稱取延胡索乙素和去氫紫堇堿標準品1.40、1.66 mg，分別加甲醇溶解定容至10 mL容量瓶中，得到濃度分別為0.140、0.166 g/L的標準品溶液。

量取上述延胡索乙素標準溶液1 mL，去氫紫堇堿標準溶液2 mL，加甲醇定容至10 mL容量瓶中，配成濃度分別為0.014 0、0.033 2 g/L的混標溶液。

3.3樣品溶液的制備精密稱取10 g飲片，8倍量水，浸泡40 min，一次回流提取45 min，過濾，濾渣加6倍量水，回流提取30 min，過濾，合并濾液，濃縮，移至100 mL容量瓶中，加水定容。精密移取300 μL樣品，加入3倍甲醇混勻，離心（10000r/min，10min），取上清液過0.22 μm微孔濾膜，備用。

3.4方法學

3.4.1線性關(guān)系考察分別精密移取延胡索乙素、去氫紫堇堿儲備液適量，用甲醇稀釋一系列濃度的對照品溶液，延胡索乙素的濃度分別為28.0、24.5、21.0、17.5、14.0、10.5、7.0、3.5 mg/L，去氫紫堇堿的濃度分別為66.4、58.1、49.8、41.5、33.2、24.9、16.6、8.3μg/mL，進樣量為5 μL，測定峰面積。以峰面積為縱坐標（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標（X），繪制標準曲線，延胡索乙素的回歸方程為=15 742X+2 455，相關(guān)系數(shù)r= 0.999 6，線性范圍在0.017 5～0.140 0 μg；去氫紫堇堿的回歸方程為=28 506X+16 093，相關(guān)系數(shù)r= 0.999 1，線性范圍0.041 5～0.332 0 μg。

表1　樣品信息

圖1　標準品色譜圖（a：去氫紫堇堿；b：延胡索乙素）

圖2　延胡索樣品圖

3.4.2精密度實驗吸取延胡索乙素和去氫紫堇堿混標溶液，在色譜條件“3.1”下，連續(xù)進樣6針，記錄峰面積，計算RSD%分別為：0.51%、0.34%，表明儀器精密度良好。

3.4.3穩(wěn)定性實驗精密稱取藥材，按“3.3”項提取處理方法，按“3.1”色譜條件在0、2、4、8、12、24 h分別進樣，記錄峰面積，計算RSD分別為：0.61%、0.67%，表明樣品中延胡索乙素和去氫紫堇堿在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.4.4重現(xiàn)性實驗精密稱取同1個樣品6份，按“3.3”提取處理方法，在“3.1”色譜條件下測定峰面積，計算各對照品的質(zhì)量分數(shù)，結(jié)果延胡索乙素的RSD為：2.44%，去氫紫堇堿的RSD為：2.94%，表明重現(xiàn)性良好。

3.4.5加樣回收實驗精密稱定已測知含量的飲片約5.0 g，加入延胡索乙素和去氫紫堇堿標準品，相當于生藥藥材中延胡索乙素的100%、去氫紫堇堿的100%，按“3.3”項下操作制備供試品溶液，在“3.1”色譜條件下分析。見表2。

表2　加樣回收率實驗

4　溶出量測定結(jié)果

根據(jù)“3.3”項下方法制備樣品，用“3.1”項色譜條件進行含量測定，以延胡索乙素（權(quán)重60%），去氫紫堇堿（權(quán)重40%）的加權(quán)含量（mg/g）為指標，具體結(jié)果見表3。

表3　延胡索乙素、去氫紫堇堿的含量及加權(quán)得分mg/g

表3　延胡索乙素、去氫紫堇堿的含量及加權(quán)得分mg/g

序號　延胡索乙素　去氫紫堇堿　加權(quán)總含量1　0.461 3±0.012 5　1.519 2±0.034 8　0.884 5 2　0.379 6±0.014 5　0.966 0±0.080 1　0.614 2 3　0.316 3±0.018 0　0.781 0±0.067 0　0.502 2 4　0.681 7±0.004 3　1.311 6±0.009 2　0.933 7 5　0.775 5±0.021 5　1.442 3±0.008 4　1.042 2 6　0.605 2±0.014 5　2.670 8±0.160 9　1.431 4 7　0.289 7±0.014 3　2.687 1±0.175 5　1.248 7 8　0.287 5±0.016 4　2.769 3±0.171 5　1.280 2 9　0.414 4±0.031 0　1.501 1±0.101 7　0.849 1 10　0.229 1±0.003 6　2.419 9±0.138 5　1.105 4 11　0.428 7±0.045 8　1.880 0±0.066 1　1.009 2 12　0.632 9±0.016 8　2.729 9±0.077 8　1.471 7 13　0.323 0±0.025 2　2.931 0±0.223 0　1.366 2 14　0.609 0±0.035 0　1.289 6±0.052 1　0.881 2 15　0.699 2±0.016 7　2.099 2±0.021 7　1.259 2 16　0.518 8±0.043 9　2.972 1±0.198 6　1.500 1 17　0.632 5±0.005 9　2.538 1±0.046 4　1.394 7 18　0.527 9±0.030 7　2.570 1±0.150 6　1.344 8 19　0.476 7±0.023 2　1.591 5±0.091 2　0.922 6 20　0.381 9±0.009 7　1.810 0±0.104 0　0.953 1

延胡索乙素的含量在0.229 1～0.775 5 mg/g之間，去氫紫堇堿的含量在0.781 0～2.931 0 mg/g之間，延胡索乙素和去氫紫堇堿加權(quán)后的溶出量在0.502 2～1.471 7 mg/g之間。

5　討論

UPLC法是在高效液相色譜法（HPLC）系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，提高色譜柱效能達到的高分析精度。文獻報道［17-18］HPLC法檢測延胡索成分，達到色譜峰分離度良好，分析時間需40～70 min。本實驗檢測延胡索的分析時間只需13 min，檢測出10個色譜峰，延胡素乙素和去氫紫堇堿的保留時間為8.06 min和6.78 min。UPLC比HPLC更快速、簡便、靈敏、有機試劑用量少［19-20］。在實驗過程中，多次出現(xiàn)系統(tǒng)堵塞現(xiàn)象，對進入UPLC系統(tǒng)的樣品水提液都需流動相沉淀除雜。

由實驗結(jié)果可知，延胡索樣品中延胡索乙素最低含量為0.229 1 mg/g，最高為0.775 5 mg/g；去氫紫堇堿的含量最低為0.7810mg/g，最高為2.9310mg/g；含量差異顯著。2010版藥典中以濃氨水-甲醇（1∶20）的混合液為提取溶劑，對延胡索中延胡索乙素的含量有限定；臨床湯方應用多以水為溶劑，建議規(guī)定水提液中延胡索乙素及其它生物堿含量的最低限度。

本方法不僅可以用于延胡索藥材和飲片中有效成分的檢測，同時在已發(fā)表文章［21］用于復方金鈴子散、元胡止痛片和延胡索湯中延胡索有效成分的含量測定，建立了延胡索藥材、飲片和復方的UPLC快速評價方法。

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The UPLC quality control method of Corydalis Rhizamo herbs and herbal pieces

LUO Chen-yan，LI Hao，XIAO Yang，DUAN Jin-fang，LIU Ying，DOU Zhi-ying
（Tianjin University of Traditional Chinese medicine，Tianjin 300193，China）

［Objectiye］To develop a UPLC quality control method of Corydalis Rhizamo herbs and herbal pieces by determining the contents of active components.［Methods］The separation was performed on an ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）column in the UPLC method.The mobile phases consisted of acetonitrile（B）and 0.1%formic acid aqueous solution（A，pH=5.0）with gradient elution.The flow rate and column temperature were set at 0.3 mL/min and 45℃，respectively.The injection volume was 5 μL.The contents of tetrahydropalmatine and dehydrocorydaline were taken as indexes for the water extract of corydalis rhizoma.［Results］The content of tetrahydropalmatine was in the range of 0.229 1～0.775 5 mg/g and that of dehydrocorydaline was 0.781 0～2.931 0 mg/g. The contents of tetrahydropalmatine and dehydrocorydaline varied greatly in different samples of Corydalis Rhizamo.［Conclusion］Tetrahydropalmatine and dehydrocorydaline were stable in the water extract，which could be used as the index components for the quality control of Corydalis Rhizamo.The UPLC method was fast，efficient and of higher sensitivity.It was suitable for the rapid detection of active components and the quality evaluation of traditional Chinese medicines.

Corydalis Rhazamo；UPLC；tetrahydropalmatine；dehydrocorydaline

R284

A

1673-9043（2015）06-0357-04

10.11656/j.issn.1673-9043.2015.12.11

2011年中醫(yī)藥行業(yè)科研專項（20110700709）。

羅琛艷（1989-），女，碩士研究生，研究方向為中藥成分研究和質(zhì)量控制。

竇志英，E-mail：zhiyingdou@163.com。

（2015-07-14）