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    Vaspin對HUVECs中TNF-α介導(dǎo)的NF-κB和PI3K/Akt信號(hào)通路的影響

    2015-08-28 09:39:16劉師偉王明明樓曉華董艷婷趙術(shù)君何玉潔
    關(guān)鍵詞:性反應(yīng)抵抗磷酸化

    劉師偉,王明明,王 軍,樓曉華,董艷婷,張 麗,趙術(shù)君,何玉潔

    (1.山西醫(yī)科大學(xué)附屬大醫(yī)院內(nèi)分泌科,山西太原030032;2.山西醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院,山西太原030001;3.休斯敦Methodist代謝研究中心,休斯敦德克薩斯州美國77030;4.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院婦產(chǎn)科,山西太原030001)

    胰島素抵抗是一個(gè)慢性亞臨床炎性反應(yīng)過程,二者相互促動(dòng),引起機(jī)體內(nèi)環(huán)境的改變[1-2]。炎性反應(yīng)過程中分泌的大量炎性因子可干擾胰島素的生理作用,影響機(jī)體的能量攝入、存儲(chǔ)和代謝,促進(jìn)胰島素抵抗的發(fā)生。Vaspin是從OLETF大鼠內(nèi)臟脂肪組織中分離出來的一種具有胰島素增敏和抗感染效應(yīng)的脂肪細(xì)胞因子。用Vaspin干預(yù)高糖及高脂誘導(dǎo)的肥胖ICR小鼠后,胰島素抵抗改善,增加糖耐量,并且與胰島素抵抗相關(guān)的基因(如瘦素、抵抗素和 TNF-α 等)表達(dá)下降[3]。

    本研究探討Vaspin對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)TNF-α介導(dǎo)的NF-κB和PI3K/Akt信號(hào)通路的影響,及在血管內(nèi)皮細(xì)胞中Vaspin作用于與肥胖相關(guān)的炎性反應(yīng)及胰島素抵抗的機(jī)制。

    1 材料與方法:

    1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料

    重組人Vaspin(Leinco Technologies公司);重組人TNF-α(Biovision公司);NF-κB熒光酶報(bào)告質(zhì)粒pGL4.32[luc2P/NF-κB-RE/Hygro](Promega 公司);羊抗人ICAM-1一抗、羊抗人VCAM-1一抗、鼠抗人Akt一抗、鼠抗人磷酸化Akt一抗、IL-1和IL-6 ELISA試劑盒(R&D Systems公司);鼠抗人MCP-1一抗(Gen Scipt公司);鼠抗人β-actin一抗(Sigma公司);HRP標(biāo)記的鼠抗羊二抗和羊抗鼠二抗(Santa Cruz公司);Trizol試劑(Invitrogen公司);SYBR Green Master Mix反應(yīng)試劑盒(Applied Biosystems公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 原代HUVECs的培養(yǎng):HUVECs取自新生兒臍帶。用0.1% Ⅰ型膠原蛋白酶溶液分離內(nèi)皮細(xì)胞,將分離好的內(nèi)皮細(xì)胞接種到鋪有明膠的25 cm2培養(yǎng)瓶中,加入含20%胎牛血清、ECGS、肝素、1×105U/L青霉素-100 mg/L鏈霉素的M199培養(yǎng)液,置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞匯合80%以上時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

    1.2.2 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和NF-κB熒光酶活力的測定:將2.5×105/mL的70% ~80%匯合的HUVECs接種于直徑 6 cm的培養(yǎng)皿,用 1.5 μL lipofectamine 2000、0.6 μg NF-κB 熒光酶報(bào)告質(zhì)粒 pNF-κB-Luc和0.5 μg β-gal質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染,在37 ℃,5%CO2培養(yǎng)箱中保溫6 h。作用6 h之后,更換含有血清的正常完全培養(yǎng)基,置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中,24 h后用不同濃度(0~320 μg/L)Vaspin干預(yù)8 h,然后用10 μg/L TNF-α繼續(xù)培養(yǎng)4 h。最后用熒光素酶發(fā)光儀測定系統(tǒng)測定NF-κB熒光素酶活力。

    1.2.3 Western blot分析:用0~320 μg/L Vaspin 預(yù)培養(yǎng)HUVEC 8 h,接著用10 μg/L TNF-α作用4 h后,采用Western blot檢測磷酸化的Akt以及ICAM-1、VCAM-1和MCP-1蛋白的表達(dá)水平。取細(xì)胞加蛋白提取液,加樣品電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉和加相應(yīng)一抗孵育,4℃過夜,再用HRP標(biāo)記的二抗孵育1 h。用含0.05%Tween的PBS緩沖液漂洗膜3次,ECL化學(xué)發(fā)光后用Western blot檢測系統(tǒng)檢測。數(shù)據(jù)用Gel-Pro分析軟件進(jìn)行分析。

    1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR:用0~320 μg/L Vaspin培養(yǎng)HUVECs 8 h 后,再加入10 μg/L TNF-α 繼續(xù)培養(yǎng)4 h,用 real-time PCR檢測下游分子 ICAM-1、VCAM-1及MCP-1的mRNA的表達(dá)水平。用Trizol試劑按說明書提取HUVECs的總RNA。采用SuperScript First-Strand Synthesis System 將各5 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。實(shí)驗(yàn)使用SYBR Green Master Mix反應(yīng)試劑,反應(yīng)在ABI 7500 real-time PCR系統(tǒng)完成。PCR總反應(yīng)條件為:50℃ 2 min,95℃ 10 min,95 ℃ 15 s,60℃ 30 s,72℃ 30 s,循環(huán)40次,72℃10 min。延伸階段檢測熒光。數(shù)據(jù)由 ABI Prism 7000 SDS軟件分析。引物序列見表1。

    表1 Real-time PCR引物序列Table 1 Primer sequences for real-time PCR

    1.2.5 酶聯(lián)免疫分析(ELISA):用0~320 μg/L Vaspin 預(yù)培養(yǎng) HUVECs 8 h,再用10 μg/L TNF-α 作用4 h后,用ELISA試劑盒檢測經(jīng)Vaspin和TNF-α處理后的HUVECs上清液中NF-κB下游炎性因子IL-1和IL-6的表達(dá)水平。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示,組間比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)。

    2 結(jié)果

    2.1 Vaspin對 TNF-α作用下HUVECs中 Akt磷酸化的影響

    與對照組相比,Vaspin干預(yù)組中磷酸化的Akt水平呈劑量依賴性增加(P<0.05)(圖1)。

    2.2 Vaspin對 TNF-α作用下 HUVECs中 NF-κB熒光酶活力的影響

    與對照組相比,Vaspin干預(yù)組中NF-κB熒光酶活力呈劑量依賴性被抑制(P<0.05)(圖2)。

    2.3 Vaspin對TNF-α作用下HUVECs上清液中炎性因子IL-1和IL-6表達(dá)的影響

    與對照組相比,Vaspin干預(yù)組中IL-1和IL-6的表達(dá)呈劑量依賴性下降(P<0.05)(圖3)。

    圖1 在HUVECs中Vaspin對TNF-α介導(dǎo)的Akt磷酸化的影響Fig 1 Effects of Vaspin on TNF-α-induced phosphorylation of Akt in HUVECs ± s,n=3)

    圖2 在HUVECs中Vaspin對TNF-α介導(dǎo)的NF-κB熒光酶活力的影響Fig 2 Effects of Vaspin on TNF-α-induced NF-κB activity in HUVECs± s,n=3)

    2.4 Vaspin對TNF-α作用下HUVECs中ICAM-1、VCAM-1和MCP-1表達(dá)的影響

    與對照組相比,Vaspin干預(yù)組中 ICAM-1、VCAM-1和MCP-1的mRNA和蛋白表達(dá)呈劑量依賴性被抑制(P<0.05)(圖4,5)。

    3 討論

    圖3 在HUVECs中Vaspin對TNF-α介導(dǎo)的炎性因子表達(dá)的影響Fig 3 Effects of Vaspin on TNF-α-induced expression of inflammatory cytokines in HUVECs± s,n=3)

    圖4 在HUVECs中Vaspin對TNF-α介導(dǎo)的ICAM-1、VCAM-1和MCP-1基因表達(dá)的影響Fig 4 Effects of Vaspin on TNF-α-induced mRNA expressions of NF-kB downstream molecules ICAM-1,VCAM-1 and MCP-1 in HUVECs s,n=3)

    炎性反應(yīng)通過胰島素受體影響信號(hào)傳導(dǎo)通路IRS-1-PI3K-PKB/Akt是導(dǎo)致胰島素抵抗的主要分子機(jī)制。作為一種新的脂肪細(xì)胞因子,Vaspin具有胰島素增敏和抗感染效應(yīng)[3-6]。本研究用Vaspin干預(yù)HUVECs后,磷酸化的Akt水平增加,表明Vaspin可使血管內(nèi)皮細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)作用增強(qiáng),可能進(jìn)一步作用于胰島素信號(hào)通路的下游分子,改善胰島抵抗,保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞。但有報(bào)道Vaspin在大鼠血管平滑肌細(xì)胞可以抑制高糖誘導(dǎo)的PI3K/Akt信號(hào)通路[4]。這雖與本結(jié)果有差異,但都表明Vaspin可作用于PI3K/Akt信號(hào)通路,對血管平滑肌細(xì)胞或血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。

    圖5 在HUVECs中Vaspin對TNF-α介導(dǎo)的ICAM-1、VCAM-1和MCP-1蛋白表達(dá)的影響Fig 5 Effects of Vaspin on TNF-α-induced protein levels of NF-kB downstream molecules ICAM-1,VCAM-1 and MCP-1 in HUVECs(x ±s,n=3)

    本文運(yùn)用高敏感和高特異的NF-κB熒光酶報(bào)告系統(tǒng),研究Vaspin對HUVECs中NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的影響。顯示Vaspin可明顯抑制HUVECs由TNF-α介導(dǎo)的NF-κB轉(zhuǎn)錄活性,并減輕炎性反應(yīng)。還有報(bào)道用 TNF-α處理 HUVECs 30 min后,Vaspin對NF-κB磷酸化作用不明顯[7]。本研究用 Vaspin作用于HUVECs 8 h可明顯抑制NF-κB磷酸化。

    血管內(nèi)皮細(xì)胞通過調(diào)節(jié)炎性因子、黏附分子及趨化因子的表達(dá)來影響血管的功能[8]。NF-κB的激活促進(jìn)炎性因子TNF-α、IL-1和IL-6的釋放以及使血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)黏附分子ICAM-1和VCAM-1及趨化因子 MCP-1的表達(dá)增加,進(jìn)而加重血管損傷[9-10]。本研究中,Vaspin 顯著抑制 HUVECs中TNF-α介導(dǎo)的 NF-κB的活化及其下游分子 IL-1、IL-6、ICAM-1、VCAM-1及 MCP-1的表達(dá)。提示Vaspin可影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的炎性因子、黏附分子及趨化因子的表達(dá),保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞,進(jìn)一步阻止與肥胖和胰島素抵抗相關(guān)的心血管疾病的發(fā)生。

    PI3K/Akt信號(hào)在調(diào)節(jié)NF-κB的激活存在爭議。通過激活PI3K/Akt信號(hào)的傳導(dǎo),抑制NF-κB信號(hào)的傳導(dǎo),可以抑制炎性反應(yīng)[11-12]。也有報(bào)道抑制PI3K/Akt與NF-κB信號(hào)通路的傳導(dǎo),同樣可發(fā)揮抗炎效應(yīng)[13]。本研究中PI3K/Akt信號(hào)通路的激活可能與NF-κB信號(hào)通路的抑制存在直接或間接的關(guān)系,對此尚需進(jìn)一步研究。

    總之,Vaspin可作用于 HUVECs中 NF-κB和PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路,保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞。這對闡明Vaspin與NF-κB和PI3K/Akt信號(hào)通路在肥胖和胰島素抵抗中的機(jī)制具有重要意義。

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